BARON

Formiamide. . . 0 9,6 0,2340 15,40 6,58 89 Acétamide . . . 10,53 4,4 0,1107 6.25 5,68 103 Propionamide . . 11,69 4,0 0,136: 6,75 1.95 97 Butyramide. . 10,35 4,2 0,134 6,50 Cor 9% Les rendements en levure sont faibles, ce qui est dà en partie sans doute à une aération insuflisante, la couche de liquide ayant au moins 2 centimètres d'épaisseur dans les ballons employés. Les résultats n'en sont pas moins comparables et permettent de conelure que la propionamide et la butyramide ne sont pas de meilleurs aliments azotés que l'acétamide. La formiamide semble posséder une action spéciale : mais ne faut-il pas l'attribuer, soit à sa très facile décomposition en ammoniaque, soit à ce que le produit employé était déjà un mélange d'aide avee un peu d'ammoniaque, l'action excitatrice de :ernière intervenant alors?

Ce q ajouter, c'est que dans les cultures obtenues avec ces es amides, il se fait de l'acide formique, comme

en présence d'acétamide.

Recherche de la diastase hydrolysant les amides

Nous sommes maintenant en possession d'un certain nembre de faits à l'aide desquels nous pouvons essayer d'interpréter le phénomène de Futilisation des amides par la levure.

La première hypothèse qui se présente à l'esprit est celle

d'une simple hydratation destinée à fournir de l'ammoniaque.

L'hydrolyse diastasique des amides, de Purée en particulier, est un phénomène fréquent chez les végétaux : elle peut être provoquée par les cellules de nombreuses graines, entre autres celles des Papilionacées, comme l'a montré G. ZemPLé\ (D): par

(Hi G, ZemeLéx, Zeits. physiol. Chemie, |. 79, p. 229 (1912).

des champignons inférieurs, tels que L'Asperqgillus niger, d'après Ssiata (1); enfin, par de nombreuses espèces bactériennes. Il suflit de rappeler que la fermentation ammoniacale de l'urée par le Micrococeus urei à été d'abord étudiée par Van Tie- GHEM (255 Miquez à isolé un grand nombre de microorganismes fermentant l'urée et montré que l'hydrolyse est due à la présence d'une diastase, l'uréase (3).

On puvait done supposer que la levure ne se comporte pas autremeut et que, cultivée en présence d'urée, elle fournit aussi de l'uréase.

Pour vérilier cette hypothèse, je me suis servi de cultures faites en présence d'urée, qui ont été filtréss après des temps variables, additionntes d'une quantité d'urée correspondant à 20,0 environ, et filtrées ensuite à la bougie. Ces solutions. abandonnées pendant plusieurs heures à Fétuve à 50°, n'ont jamais montré une trace d'ammoniaque.

Comme les milieux de culture sont toujours un peu acides, etque Puréase est très sensible à l'acidité, on peut craindre

que la diastase ne soit détruite dans le liqu' le dans ces condi-

lions. J'ai alors fait des cultures dans le milieu à urée. en présence de carbonate de caleïim en léger excès, en agitant assez fréquemment, de manière à saturer les acides produits par la levure et à maintenir la neutralité. Le résultat a été le même.

I faut done en conclure que, si la levure séerète de F'uréase, cette diastase ne diffuse pas dans Le milieu. Ce résultat était d'ailleurs à prévoir, puisque les cultures faites en présence durée, mème tres âgées, contiennent toujours un excès d'urée efne montrent pas la présence d'ammoniaque.

On pouvait espérer que la levure tuée par un antiseptique laisserait diffuser la diastase si celle-ci est présente dans les cellules. Atin de le vérifier, j'ai pris deux ballons Fenxsacn

contenant du milieu minéral glucosé et je les ai stérilisés par

(1) Suirara, Beitr. 5. chem. Physiol. u. Patñot., L 5. p. 384 (1904.

(2) Vax lieGnem. Thèse, Paris 1862.

(3) Miouer, €, À, Acad. Sciences, L. AA, p 9397 (IN90): un. de Micrographie. 1,5, D TL CARO).

chauffage après avoir introduit dans l'un 5 grammes de carbonate de calcium et dans l'autre 0 gr. 30 d'acide tartrique (soit 0,1 0/0). Les deux ballons ont reçu après refroidissement la mème quantité d'une solution d'urée stérilisée par filtration et ont été ensemences, puis abandonnés à l'étuve. On agite chaque jour et on fait de temps à autre des prélèvements en prenant toutes les précautions d'asepsie nécessaires. À aucun moment le liquide ne donne de réaction positive au NEssLER. Au bout de 30 jours, on verse dans chaque ballon 1 ce. de solution alcoolique de thymol à 10 0/0: les ballons sont conservés à l'étuve à 25°, à l'obscurité, et on continue à effectuer des prélèvements de temps à autre. Le résultat est toujours négatif : c'est à peine si, après plusieurs semaines, le liquide prélevé donne après distillation une légère coloration jaune avec le réactif de Nessier. [Il n'y a done pas eu de dédoublement de l'urée présente.

Ces essais ont été renouvelés avec diverses levures, de vin, de bière haute et basse, ensemencées dans des milieux à urée ; on a essayé d'rjouter le thymol après des temps variables, sans jamais obtenis un seul résultat positif.

Il semble done que la diastase cherchée, si elle existe dans la levure, ne diffuse pas dans le milieu. I ne restait plus qu'à la chercher dans le suc cellulaire lui-même, en employant la méthode de Bucaxen-Hanx.

Dans ce but, j'ai cherché à préparer une certaine quantité de levure développée sur un milieu à urée. M. À. Feuxpacu à bien

voulu mettre à ma disposition deux des appare:! lans lesquels il prépare en grand les levures pures (1). |

Un pied de cuve a d'abord été préparé dans des vases de cuivre étimés contenant chaeun :

Saécharoge,, 4. u 800 gr.

Phosphate monopotassique . . 9 gr.

Sulfate de magnésium. . . . { gr. S0 FRA CE RE Er 4 litres

(4) Décrit dans Duecaux, Traité de Microbiologie, L. 3, p. 726 (1900).

THomAS 4

Après stérilisation à 120°, on refroidit et on ajoute 20 cc. de solution d'urée à 20 0/0 stérilisée par filtration, puis on ensemence. La fermentation se poursuit activement. Au bout de 5 jours, on introduit aseptiquement Le contenu de chacun de ces vases dans deux cuves de FErxsacu renfermant chacune :

SECCHATORC EE 16.000 grammes Phosphate monopotassique . . 180 »

Sulfate de magnésium . . . , 36 »

rés te SECR 80 »

Eau. SA Us 80 litres

L'urée avait été ajoutée après refroidissement, en solution aqueuse préalablement stérilisée par filtration. Le liquide a été aéré d'une manière continue.

La fermentation étant à peu près achevée au bout de 12 jours,

la levure déposée a été soutirée après décantation du liquide

surnageant. La quantité obtenue, rapidement égouttée sur une chausse, représentait environ 150 grammes de levure en pète épaisse. On y ajoute un poids égal de levure fraiche de brasserie tamisée et lavée, on exprune fortement et on mélange la levure pulvérulente avec 200 grammes de sable quertzeux et 40 grammes de terre d'infusoires, selon la méthode indiquée par Bucuxer (1). On broie longuement dans un mortier et on exprime la masse pâteuse au moyen de la presse de Bueuxen.

On obtient, en élevant la pression jusqu’ 100 kgr.. un volume de 45 ce. de liquide: en allant jusqu'à 300 kgr., il s'écoule encore 25 ce. de sue, soit en tout 70 cc. Ce liquide à une réaction très légèrement acide au papier de tournesol.

On prépare deux portions de 5 ce, qui sont portées à l’ébullition et servent de témoins : le premier tube reçoi: après refroidissement 5 ce, d'eau, Le second 5 ce, de solution d'urée à 10 0/0. Dans deux autres tubes contenant chacu + 5 ce. de suc de levure, on ajoute 5 ce, de solution d'urse à 10 0/0: l'un d'eux reçoit de plus 0 gr. 2 de carbonate de calcium précipité destiné à rendre la réaction parfaitement neutre au début de l'expérience. On

HA} E. Buctxer, Per, deut. chem. Gesett., t. 90, p. 117 (1807).

opère de même avec deux nouveaux tubes dans lesquels on ajoute une solution d'acétamide au lieu d’urée, le second recevant en plus 0 gr. 2 de carbonate de calcium.

Ces tubes sont laissés à la température ordinaire (17°). Une seconde expérience, disposée identiquement, est faite à l'étuve à la température de 30°. Enfin, le reste du liquide est additionné de 20 0/0 de saccharose en poudre, pour vérifier l'activité zymasique du suc. Ce dernier tube, laissé à la température ordinaire, donne seulement au bout d'une demi-heure un très faible dégagement de gaz, qui suffit ,our prouver l'existence de la zymase.

Quant aux autres tubes, leur réaction n'a pas changé : elle est restée nentre ou très légèrement acide, pendant la durée de l'expérience, qui a été prolongée 13 heures. [ n'y a donc pas eu hydrolyse de l'urée. Les tubes additionnés d'acétamide ne donnaient pas non plus trace d'ammoniaque par chautlage avec la magnésie.

On peut conclure, semble-t-il, de cette expérience, que la levure employée ne contient pas d’uréase ni de ferment hydrolysant les amides et que ces diastases ne s'y développent pas par culture dans un milieu où l'azote est fourni sous forme d'urée.

Depuis j'ai eu à plusieurs reprises entre les mains des pré-

parations de levures différentes, faites suivant la méthode de

Lepepew (1) et susceptibles de fournir des macérations contenant une zymase très active : je n'ai jamais pu y déceler la présence d'uréase.

Discussion des résultats expérimentaux précédents

De toutes ces expériences résulte à l'évidence la conclusion que les amides employées, urée et acétamide en particulier, peuvent servir à la levure pour éditier son protoplasima vivant.

1) Lesenew, €. À. Acad, Sciences, t. 152, p. 49 (4944). ( Î

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Quel est le mécanisme de cette utilisation? S'agit-il d'un simple dédoublement hydrolytique avee formation de sel ammoniacal? Dans ce cas, il semble que nous devrions trouver, en regard de chaque amide employée, l'acide correspondant et lui seul: or, comme nous l'avons vu, il se fait toujours de l'acide formique en quantité notable, et nous aurons d'ailleurs à revenir sur ce point (1). Nous devrions également, dans eette hypothèse, déceler le ferment hydrolysant, en particulier l'uréase, ce qui n'est pas le cas.

Mais avant d'aller plus loin, il me faut examiner un travail très considérable, dû à H. Paixésnem et paru cinq années après la publication de mes premiers résultats 12).

Ce travail comprend trois parties. Dans une première partie, l'auteur étudie les diverses sources d'azote convenables pour la levure et l'influence de leur constitution chimique sur le pouvoir ferment de cette dernière : dans la seconde, Les substances

qui agissent sur le pouvoir ferment, la multiplication et les échanges azotés de la levure ; enfin, la troisième partie a trait à l'influence exercée sur la formation des produits secondaires.

Pour Prixésateim, la levure peut bien bâtir son protoplasma avec diverses sources d'azote, mais elle ne peut faire fermenter le sucre que si on lui donne des substances azotées contenant le groupement :

NRC CUE ou NH C<C0- | 1

I définit sa proposition : « ce n'est pas une condition géné-

« rale pour la formation de protéiques par la levure que la

source d'azote contienne - NH - CH - CO -, mais seulement une |

« condition pour que le plasma ait la capacité de faire la zymase

« où de permettre l'activation de la zymase formée » (3). Cette

hypothèse est née dans l'esprit de l'auteur à la suite des tra-

(1) Voir plus loin. p. 63.

(2) H. Pnixôsneim, Der. deut. chem. Gesell. t. 39, p. 4048 (1906): voir pour l'ensemble du travail, Biorhem. Zeitsrh.. 1. 3, p. 121 (4907)

(3) H. PriNGsHeim, lor. cit, p. 195.