C6H+, NO

Ni(4) FES (C0 N (2) Û (ll NO2.CH____, C.CH (4) (3)

acide picrolonique antipyrine

(2) La plupart de ces résultats analytiques ont été publiés en vollaboralion avee Mme S. Kouopzitasra (C. A. Acad. Srienres, L 457, p. 243 (1913).

végétales, comme par exemple la léguméline de pois. On

trouve

Cérévisine Léguméline (1) Ammoniaque . . + + 0,67 1,23 Histidine . 2,02 2,27 ACGININE ; M re +0: 4.42 D, Dysine 0: j 8,10 3,03

Comme on le voit, la concordance dans les chiffres de répartition de l'azote obtenus par la méthode de Hausmaxx modiliée disparait dès que l'on met en regard les quantités de chacune des bases elles-mèmes ou sans doute de chacun des acides aminés pris isolément.

Si la légumélin.… est une protéine assez vhe en arginine, on voit que la cérévisine est l'une des plus riches en 1ysine 2)

qui soient connues C'est là un caractère intéressant qui donne

à cette albumine une place à part et suftit à la distinguer des

autres protéines d'origine végétale.

IL est instructif de comparer, au point de vue de la répartition de l'azote, les chittres obtenus dans l'hydrolyse sulfurique de la zymocaséine et de la cérévisine avec ceux qui ont é'é donnés par la méthode de Hausmasx (p. 122 et 123, Ces chif-

fres sont en 0,0 de l'azote total.

Zvimocaséine Cérevisine Cas É, SR CN hvdrolvse hydrolyse

Harswaxx sulfurique Hausmaxx sulfurique

Azote ammoniacal . 3 6,80 3,97 5,89 3,43 Azote Humique + + + + … : 4.02 9,26 1,69 6,22

(4) Ossorxe, The vegetable Proteins, p. 59.

(2) D'après les résultats de NGuREDER Wdoe. cit), qui a extrait jusqu'à 8,68 0/0 de Ivsine du mélanze indéterminé, contenant vraisemblablement à la fois zymocaséine el cérévisine, qu'il a soumis à l'hydrolyse, la teneur de la cérévisine en Iysine doil être encore plus élevée et comprise entre 9 et 10 0/0, car celle de la zymocaséine ne parait pas atteindre » 0/0.

Thomas 9

Zymocaséine Cérévisine Te

bydrolyse hydrolyse

Havsmaxx sulfurique Hausmaxx sulfurique

Azole du precipité argentique con-

tenant arginine et histidine. . » 25,78 » 18,78 Azote du précipité phosphotungs-

COUR RER » 12,63 » 14,32 Azote de Fhistidine, . . . . » 4,68 » di Azote de l'arginine. . . . . « 7,56 » 8,84 Azote de la lysine . . . . . » ,14 » 9,64 Azote total des trois bases . . 26,67 17,38 923.69 21,87 Azote des acides monoaminés :

directement . . . . . 60,39 43,83 67,03 52.12 par différence . . . 62,45 69,39 68,73 68,48

IL est facile de déduire de ce tableau un certain nombre de faits intéressants.

1° On voit que l'hydrelyse sulfurique produit moins d'ammoniaque et plus de substances humiques que l'hydrolyse chlorhydrique dans la méthode de Havsmanx. Mais le total de l'azote ammoniacal et de l'azote humique ne change guère : 13,23 au lieu de 10,88 pour la zymocaséine, 9,65 au lieu de 7,58 pour la cérévisine, Ceci vient confirmer les faits signalés par KosseL et Kurseuer (4) à propos de l'hydrolyse de la gluten-caséine par l'acide sulfurique à 1,3 en volume ou 1/3 en poids, et par Uonaxsky (2) au sujet de l'origine des substances humiques : celles-ci proviendraient surtout de l'action des acides sur les groupements susceptibles de fournir de l'ammoniaque par hydrolyse :

% La précipitation de lhistidine et de l'arginine au moyen des sels d'argent est accompagnée par celle de produits azotés juconnus en quantité assez élevée, et il n'ya pas concordance entre les deux méthodes : on ne peut done considérer la somme de l'azote enlevé par Le précipité argentique et de l'azote enlevé ensuite par la précipitation avec l'acide phosphotungstique

comme représentant l'azote basique :

(1) Kossez et KurscuEr, loc. cit.

(2) Unnaxskv, Zeits. physiot. Chen.ie, t. 42, j. 43 (1885)

æ Le précipité phosphot: ngstique qui contient la lysine renferme également d'autres corps (en particulier, comme on le sait maintenant, la phénylalanine). La détermination de l'azote basique dans la méthode de Hausmaxx conduit done toujours à des résultats trop forts, et d'autant plus élevés qu'il y a plus de ces produits dans la molécule étudiée.

Nature des acides monoaininès

La recherche et la séparation des acides monoaminés peuvent être faites par la méthode d'éthérification de E. Fiscnen. à condition de posséder une quantité assez importante de substance. J'ai dû, pour cette raison, renoncer momentanément à ce travail. Il ne faut d'ailleurs pas exagérer l'importance de cette lacune au point de vue du but poursuivi actuellement, qui est surtout de rechercher les caractéristiques les plus importantes

des deux protéiques de la levure. Le méthode d'éthérification, mème entre des mains expertes, comporte des causes d'erreur assez importantes pour que les résultats qu'elle fournit aient beaucoup plus que la valeur d'indications sur Les quantités des

divers acides aminés présents dans la molécule (1). Nous avons déjà, grâce au travail de SCHROEDER (lue. cit), | d'utiles renseignements sur certains de ces acides aminés. Ainsi, j nous savons que le glycocolle n'existe pas dans les protéiques À étudiés, que la phénylalanine, la tyrosine et la eystine ne peuvent S'y trouver qu'en très faible quantité. ne faut done probablement pas compter sur ces corps pour nous fournir des caractères différentiels.

On en peut dire autant de la leucine ; présente dans toutes les molécules des protéiques en quantité assez notable, sa détermination, d'ailleurs difficile à faire exactement. ne nous

apprendrait pas grand chose.

(4) ABDERHALDEN et We, Zeits. physiol. Chemie, L. 74, p. 445 (1911): t. 77, p. 59 (1912).

Celle des acides aspartique et glutamique semblerait devoir ètre plus profitable. IL en est de même du dosage du tryptophane, élément plus particulier, tant au point de vue de sa structure chimique qu'à celui de son importance physiologique. et dont la présence imprime à la molécule protéique un caractère beaucoup plus tranché.

Pour cette raison, je me suis proposé surtout de doser cet acide aminé dans les protéiques étudiés

Dosage du Tryptophane. — Les solutions de zymocaséine, aussi bien que celles de cérévisine, donnent par addition d'une solution d'acide glvoxylique puis d'acide chlorhydrique concentré un anneau d'un violet intense à la surface de séparation des deux couches : c’est la preuve que ces protéiques contiennent du tryptophane (1). En raison de l'intensité de la réaction obtenue, ilest à prévoir que la quantité de cet acide aminé est assez notable.

En examinant les travaux publiés sur le dosage du tryptophane, on se trouve en présence de plusieurs méthodes : la première est basée sur l'isolement direct du produit, les autres sur l'obtention d'une réaction colorée dont on apprécie l'intensité.

1e Méthode par isolement en natures — Elle a été employée par Hopkins et Cote 12 qui ont utilisé {a digestion trypsique pour détacher le tevptophane de la molécule protéique, puis

l'ont séparé par précipitation au moyen du sulfate mercurique

en milieu aciditié par Facide sulfurique. Après décomposition du précipité lavé au moyen d'hydrogène sulfuré, on recommence encore une fois ce traitement. La solution obtenue est concentrée jusqu'à cristallisation : finalement, on sèche et on pèse. Horkixs et Cor ont ainsi directement retiré de la caséine 1,5 0/0 de son poids de tryptophane. Ce résultat, que les auteurs indiquent comme un minimum en raison des pertes inévitables, est à retenir.

G) Asvennmasoes, Lehrbarh d. physiot. Chemie, à “hit, pu RO COTE)

2, .. 4. Hopkins el NS. COLE, J. of Physiology. L 27, p. &1x (1901).

20 Méthode de titrage basée sur l'emploi d'une réaction colorée. — Le tryptophane en solution pas trop étendue donne avec l'eau de brome une coloration rou£se été d'abord utilisée par Levexe et Rouen D pour le dosage solution titrée d'eau de brome.

le virage de la coloration

violacé. Cette réaction à

volumétrique au moyen d'une La fin du titrage était indiquée par ce qui correspond à la transformation

du rouge-violet au jaune, {dibromé en combi-

du mélange de tryptophane monobromé e naison dibromée.

3 Méthodes colorimétriques. — Fasas (2) à indiqué en 1912

un procédé basé sur l'action de l'acide sulfurique en présence réaction de Hopkins: {l se fait une coloau colorimètre, avec une solution titrée de

de l'acide glyoxylique ration violette que l'auteur compare gamme colorée obtenue au moyen d'une tryptophane pur (oh

Plus récemment, Heuveeco (0 à publié une méthode qui

iylaminobenzaldéhyde en précoloration bleue qui apparait au colorimètre où au spectro-

repose sur l'emploi du p-dimétl sence d'acide chlorhydrique. La progressivement est comparée, photomètre, à celle que fournit une solution titrée de tryptophane pur, comme dans la méthode de FasaL.

Le procédé qui consiste à extraire le tryptophane en nature résultats les plus certains ; il exige

est celui qui donne les ante de matière protéique,

naturellement une quantité import able dans beaucoup de cas. Je me suis

étudier les méthodes colorimétrirsque l'on ne dispose que

Leur précision laisse tou-

ce qui le rend inapplie attaché pour cette raison à ques, d'une appli ation commode lo

de petites quantités de substance.

(up P. Levexe et C Rouen, J.0f biol. Chemistry, L 2 pe 481 (1907).

(2) FasaL, Biochem. Zeits., \ 44. p. 392 (1912). (3) Vorsexer (Bull. Sor. chimique, 4e sér. À 23, p. 361, 1918) trouve que l'acide glyoxylique n'intervient dans la réaction d'ApamkiEwIcz des protéiint de l'aldéhyde formique sous l'action de Facide sul-

ques qu'en fourniss:

e solution de formol au

Il remplace ce réactif par un 1/100. Voisexer n'indique pas si la réaction telle qu'il l'a modifiée reste caractéristique du tryptophane, ce qui est le point important.

dE. Herzreip, Biochem. Zoits . 1. 56. p. 258 (1913)

furique concentré.

jours à désirer, mais elle est au moins de mème ordre que celle des méthodes d'isolement qui permettent actuellement de doser les acides aminés.

J'ai done repris l'étude du procédé indiqué par Fasaz. Cet auteur prend 6 gr. 1 de substance desséchée jusqu'à poids constant, y ajoute 2 ce. de solution d'acide glyoxylique (obtenue par réduction d'une solution saturée d'acide oxalique avec

l'amalgame de sodi . puis 6 ec. d'acide sulfurique concen-

tré: apres avoir mi.angé, il compare au colorimètre Dusoso avec le type de la gamme colorimétrique qui parait le plus voisin de la teinte obtenue.

Fasaz, voulant contrôler sa méthode, détermine la teneur en tryptophane de la caséine ; il trouve le chiffre de 0,65 0/0. Comme dans une préparation faite par ABDERHALDEN et Kempe (1) ces auteurs avaient obtenu avec la caséine 0,53 0/0 de tryptophane, Fasas considère l'accord comme satisfaisant, sa méthode colorimétrique excluant, dit-il, les pertes.

En fait, en répétant le dosage selon Fasar avec de la caséine desséchée en poudre, j'ai obtenu le chiffre de 0,6 0.0. Il semble done qu'il y à concordance. Malheureusement, on « bserve qu'après quelques heures de repos le mélange coloré en violet laisse surnager des grains très fins fortement colorés. C'est qu'une partie de la caséine ne s'est pas dissoute dans l'acide, accident presque inévitable avec la plupart des protéiques lorsqu'ils ont été séchés à l'étuve. J'ai alors pris de la caséine du

même échantillon que j'ai finement pulvérisée au mortier

d'agate, tamisée au tamis de soie fin, puis séchée jusqu'à poids

constant. Une détermination faite sur cette poudre m'a donné la valeur de 1,78 0/0, la totalité du produit passant en dissolution dans l'acide sulfurique.

Ce chiffre peut être considéré comrie en parfait accord avec celui de Hopkins et Cour, qui est d'ailleurs indiqué par ABbEr- HALDEN lui-même dans ses ouvrages (2. En travaillant avec la

(4) E. Aenennaunex el Kewre, Zeits. physiol. Chemie, L. 52, p. 208 (4907).

(2) ABperHaLDEx. Lehrbuch d. physiol. Chemie, 3e édit., p #00 (1914).

méthode de Fasaz, on peut donc arriver à des résultats satis-

faisants, si on prend la précaution « assez finemest pour qu'elle passe entiè dans l'acide: l'auteur parait avoir négligé cette précaution et par suite tous les résultats publiés par lui semblent bien douteux. Sa méthode présente pourtant un très grave inconvé= lorations très variables, allant du

le pulvériser la substance

rement en dissolution

nient : c'est de donnet des co es les teintes du violet. La com-

bleu au rouge-violet, par tout la teinte bleue donnée par le

paraison au colorimètre avec

tryptophane pur devient dès lors difficile, souvent impossible.

Lorsqu'il s'agit de protéiques très riches en groupements hydrocarhonés, ia couleur est toujours rabattue par une proportion variable de brun et la comparaison est impossible. J'indiquerai simplement que la détermination ïu tevptophane par cette méthode dans les protéiques de la levure m'a donné les résul-

tats approximatifs suivants :

Zymocaséine .

Cérévisine .

Les déterminations faites avec la zymocaséine sont douteuses

pour la raison indiquée plus haut. ait devoir éviter les inconvénients

La néthode de HERZFELD par de la précédente. En eltet, libéré de la moléeule par la digestion trypsique. est mis en réactifs moirs violents et les colorations sa teneur

le tryptophane, préalablement

évidence au moyen de obtenues semblent ètre en rapport plus direct avee dans la molécule protéique.

Herzeezo prend Î gramme de proté dans 50 ec. d'une solution de carbonate

ique séché qu'il dissout de sodium à 0,5 0/0, digérer 24 heures à

0 gr. 5 de paneréatine et laisse e de chloroforme et de toluène. Après ce exactement 50 ec. de liquide refroidi et au p-diméthylaminobenzal-

ajoute l'étuve en présence

temps, il mesure filtré, y ajoute tu ce. de réactif ide chlorhydrique concentré et laisse

déhyde puis 40 ce. d'ac

30 heures à la température ordinaire (1). Le liquide bleu est alors comparé, au colorimètre où au spectrophotomètre, avec celui qui est fourni par une solution titrée de tryptophane. Bien entendu, le tryptophane contenu dans la paneréatine est déterminé par une expérience de contrôle et ilen est tenu compte dans le calcul du résultat.

Dans quatre déterminations faites avec la easéine, Herzrecb trouve : 0,52- 0,53 - 0,51 -0,50 ; moyenne : 0,515 0,0. En opérant par sa méthode, j'ai trouvé de 1,3 à 1,4 0/0. Quelles peuvent être les raisons de cette divergence? [+ en a plusieurs.

D'abord, ici encore, la finesse de la poudre à son importance car la dissolution dans le carbonate de sodium étendu peut n'être pas complète, Des poudres fines de easéine m'ont donné 1,60 et 1,63 au lieu de la teneur indiquée plus haut. \vec certaines substances, la finesse de la poudre ne suffit pas toujours etil faut avoir recours à un autre moyen, comme nous le verrons plus loin.

D'autre part, la durée de la digestion employée par enz- FeLb (24 heures) est insuffisante pour détacher la totalité du tryptophane fixé dans la molécule, Horkis et Core indiquent de laisser la digestion jusqu'à ee que la réaction à l'eau de brome soit maximum, ce qui peut exiger 7 jours, On sait d'ailleurs que la quantité de trvptophane libérée augmente nettement dans les premiers jours de la digestion

Entin, Henzreuv parait négliger complètement action de la lumière sur le déveioppement de la réaction colorée qu'il utilise. J'ai observé qu'un mélange laissé à Pobseurité se colore beaucoup plus lentement qu'un autre mélange identique placé en pleine lumière, Sur une table, dans un laboratoire, des diffé-

rences d'éclairement produisent des différences d'intensité dans

la couleur des échantillons placés côte à côte. De plus, la

durée de 30 heures qu'il indique est plutôt insuffisante: j'ai

(1) Ce réactif a la composition suivante :

p-diméthvlaminobenzaldéhyde 20 gr.

sehlorhedriane concentré 0 DO0 4

200 ce.

obtenu après 18 heures et mème 60 heures des résultats plus comparables,

J'ajouterai qu'il n'y à aucun intérêt, au point de vue de la précision, à remplacer le colorimetre par Le speetrophotometre Ë ces deux instruments set iplétent plutôt. Le colorimetre donne de trés bons résultats pour comparer les teintes bleues de faible ou movenne intensité, dans lesquelles une légéere dif férence de coloration ne &éêne piis la comparaison et dont le pouvoir absorbant est trop petit, sous faible épaisseur, pour permettre utilement Femploi du spectrophotometre. Inversement, ce dernier instrument convient très bien pour comparer des solutions intensément colorées, avec lesquelles l'emploi du colorimètre n'est pas recommandable (1

Jai, en tenant compte de ces Buts, employé Le m de opéra toire suivant :

La substance desséchée est pulvérisée finement et tamisée à travers un tissu de soie serrée, puis la poudre est séchée à l'étuve jusqu'à poids constant. On pèse exactement un poids voisin de 0 gr. 40 de produit et on le dissout, en broyant au mortier, par petites portions, dans une solution de carbonate de sodium à 0,5 0 0. On complète ensuite à 200 ce. avec cette solution. Certaines substances ne se dissolvent pas complètement dans ces conditions. On prend alors une quantité convenable de préparation à l'état humide, soit coagulée par la cha leur, soit précipitée et lavée. et on l'essore avec soin. On prélève deux portions de même poids — environ 2 gramimes — de la masse humide et on dessèche l'une à l'étuve jusqu'à poids constant, tandis que Fautre est dissoute dans 200 ec. de la solution de carbonate de sodium. On connai ainsi le poids de

matière sèche en solution.

La solution, additionnée de 6 zr. 10 d'une préparation active de pancréatine, puis de 5ce. de chloroforme et de 5 ce. de

toluène, est placée à l'étuve à 37° et abandonnée à cette tem-

(1) J'ai employé dans ces recherches le spectro hotomètre de CH. FERY, à l F

construit par Ia maison Beacvois, rue Lavmont,

pérature. On prélève après chaque période de 24 heures un volume déterminé de liquide que l'on essaie à l'eau de brome après neutralisation. Quand la coloration ne parait plus augmenter d'intensité :5 à 7 jours), on prélève avec une pipette une certaine quantité de liquide que l'on filtre et on mesure 50 cc. de filtrat auquel on ajoute 10 ec. de réactif au p-dimé-

thylaminobenzaldéhyde, préparé comme plus haut, puis assez

d'acide chlorhydrique concentré et pur pour amener le volume à 100 cc. On mélange et on laisse à la lumière, en disposant à côté, soumis au même éclairement, un ballon semblable dans lequel on a mis avec le réactif et l'acide chlorhydrique, 30 ce. d'une solution de tryptophane pur (1) de richesse connue (0,004 à 0,010 0/0). Après 40 à 48 heures, on compare les teintes au colorimètre ; on fait de nouveau cette comparaison après 50 à 60 heures et on calcule la richesse en tryptophane.

Voici un exemple de détermination. On a digéré un poids de caséine correspondant à 0 gr. 45 de produit sec, dissous dans 200 ce. de solution avee 0 gr. 10 de trypsine. La réaction est faite sur 50 ce. de solution, amenés à 100 ce. Une épaisseur de 0,95 de ce liquide correspond au colorimètre à une épaisseur de 1,0 du liquide obtenu avec 10 ce. de solution de tryptophane à 0,02 0/0 amenés à 100 ce.

La solution de tryptophane contient :

6 — 0,002 0,0 de tryptophane.

La solution de caséine contient :

== 0,0021 0/0 de tryptophane.

La totalité de la digestion de easéine contient :

(1) Le tryplophane qui a servi à ces comparaisons provenait de la maison Horrmaxx La Rocne. place des Vosges, à Paris.

ILest commode d'en préparer une solution à 0,02 0/0, que l'on dilue plus ou moins au moment de l'expérience.

DLOD2UX 2 = 0 gr. 0084 de tryptophane.

La trypsine employée renfermait, d'après la détermination préalable, 0,70 0/0 de tryptophane, soit 0 gr. 0007 pour 0 gr. 10, quantité utilisée.

I reste donc 0,0084 - 0,0007 — 0 gr. 0077 de teyptophane pour 0,45 de caséine, ce qui fait :