ÉTUDE DES PRODUITS D'HYDROLYSE DE LA ZYMOCASÉINE ET DE LA CÉRÉVISINE

Les seules données qu'il soit possible de se procurer sur la constitution des protéiques extraits de la levure nous seront fournies par l'hvdrolyse de ces produits. J'ai eu recours d'abord à l'hydrolyse acide.

Répartition de l'azote

Pour étudier en premier lieu la répartition de l'azote dans la molécule, j'ai utilisé la méthode décrite par Hacswanx (1). Elle consiste, en principe, à hydrolyser le protéique en expérience par ébullition avec un acide, neutraliser, doser l'ammoniaque formée, puis séparer les acides aminés en deux groupes au moyen de l'acide phosphotungstique.

Voici le mode opératoire suivi, qui correspond à peu près à celui indiqué par OsBorxe et Harris (2) :

On prend euviron 1 gr. de substance, préablement séchée jusqu'à poids constant et pesée exactement et on fait bouillir pendant 8 heures au réfrigérant ascendant avec 20 ce. d'acide

chlorhydrique concentré. Le liquide évaporé au bain-marie au

(1) Hausmaxx, Zeits. physiol. Chemie. t. 27, p. 95 (4899) et ©. 29, p. 136 (1900).

{2} Oseonxe et Hans, J. of amer. chem. Society, 1. 25, p. 323 (1904).

tiers de son volume est neutralisé au moyen de magnésie pure ralcinée : on ajoute un excès de magnésie et on distille, atin de déplacer l'ammoniaque, qui est titrée au fur et à mesure de son dégagement,

Le résidu, additionné d'acide ehlorhydrique jusqu'à réaction acide, est concentré au bain-marie: on sépare par tiltration les substances humiques insolubles dans lesquelles on dose l'azote par la méthode de Karzoant,, et Le Liquide filtré, amené au volume de 100 ce... est additionné de 5 ce. d'acide sulfurique puis précipité par un léger excès d'une solution d'acide phosphotungstique à 10 0/0 dans l'acide sulfurique à 5 0/0. Après 24 heures, on filtre, on lave avee une solution sulfurique étendue d'acide phosphotungstique, cton dose dans le précipité l'azote basique, attribuable surto:t aux acides diaminés. Un dosage fait dans le liquide résiduel donne l'azote des acides monoaminés et permet le contrôle de l'opération entière.

L'opération faite dans ces conditions donne des résultats assez comparables, ainsi qu'il est facile de s'en rendre compte en pratiquant deux déterminations successives.

1° Zymocaséine, — On utilise deux échantillons séchés dans le vide sulfurique, pulvérisés et rendus bien homogènes. On sèche env'on 2 gr. de chacun à 110° et on pèse deux frac-

tions Let IL. On a les résultats suivants :

l il

ur, Er,

Poids de substance . . . . 0,958 0,945 TL, avé azote ammoniaeal. 0,01064 0,0105 Correspondant en ONE CC 4,11 1,11 Trouvé azote des substanres humi-

ques Te Ver : $ : F 000623 0.003392 Corsesponda OS e 0,6 0,41 lrouvé azote au précipité phospho-

tHAgstQUe CN 0,0413 0,0396 Soit en azote diaminé 0/0 . . . 4.31 4,20 lrouvé azote du liquide résiduel. 0,0945 0,0917 Soit en azote monoaminé 0/0. 9,76 9,72

Il est intéressant de grouper ces chiffres en un tableau en les

rapprochant de ceux qui ont été obtenus par OsBonxE pour la caséine (1), à l'aide d'une méthode analogue :

Zymocaséine Zymocaséine

d'azote

“sote ammonineal . . .. à , ’ j.N( 10,30 humique . . . ... N à Ë 5 0,21! 1,30 diaminé ou basique. 3,49] 22,40 | InonOaminé. . . +: 10,31! 66,0 |

lotal déterminé . .| 15,84| 97, 0% ka] 15,62/100,00 |

au lieu de .16 , 16,11[100,

Comme on le voit, la diflérence porte surtout sur l’ammoniaque, qui est produite en plus grande quantité dans l'hydrolyse de le caséine du lait. Néanmoins, 11 ÿ à une concordance assez satisfaisante : tout au plus peut-on remarquer que la caséine du lait fournit un peu moins d'azote basique que celle de la levure.

do Cérérisine. — Les échantillons employés provenaient de coagulums obtenus à lébullition, séchés à 110° et pulvérisés

tinement. On les débarrasse des matières étrangères solubles

par épuisements répétés à l'eau bouillante. Après dessicecation

à 1100, on pèse deux fractions qui sont soumise à l'hydrolyse.

On à :

[| Il

gr. gr.

Poids de substance . . . . . 1,06% 1,5305 Trouvé azote ammoniacal. : . 0,01022 0,01456 Correspondant en 0/0 à . . . 0,96 0,45

Trouvé azote des substances humi- RE 0,0029% 0,00392

1) Osnonxe, The vegetable Proteins, London 1916, p. q P

myr mgt Correspondant en 0/0 à . . . 0,276 0,256 lrouvé azote du précipité phospho-

tungstique : LR CE, ea 0,041? 0,058 Soit en azote diaminé 0/0, : 3,86 3,1 Trouvé azote du liquide restant 0,1162 0,169! soit en azote monoaminé 0/0. . 10,92 14,05

En calculant ces résultats en 00 de l'azote total, je les mettrai en regard de ceux qui ont été trouvés par OsBonxe (/oc. rit.) pour une albumine végétale, la léguméline des pois :

Léguméline | e pois D.

Cérévisine Cérévisine [

0 0 di substance

azole ammoniaecal. . .

— humique 5.4 0,276 1.691 0.256! 1,56]! O.48! 1,0 |

— diaminé ou basique.| 3,86 23.691 3.91 | 23.74] 3.45] 23,

— monoaminé. : . :: 10.92 67.04111.05 | 67,42] 14.33! 67.00 |

total déterminé. . 16,016! 98,30/16,166! 98,50) FPE À

RULES nr CN 146,29 | 100,00!16.39 |100.00

La concordance est très remarquable, bien qu'il s'agisse de deux substances d'origine aussi différente ; elles appartiennent toutes deux au groupe encore très restreint des albumines végétales typiques, solubles dans l'eau et coagulables par la

chaleur.

Nature de l'azote basique

Les deux substances étudiées contiennent une quantité assez

élevée d'azote sous forme d'azote basique et il m'a paru inté-

ressant d'en étudier la nature de plus près. Nous possédons, en elfet. dans la méthode décrite en 1900 par Kossez et Kurscuen (1)

et devenue classique un procédé qui dépasse de beaucoup, au

point de vue de la précision des résultats, la méthode de

E. Fiscuen pour la séparation et le dosage des acides monoaminés (2). En d'autres termes, il apparait comme plus facile de caractériser les deux nouveaux protéiques par la détermination des quantités d'arginine, d'histidine et de Iysine qu'ils fournissent à l'hydrolyse que par celle des acides aminés obtenue au moven de la distillation fractionnée de leurs éthers.

La recherche a été faite en suivant exactement les données du mémoire de Kossez et Kursenek : hydrolyse sulfurique, précipitation par la barvte, enlèvement de lhistidine et de l'arginine à l'état de combinaisons argentiques et de la lvsine sous forme de phosphotungstate que l'on transforme ultérieurement en picrate. Pour la séparation de l'histidine et de l'arginine, j'ai utilisé la modification de Kossez et Prinece (3) qui repose sur l'emploi du carbonate de baryun.

1° Hydrolyse de la symocaséine. — L'opération à porté sur 60 gr. le produit séché dans le vide à 37, qui correspondaient à HA gr. de substance séchée à 1100 jusqu'à poids constant. L'hydrolyse a été obtenue par chauflage de 8 heures avec un mélange de 180 gr. d'acide sulfurique à 66° B. et 360 gr. d'eau.

Le liquide amené au volume de 600 ce. ne réduit pas la liqueur de Fentixc. Un dosage d'azote indique une teneur de 8 &r. 232 soit seulement 15.24 0 0. Après saturation presque complète de l'acide au moyen d'hydrate de barvum pulvérisé, on essore et on épuise le sulfate de baryum par l'eau bouillante. La totalité du liquide est évaporée à 500 ce. ; un dosage d'azote

(4) Kossez et Kursener, Zeits. physiol. Chemie, À. 34, p. 165 (1900).

(2 E. Fiscuen, Zeits. physiol. Chemie, À 33, p. 151 (1904). V. aussi Untersuchungen ueber Aminosäuren, Polypeptide und Proteine, Berlin

(3) Kossez et Pruxue, Zeits. physiol. Chemie. À 49, p 318 (1906).

ne donne que 7 gr. 469, soit une perte de Our. 763, corres-

pondant à 9,26 0 0 d'azote humique entrainé par le précipité

barytique.

Le dosage de F'ammoniaque, par distillation sur un léger excès de magnésie, donne 3,97 0,0 de l'azote total sous forme d'azote ammoniacal, soit 0,605 0 0 du protéique. Le liquide débarrassé d’ammoniaque par la magnésie, de magnésie par la barvte et de la baryte en excès par l'acide sulfurique est additionné à chaud de sulfate d'argent jusqu'à léger exeës son refroidit, on précipite par la baryte, on filtre et on essore Le précipité d'arginine et d'histidine argentiques. Ge précipité décomposé donne les bases en solution ; on amène le volume à 9500 ce. et on dose l'azote. On trouve 2 gr. 1224, soit 25,78 0 0 de lazote total.

L'histidine est séparée au moyen du carbonate de barvum ; le précipité est décomposé et Fazote dosé dans la solution. Trouvé : Ogr. 3858 d'azote, soit 1.68 0,0 de l'azote total, correspondant à gr. 121 d'histidine ou 2,63 0.0 de zvmocaséine. J'ai pu extraire à l'état de dichlorhydrate 0 gr. 998 d'histidine, ce qui correspond seulement à 1.850 0.

L'arginine argentique étant précipitée par un exees de barvte est décomposée ultérieurement: la solution contient 0 gr. 623 d'azote. soit 7,56 0,0 de l'azote total, correspondant à P&r. 936 d'arginine ou à 3,58 d'arginine 0/0 de zymocaséine. La quantité d'arginine isolée en fait sous forme de nitrate était seulement de { gr. 35. soit 2,50 0 0 seulement.

Le liquide dont on à précipité l'histidine et Farginine est débarrassé d'argent: un dosage d'azote y indique 4 gr. 648 d'azote, soit 56,46 0 0 de l'azote total. On précipite par l'acide phosphotungstique : le précipité lavé est décomposé par la barvyte et l'azote dosé. On trouve er. 0396 d'azote, soil 12,63 0,0 de l'azote total.

Le liquide restant, contenant les acides monoaminés, doit donc renfermer 56,46 — 12,63— 13,83 0.0 de l'azote total. Si le précipité phosphotungstique ne contenait que la Iysine, celle-ci représenterait environ 10 00 de la zymocaséine. La trans-

formation en pierate étant effectuée, on obtient seulement 5 gr. 672 de picrate cristallisé, correspondant à 2 gr. 208 de lysine ou 4,09 00 de zymocaséine. Celle-ci ne représente donc que 5,14 0,0 de l'azote total (1).

On voit qu'indépendarament de l'azote resté dans les précipités, il reste dans les liquides dont on a extrait l'histidine et l'arginine d'une part, la lysine d'autre part, des quantités importantes d'azote sous forme inconnue (2).

Néanmoins, ces résultats vont nous permettre d'établir une comparaison entre la zymocaséine et la caséine du lait, ainsi qu'avec la glutencaséine. On peut, en effet, en s'en tenant à la répartition de l'azote basique entre l'ammoniaque et les trois bases hexoniques de Kossez, obtenir le tableau suivant :

Zymocaséine Caséinogène Glutencaséine

de levure du lait (3) de blé (3)

Ammoniaque., + . . +. + 0,73 2,0 4,0 GROS A ER UE 2,63 2,6 1,8 ATBIDIDENs CR CC Re 3.58 4,8 4,1 DYMO ren ee 4,09 D,8 : 1,9

C'est donc surtout par la quantité d'ammoniaque fournie que les différences apparaissent. De plus, la zymocaséine se rapproche de la caséine du lait par sa teneur en lysine, tandis que la glutencaséine est beaucoup plus pauvre.

2 Hydrolyse de la cérérisine. — Cette hydrolyse a été effectuée en chauffant 58 gr.6 de produit séché à 110° jusqu'à poids constant avec un mélange de 180 gr. d'acide sulfurique à 66° B. et 360 gr. d'eau, à l'ébullition, pendant 8 heures.

Le liquide refroidi est amené à 500 ce. : on dose l'azote sur

(4) Tous ces caleuls ont été établis en tenant compte des quantités employées aux dosages; ils sont toujours rapportés à la lotalité de la substance soumise à Fhydrolvse Les chiffres indiqués ne nécessitent par suite aucune correction

(2) Cet azote est probablement sous forme d'acides monoaminés ; on sait déjà que le liquide duquel a été isolée la lysine renferme une partie importante de la phénylalanine libérée par hydrolvse, et précipitée en même lemps par l'acide phosphotungstique.

(3) AuspenHaLDes, Lehrbuch d. physiol. Chemie, 3° édition, p. 400 (1914).

3 ec. et on obtient 9 gr. 442 d'azote, soit 16,11 0 0 de la cérévisine. Après saturation de l'acide par l'hydrate de baryte, essorage et lavage du précipité, il ne reste plus que 8 gr. 8536 d'azote, soit une perte de 0 gr. 5884 ou 6,220 0 d'azote humique, en 0/0 de l'azote total. Le dosage de l'ammoniaque donne une teneur de 3.43 0 0 de l'azote total, correspondant à 0,55 d'azote ammoniacal 0/0 de protéique.

Après séparation de l'histidine et de l'arginine à l'état de combinaisons argentiques, on décompose le précipité et on dose l'azote dans la totalité de la solution obtenue : on trouve ainsi { gr. 774 d'azote, soit 18,78 0/0 de l'azote total pour le précipité renfermant les deux bases. L'histidine argentique étant de nouveau séparée au moven du carbonate de baryum, on la met en solution et on: 120te : on trouve 0 gr. 32 d'azote, soi: 3,39 0/0 de l'azote ‘e chitfre correspond à er. 184 d'histidine, soit 2,02 0€ de protéine. La quantité d'histidine obtenue n'a été que de 0 g1. 87.

La combinaison argentique de Parginine est précipitée, lavée et décomposée. On dose l'azote dans la solution et on obtient, pour la totalité, 0 gr. 7474 d'azote, soit 7,91 0/0 de l'azote total, correspondant à 2 gr. 318 d'arginine, où 3,95 0/0 de protéine. La quantité d'arginine, obtenue à l'état de nitrate cristallisé, était de 1 gr. 95

Le liquide dont on à séparé l'histidine et Farginine étant debarrassé d'argent et soumis au dosage de l'azote, on trouve en tout 6 gr. 2733, soit 66,44 0/0 de l'azote total. Le précipité phosphotungstique renferme À gr. 352 d'azote, soit 11,32 0/0 de l'azote total. IL y à done pour Îles acides monoaminés 66,44 — 14,32 — 52,120 0 de l'azote total.

Ce précipité étant décomposé, on précipite la lysine à l'état de picrate. Ce sel recueilli et séché pèse 10 gr. 752, qui correspondent à 1er. 186 de Lysine soit 7,14 0,0 de protéine L'azote correspondant est 0 gr. 8028 ou 8,50 0/0 de l'azote total.

On peut déduire de ces divers dosages que les quantités d'histidine et d'arginine obtenues après purification des combinaisons argentiques de ces deux bases sont notablement plus

faibles que celles qui paraissaient devoir être présentes d'après le dosage de i'azote dans l'ensemble du précipité argentique.

J'ai essayé, dans une deuxième hydrolyse, d'améliorer les rendements et je suis arrivé aux chiffres suivants :

L'hydrolyse a porté sur 30 gr. de cérévisine, qui ont été chauffés pendent 14 heures avec 90 gr. d'acide sulfurique et 180 gr. desu., J'ai obtenu, en azote ammoniacal, 2,634 0/0 de L'azot. al où 0,240 0 de substance. Par suite d'un accident, la fraction histidine a été perdue après sa séparation. Pour l'arginine, la combinaison argentique est décomposée, la liqueur débarrassée d'acide sulfurique par la baryte et de l'excès de barvte par un courant de £az carbonique. On concentre, on filtre et le liquide évaporé à 10 ce. environ est additionné d'un léger excès d'acide picrolonique (4) dissous dans l'alcool chaud. Après quelques instants, le liquide se trouble et il se dépose un abondant précipité cristallin jaune clair, On recueille après 20 Leures, on lave, on sèche et on pèse. On obtient ainsi 3 gr. 45 de picrolonate d'arginine, correspondant à À sr. 37 d'arginine, soit 4,42 0 0 de protéine. Quant à la lysine, on à obtenu 6 gr. 25 de picrate de cette

base, correspondant. à 2er. 43 de Ivsine, soit 8,10 0,0 de pro-

téine (2).

On peut maintenant comparer les résultats obtenus pour la cérévisine à ceux qui ent été publiés pour d'autres albumines

(ti L'acide picrolonique, décrit par BERTRAM (Dissertation, léna 1892), es! le {-paranitrophényl-3-méthyl4 uitropyrazolone-5, C'HYOSNE. C'est une antipyrine dinitrée en paraphényl el en (4), et déméthylée en (2) :