TS À EE

lure latérale, où la solution occupe une épaisseur ne dépassant pas un centimètre. Après stérilisation à l'autoclave, à une température de 110, et refroidissement, on introduit, en prenant les précautions d’asepsie convenables, la quantité voulue d’une solution de la substance azotée en expérience, préalablement stérilisée par filtration à la bougie CaamBercann. Cette précaution est nécessaire, parce que la plupart des amides sont hydrolysées par le chauffage de leurs solutions à l’autoclave.

D'autre part, on prépare une culture pure de levure (1) dans un milieu quelconque, tel que l’eau de touraillons sucrée. Lorsque la fermentation est terminée, la levure se dépose ; on décante le liquide, on délaie le dépôt dans un peu d’eau stérile que l’on décante rapidement à deux reprises, et on ensemence avec une quantité exactement mesurée de l’émulsion de levure, rendue homogène par agitation. Une quantité égale étant versée sur un filtre taré, on peut, après essorage et dessiccation à 105° jusqu'à poids constant, connaître la quantité de levure ensemencée.

Après fermentation, on filtre sur un filtre taré, on lave la levure sur le filtre avec une petite quantité d’eau, dont le volume est déterminé, et on complète le liquide filtré à 500 cc. Il devient dès lors facile de connaître Le poids de levure formé, ainsi que les variations du sucre, de l'azote, etc. par comparaison avec le témoin.

Lorsqu'il s’agit de faire des expériences de comparaison, les ballons sont ensemencés avec une même quantité de levure et placés dans une étuve à température réglée.

J'ai préféré, pour apprécier l’action des corps étudiés sur le végétal levure, mesurer Le poids de la récolte plutôt que faire la numération des cellules produites. En effet, outre les causes d'erreur très manifestes inhérentes à toutes les méthodes de numération, celles-ci ne peuvent tenir compte d'un facteur

(1) La levure qui a servi à la plupart de ces expériences est une levure de vin de la collection du laboratoire de fermentations de l'Institut Pasteur, désignée par les lettres ML.

important, à savoir la grosseur relative des cellules. Cette grosseur varie dans d'assez grandes proportions, surtout avec les milieux artificiels formés de corps définis. D'autre part, connaissant le poids de levure, il est facile d’y rapporter les variations pondérales de composition du milieu employé, et les

résultats y gagnent en netteté.

Méthodes analytiques employées

J'indiquerai très brièvement les méthodes que j'ai utilisées, me réservant de donner des indications détaillées sur la méthode de dosage de l’ammoniaque que j'ai étudiée et que j'ai été conduit à adapter particulièrement à mes recherches.

1° Dosage du sucre. — Ce dosage a été fait au moyen d’une liqueur de Feauwc titrée, tantôt par simple décoloration, tantôt par le procédé de Lrnmann modifié par MaquENxr, avec titrage à l’hyposulfite (1).

2° Dosage de l'alcool. — On distille 50 cc. du liquide de culture, préalablement neutralisé. Le liquide recueilli, amené au volume primitif, est examiné au moyen du compte-gouttes de Duczaux (2). On peut ainsi mesurer avec une précision suffisante les petites quantités d'alcool produites.

80 Azote de la levure. — La levure recueillie sur filtre taré étant pesée, on introduit le filtre et son contenu dans un ballon, on ajoute de l'acide sulfurique, un globule de mercure, et on procède comme dans la méthode ordinaire de KJELDAHL.

4° Azote total du liquide. — Ce dosage est fait comme ei-dessus, sur 950 ec. du liquide préalablement évaporés au bain de sable en présence d'un peu d'acide sulfurique.

5° Dosage de l'azote ammoniacal. — Ce dosage est particulièrement délicat, car il doit être effectué souvent en présence de matières azotées facilement décomposables, amides, pro- :

(1) Maouenne, Bull. Soc. Chimique, 3e sér., t. 49, p. 926 (1898). (2) E. Ducraux, Ann. Chim. et Physique, 5e sér., 1. 2, p. 233 (1874).

duits d’autolyse mal connus, susceptibles de dégager de l’ammoniaque si on opère sans précautions spéciales. Les résultats obtenus ne peuvent prendre leur valeur que si ce dosage est rigoureux ; j'y ai donc apporté des soins tout particuliers.

J'ai d’abord essayé, pour le dosage de l’ammoniaque en présence d’urée (celle-ci étant la plus facilement altérable des amides étudiées) la distillation avec la magnésie.

La magnésie employée a été chauffée au rouge sombre, au four à moufle, dans des capsules plates, afin de chasser l’ammoniaque qui peut s’y trouver. Après un temps suffisant, on laisse refroidir et on enferme la poudre encore très chaude dans des flacons séchés à 105° et encore chauds.

L'urée utilisée avait été recristallisée à plusieurs reprises dans l'alcool chaud. Sa solution dans l’eau ne donnait absolument rien avec le réactif de NessLer.

J'ai fait alors les essais suivants :

&) 5 grammes de magnésie sont bouillis avec 300 cc. d'eau redistillée dans Le ballon de l'appareil ScaLœæsin6 ; on recueille dans 10 ce. d'acide sulfurique décime. Après titrage, on ne trouve pas la plus légère trace d’ammoniaque.

b) 5 grammes de magnésie et 10 cc. d’une solution d'urée à environ 8,70 p. 100 sont bouillis avec 300 cc. d'eau pendant une demi-heure; on recueille { mgr. 80 d'azote ammoniacal. Le dosage de l'azote dans la solution d’urée, par hydrolyse sulfurique et distillation, indique 32 mgr. 90 d’azote pour les 10 cc. employés. Au bout d'une demi-heure de distillation, la magnésie a donc dégagé environ 5,5 p. 100 de l'azote de Purée:

J'ai alors essayé d’opérer la distillation dans le vide. D'autre part, afin de se placer dans les conditions des expériences à réaliser, il était indispensable de voir si la formation de phosphate amimoniaco-magnésien ne peut troubler le dosage.

L'expérience a été disposée de la manière suivante :

On a fait une solution A de tartrate neutre d'ammonium,une d’urée B, une autre C de phosphate ammoniaco-magnésien

dissous dans l'acide tartrique ; on a alors procédé aux dosages qui suivent :

1° On mélange 10 ce. de A, B et C, on attaque par l'acide sulfurique et on distille avec de la soude, sous la pression ordinaire.

. Trouvé : Azôbe total" 7223 94,50 mer.

% 10 ce. de solution de tartrate d'ammonium A sont bouillis avec 5 grammes de magnésie et une quantité suffisante d'eau, dans le vide, à une température de 40° à 45°.

NrOte See 11,30 mgr.

3° 10 cc. de solution d’urée B, hydrolysés par l’acide sulfurique, sont distillés avec de la soude, sous la pression ordi-

naire.

AZOIER SET 37,80 mgr.

4° 10 cc. de solution À et 10 cc. de solution B' sont distillés avec la magnésie, dans le vide.

AZOte = :. . 41,30 mgr.

La distillation dans le vide en présence de magnésie n’altère donc pas l’urée. D'ailleurs, le résidu, repris et hydrolysé par l'acide sulfurique, donne par distillation avec la soude :

ATOS LICE 37,33 mgr. (1)

50 10 cc. de solution de phosphate ammoniaco-magnésien C sont distillés avec de la soude tant qu'il passe de l’ammoniaque.

ATOÉEL TE nr te 16,10 mgr.

6° 10 cc. de chacune des trois solutions À, B et C sont bouillis en présence de magnésie, dans le vide, à 40°-45.

ArDteS RER A9,70 mgr.

La quantité totale d'azote ammoniacal étant de 41,30 + 16,10

(1) Au lieu de 37,80 mgr.

— 97,40 mgr., on voit que le phosphate ammoniaco-magnésien ne subit qu’une décomposition partielle dans ces conditions. La méthode n'est pas applicable, par conséquent, au dosage de l'azote ammoniacal en présence de phosphates, mais elle s'applique au contraire parfaitement si on prend soin d'éliminer au préalable l'acide phosphorique. J'ai suivi, dans ce but, les indications de Frésénius (1).

Voici finalement le mode opératoire auquel je me suis arrêté : À 50 ou 100 cc. du liquide en expérience, exactement mesurés, on ajoute quelques gouttes d’acide chlorhydrique pur, puis de l’acétate neutre de plomb, en solution à 10 p. 100, jusqu'à cessation de précipité. On ajoute alors un peu de carbonate de plomb en poudre fine, on agite et on laisse digérer pendant 15 à 18 heures. On jette sur filtre, on lave soigneusement le dépôt à l’eau froide; le liquide renferme tout l’azote ammoniacal. Ÿ

Ce liquide est introduit avec 5 gr. de magnésie dans un ballon à fond rond, muni latéralement d’une tubulure très courte, par laquelle plonge un tube effilé, relié au moyen d’un caout-

chouc épais avec le tube de rentrée d’air. Ce dernier est luimême en relation avec un barboteur contenant de l’acide sulfurique au 1/4 destiné à arrêter les traces d’ammoniaque contenues dans Fair. Le caoutchouc porte une pince à vis qui permet de régler la rentrée de l'air.

Le ballon étant adapté à un appareil de ScaLæsiNG-AuBin, on fixe au réfrigérant vertical de celui-ci un tube de verre à ampoule qui plonge dans une fiole conique en verre épais contenant une quantité exactement connue et en excès d'acide sulfu-

-rique titré (10 cc. d'acide normal). On fait le vide par la tubulure latérale de cette fiole et on chauffe le ballon au bain-

marie. On règle alors la rentrée d'air de façon à obtenir des bulles capables d'entretenir une ébullition assez calme, tout en maintenant la magnésie en suspension. On recueille environ

(1) Frésénius, Traité d'analyse chimique quantitative, trad. Gautier, Te éd. fr., Paris, p. 348. ‘

Hd —

120 à 150 ce. de liquide, ce qui demande à peu près 35 à 40 minutes, en ayant soin de refroidir convenablement le réfrigérant par un courant d’eau suffisant (fig. 1).

D A TP WW 4 WW LL LL D Fig. 1. — Appareil pour le dosage de l'ammoniaque.

Le contenu de la fiole conique est alors versé dans un ballon Jaugé de 250 cc. ; on complète jusqu'au trait avec le liquide de lavage et on titre à la soude décime sur 25 à 59 ce. Le titrage est fait à une température voisine de l’ébullition, avec le tournesol d’orcine comme indicateur. Il est bon de faire au préalable un essai à blanc pour vérifier la concordance des liqueurs titrées.

Voici le résultat d'une expérience de contrôle faite par ce procédé, On a préparé trois solutions : À de tartrate neutre d'ammonium, B d’urée, C de phosphate ammoniaco-magnésien (dans l'acide tartrique).

mer. mer.

d'azote d'azote

[. — 10 cc. de À, distillés avec la soude ne

sion ordinaire). ... - 96,6 IL. — 10 cc. de B, hydrolysés et dotés avec “7e

la ide (pression ordinaire) . . . 100,1 AE TT. —10 cc. de C, distillés avec la soude ie

sion ordinaire). . . EU 14,7 IV. — 10 cc. de À, distillés avec L magnésie

(dans le vide) . . 96,6 V. — 10 cc. de À + 10 ce. de B, avec Fe magné-

sie (dans le vide). . . 96,6 VI. — 10 ce. de À, B etC, hydrolysés 2: distillés

comme en [El -.. . . 211,1 VIH —10cc. de À, B et C, par la A thiode de

quée ci-dessus. . . PA VIIT. — Le résidu de Vil, Fe hyarolys

-et distillé avec É soude. —. ‘; 99,4

on voit donc que l'azote ammoniacal est obtenu en totalité par cette méthode.-Le petit excès du dosage VIT sur la somme FE + HT, qui n'atteint que 0,7 mgr., correspond à un demidixième de centimètre cube de soude décime; il ne dépasse donc pas l'erreur possible de lecture. On trouve aussi qu'il y à en VIII, par comparaison avec le dosage IT, une perte de 0,7 mgr. d'azote, correspondant à la même erreur. Il n’est d’ailleurs guère possible d’évaporer le résidu de la distillation du dosage VIT, attaquer par l'acide sulfurique et distiller avec la soude sans s’exposer dans une epération si longue à une perte légère. En tout cas, Je ne pense pas que la différence observée puisse être attribuée à une décomposition de l'urée - dans l'opération VII. Cette décomposition, si même elle était prouvée, serait d’ailleurs de l’ordre des erreurs de lecture et si infime qu’elle ne pourrait être considérée comme nuisant à lexactitude du dosage (2).

(1) Au lieu de la somme de Let IT, qui est de 96,6 + 14,7 = 111,3. (2) Cette méthode, étudiée par moi en 1898, a été utilisée pour les recher-

ES

Recherches faites avec l’urée

Si la levure utilise de préférence comme aliments azotés Les. corps capables de se transformer facilement en dérivés ammoniacaux, elle doit pouvoir se développer aux dépens de l’urée, qui subit si aisément l'hydrolyse en donnant du carbonate d'ammonium.

Les seules données expérimentales “te existent sur ce sujet sont celles de Mayer (1) et de Bewerincx (2). Le premier admet que l'urée peut servir d'aliment à la levure, bien que la fermentation obtenue soit très lente ; le second pense qu'elle n’est pas utilisable par ce végétal. D'autre part, Pasteur avait montré que l’albumine ne convient pas à la levure en vie anaérobie, Mayer trouvant, au contraire, que le sérum sanguin permet la fermentation. Les aliments azotés seraient donc parmi les matériaux dialysables du sérum : c’est justement l’urée qui en forme la partie principale (0 gr. 15 à 0 gr. 30 par litre).

La question devait donc. être reprise en entier. J'ai fait d'abord une expérience préliminaire, disposée comme suit :

On dissout dans 500 à 600 cc. d’eau 100 grammes de glucose, 5 grammes de phosphate bipotassique, 1 gramme de sulfate de magnésium, 2 grammes d'acide tartrique, en chauffant légère-ment; le liquide bien refroidi est additionné de 1 gramme durée, le volume complété à 1 litre. On filtre à la bougie eton reçoit dans un ballon d'environ 1.500 cc., puis on ensemence avec une petite quantité de levure pure (cette quantité n’a pas

ches qui vont être exposées jei dès le début de 1899. Je dois faire remarquer que, pendant l’exécution de ces expériences. Nencki et Zaceski ont publié une méthode de dosage de l’ammoniaque, basée sur le même principe et. applicable à l'étude du sang et des tissus (Zeëts. physiol Chemie, t. 33, p. 193, 1901). L'appareil que j'ai employé a l'avantage d’une grande simplicité et permet d'utiliser le Were de ScHLæsiING-Ausin qui existe dans tousles laboratoires.

-(1) A. Mayer, Untersuchungen u. d. alkool. Gährung (1863). Cité par Duccaux, Traité de Microbiologie, t. 3, p. 205.

(2) Beueriner, Centralbl. f. Bahter., t. A, p. 68 (1892).

Ed

été déterminée, mais elle ne dépassait certainement pas 0 gr. 05 à l’état sec). Le ballon est placé à l'étuve à 25°.

Dans ces conditions, la fermentation est très lente et se poursuit pendant des semaines ; la quantité de levure parait augmenter assez peu. Après 45 jours, le liquide à été examiné : voici les chiffres trouvés : à

Avant Après

fermentation fermentation CAUROSE SERRE Re TT 97 gr. Al gr. 77 RICODIR RATE En Ce » 38 CC.

ACIDE ACÉTIQUEL DEN Lo. » Ogre. 633 Urée. TS mars de 1 gr. 08 4 gr. 05 (1) Azote total du liquide. .'. . O gr. 504 0 gr. 500 Azote total de la levure . : . » 0 gr. 0066 Poids de levure formée , . . » 0 gr. 120

Il s’est donc formé peu de levure, dont la teneur en azote était de 5,48 p. 100 ; la consommation de l’urée n’a été que de 0 gr. 030, soit 1/36 de la quantité présente. J'ajoute qu'il ne s'était pas fait d'azote ammoniacal décelable dans le liquide fermenté. Néanmoins, la plus grande partie du sucre à été transformée en alcool.

Ce résultat, assez peu encourageant, correspond aux données anciennes. Mais il faut remarquer que, dans l'expérience précédente, l'épaisseur du liquide était considérable ; il parait done indiqué de recommencer en mettant le liquide en couche mince et en opérant dans des conditions d'aération qui puissent favoriser le développement de la levure végétal.

Une solution contenant 10 p. 100 de glucose, 0,25 p. 100 de phosphate bipotassique et 0,05 p. 100 de sulfate de magnésium est additionnée à froid d’une solution d'urée de manière à ce que la teneur du milieu en urée soit d'environ 1 gramme par litre. On stérilise la solution par filtration à la bougie et on l'introduit aseptiquement dans des ballons à fond plat, où le liquide occupe une épaisseur d'environ 2 à 3 centimètres, cha-

(1) Ces chiffres ont été déterminés gazométriquement à l'hypobromite par comparaison avec une solution d’urée titrée à 1 p. 1000. Les quantités sont rapportées au volume total de 4.000 cc. 25

que ballon contenant exactement 300 ce. de -mibeu. Le dispositif adopté est représenté (fig. 2) ; le liquide filtré est reçu dans un ballon répartiteur contenant 300 ce. entre les deux traits de jauge. Après avoir isolé ce ballon au moyen d'une pince placée sur le caoutchouc, on peut procéder FAO ment à la répartition. L'appareil tout entier est stérilisé d’une

seule pièce à l’autoclave (1).

Dar)

Fig. 2. — Dispositif de filtration et de répartition.

L'ensemencement est fait avec 10 cc. exactement mesurés d'une émulsion de levure pure dans l’eau stérile, rendue bien homogène par l'agitation (voir p. 21). Chaque ballon a reçu ainsi 10 ce. de liquide contenant 0 gr. 0382 de levure, séchée à 105°, et À mgr. 09 d'azote, sans trace d’ammoniaque.

Voici les chiffres obtenus avant et après fermentation, rapportés à la totalité du volume d’un ballon : |

(1) La composition du liquide filtré n'étant pas la même au début et à la fin de la filtration, il est nécessaire de mélanger avant de répartir, pour éviter des erreurs dans les expériences comparatives.

GE Nif

Poids Azote Azote 0/0 Azote

Glucose Alcool delevure dela de la total du

présent formé séchée levure levure liquide

gr. cc. gr. mgr. es myr.

Témoin 29.64 » 0,0382 4,09(1) » 144,0 Après 44 jours 20,00 5,0 0,2440 7,70 3,15 140,0 Après 149 jours 13,67 8,3 0,3116 9,80 3,147 138,5

Aucun ballon ne renfermait d'azote ammoniacal.

La fermentation a été assez lente ; néanmoins la levure

emprunté à l’urée au moins 7 milligrammes d'azote, ce qui représente 1/20 de la quantité présente.

La même expérience à été refaite, mais avec des ballons Fernsaca dont le fond possédait une surface telle que la couche de liquide (dont le volume restait le même, soit 300 cc.), n'avait pas plus de 1 centimètre d'épaisseur.

On à trouvé :

Poids Azote Azole 0/0 Azote Glucose Alcool de levure de la de la total du

présent formé séchée levure levure liquide

gr. 2 gr. Tige Z mer.

Témoin 30,37 » 0,0382 4,09(2) » 147,0 Après 3 jours 24,96 3,0 0,2586 10,50 4,06 140,5 Après 6 jours 19,93 4,2 O0,2800 41,20 4,00 140,0 Après 9 jours 15395 7,3 0,3260 13,50 4,44 136,5

Aucun ballon ne contenait trace d’ammoniaque.

On voit que la fermentation est plus rapide que dans l’expérience précédente : la consommation de sucre après 9 Jours atteint presque cette fois la même valeur qu'après 19 Jours dans la fermentation précédente. Le poids de levure obtenu représente à peu près 9 fois la quantité ensemencée ; la levure est un peu plus riche en azote et elle a emprunté à l’urée de 8 à 11 milligrammes d'azote, au minimum, allant ainsi jusqu'à 1/13 de la quantité présente.

Ï y à donc amélioration, mais les résultats sont encore bien imparfaits. Je me suis demandé si on n'obtiendrait pas une meilleure utilisation de l’urée en lui ajoutant un sel ammo-

(4) Cette quantité représente l'azote des 10 cc. d’émulsion introduits, mais non l'azote de la levure ensemencée, qui n'était vraisemblablement pas supérieur à 2,5 milligrammes.

niacal, tartrate par exemple, dont la présence en stimulant la levure au début de la fermentation pourrait produire le résultat cherché.

Voici le dispositif adopté. La solution nutritive employée précédemment et contenant { gramme d’urée par litre est additionnée de tartrate neutre d'ammonium en quantité telle (0 gr. 219 par litre) que la teneur en azote ammoniacal soit de 10 milligrammes environ par ballon renfermant 300 cc. de liquide. On ajoute quelques gouttes d’une solution concentrée d'acide tartrique pour dissoudre le léger précipité formé, on filtre à la bougie et on répartit aseptiquement par portions de 300 cc. dans des ballons FervBacs. L’ensemencement est pratiqué comme ci-dessus.

On obtient les résultats suivants :

Poids Azote Azote 0/0 Azote Azote

Glucose Alcool de levure se la de la ammonia- total du présent formé séchée levure levure cal liquide

gr. ce. er : mer. RÉ mer. mer DéDrom 2 27,18 » 0,0298 1,33 4,44 8,4 154,0 Après 5 jours . 12,44 5,0 0,1664 7,00 4,20 0,7 147,6 Après 10 jours. 9:02 12,5 :20,2238, = 8,140 3,62 0; 7 A7 Après 20 jours. traces 14,0 0,2580 8,75 3,40 traces 146,5

Un témoin, conservé le même temps à l'étuve (à 27°) a montré après 20 jours la même teneur en azote ammoniacal qu'au début, soit 8 mgr. 4. Il ne se fait donc aucune hydrolyse de l’urée dans le milieu abandonné à lui-même, pendant la durée et à la température de la culture.

La fermentation est manifestement accélérée par la présence de la petite quantité d'azote ammoniacal introduite. Comme on le sait déjà depuis Duccaux (1), cette forme d'azote est absorbée avec énergie par la levure, dès le début de la fermentation, et à partir du cinquième jour on n'en trouve déjà presque plus : cependant il en reste une faible quantité, semble-t-il, jusqu'à la fin. On peut noter que le rendement en levure n’est pas meilleur que dans les expériences précédentes ; ceci justifie en

(1) Ducraux, Thèse, Paris 4865.

quelque sorte l'opinion exprimée par Ducraux (1) au sujet de l’ammoniaque, qu'il considère comme défavorable à la levure végétal, mais favorable à la levure ferment.

Ce qui, à mon sens, ressort de plus important des chiffres qui viennent d'être cités, c'est que la levure paraît bien avoir déjà consommé de l’urée alors qu'il reste encore de l’ammoniaque non absorbée. Mais les quantités sont faibles et l’expérence à plutôt la valeur d'une indication que d’une démonstration.

Pour arriver à de meilleurs résultats, il fallait évidemment améliorer les conditions d'existence de la levure en modifiant le milieu nutritif. Je mentionne à titre de renseignement l’expérence suivante, dans laquelle le saccharose à été comparé au glucose, la préparation du milieu n’aÿant subi aucune autre

modification :

Poids Azole Azote0/0 Azote

Sucre Alcool aelevure dela dela total du

présent formé séchée levure levure liquide

c ut. : ce ér. mg 1e mer À Milieu TÉMOINS 029,30 DOUCE DAC DEC" à glucose après 15 jours . 10,00 555 0,2009 7,2 3,6 140,0 Milieu à (témoin . . . 34,00(2) » O0.0465 1,0 6,0 146,5 ere après 15 jours . 16,76(2) 3,7 00964298 03:01" 7143,5

Le résultat est manifestement défavorable au saccharose. Il est à remarquer que Hansreex (3), nourrissant de jeunes plantes phanérogames (Lemna minor L., Vicia faba L., Ricinus communis L.), avec de l'urée, en présence, soit de glucose, soit de saccharose, a obtenu dans les deux cas une bonne assimilation de l'aliment azoté. | | Je n'ai pas continué dans cette voie, mais J'ai songé alors à modifier la concentration en sucre. Des essais faits sur un plus petit volume de milieu, avec différentes teneurs en glucose, 5, 10, 15, 20 et 25 p. 100, m'ont prouvé que cette concentration

(1) Ducraux, Traité de Microbiologie, t. 3, p. 197 (1900).

(2) Calculé en saccharose. Il restait encore 1 gr. 46 de saccharose non interverti après 15 jours, ce qui indique une sucrase peu active. (3) Hawsreex, Jahresber. f. wissenschaftl. Botanik, t. 33, p. 417 (1899).

TaomaAs 3

joue un rôle très important dans la rapidité du développement. et la quantité de levure formée. Ainsi, on à obtenu, avec un

ensemencement uniforme de 0 gr. 029 de levure, après 5 Jours :

Glucose 0/0 : 5) EAU 15 20 25 Poids de levure .… . Ogr.135 Ogr.160 Ogr.366 Ogr.452 Ogr. 418 Sucre restant, en 0/0

de la quantité pri-

ALU VONE PRE Te 36 4 17 8 15

La teneur de 20 0/0 paraissant nettement la plus favorable, j'ai été conduit à modifier la composition du milieu nutritif, qui a été dès lors préparé de la manière indiquée plus haut (p. 20), c’est-à-dire en stérilisant par chauffage, dans les ballons, la solution glucosée avec les sels minéraux.et ajoutant après refroidissement complet la solution, stérilisée par filtration à la bougie, du corps azoté en expérience.

Il paraissait maintenant indiqué d'examiner l’action de doses variables d'urée. D'autre part, et pour avoir un‘point de repère, j'ai comparé l’action de ces doses à celle de quantités correspondantes d’ammoniaque. J'ai choisi comme sel ammoniacal le bicarbonate, en raison de ses rapports étroits avec l’urée. Ge sel présente l'avantage de ne pouvoir laisser dans le liquide par sa décomposition un acide capable de troubler Les résultats en changeant la nature du milieu.

De plus, on peut tirer de cette expérience comparative une conclusion importante : si, comme il paraît probable d'après la discussion placée en tête de ce travail (voir p. 14), l'assimilafon de l'azote organique des amides revient en définitive à une forination préalable d'ammoniaque, on doit trouver un parallélisme étroit entre la fermentation produite en présence d’urée et celle qui à lieu en présence du sel ammoniacal correspondant, le bicarbonate d'’ammonium.

Dans trois ballons contenant chacun 300 ec. de solution minérale glucosée, on introduit respectivement 10 ce., 20 ce., 30 cc. de solution d’urée à 2 0/0, stérilisée à froid ; dans trois autres, 10 cc., 20 cc. et 30 ce. d’une solution de bicarbonate d'ammonium à 4 0/0, également stérilisée à froid. Les six ballons

AR

reçoivent chacun 10 ce. d’une émulsion de levure lavée à l’eau stérile, contenant 0 gr. 209 de levure séchée à 105°, avec 11 mgr. 2 d'azote, soit une teneur de 5,36 0/0. La fermentation dure environ 10 jours, au bout desquels l'expérience est interrompue. On trouve les chiffres suivants :

o rc) A £ ol Lx!

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410 ec, ee Fu av. 58.00 71 mgr. 1,50

2.20 cc ed 58,00! » 0,2090| 11,2 15,36 » 155 154 mgr. N )ap.| 1:40) 30,7) 08341! 42/7 [3 00| », 123

3. 30 cc. Sn av.| 58,00| » | 0,2090! 41,2 [5,36| » 232 934 mgr. N /ap.l 1,50! 31,5! 0 9080! 43.0 |4.96| » 197

4. 10ce COSHNH4 » | 0,2090| 11,2 |5,36| 67 68 61 mgr. Na 35,0! 0:8418| 31.0 |6.06| 0 28

5. 20 ce CO*HNH* » 0,2090| 11,2 15,36| 134 135 134 mgr. N ou 30,0] 08402! 5824 |6,91| 17 88

6. ÉD ». | 0,2090! 14,2 |3,36| 201 202 Of mgr N 28,0! 0,8749| 59,5 |6,80| 80 154

Il est intéressant de constater que la presque totalité du sucre à disparu sans qu'il y ait de différence notable entre la série à urée et celle à bicarbonate d'ammonium. Peu de différence également dans les poids de levure obtenus, qui augmentent dans chaque série avec la richesse en azote, mais assez ‘faiblement, Cette richesse en azote, qui croit dans le rapport de 1,2 et 3, n'influe guère sur la teneur 0/0 d'azote de la levure. On voit que dès le second ballon de chaque série il y a un excès notable d'azote.

L'utilisation de l’urée est très bonne : la levure a gardé 30 milligrammes d'azote (sur 77 mgr. fournis) dans le premier ballon. Elle en a consommé bien davantage, si on songe à l'azote d’abord fixé puis éliminé dans le liquide comme pro-

duit d’excrétion, et qu'il n'est pas possible de connaitre d’une manière exacte, mais dont la quantité est certainement importante. En effet, dans le ballon 4, les 67 mgr. d'azote ammoniacal fournis ont été assimilés en totalité, puisqu'il n’en reste pas ; or, la levure a seulement conservé 40 mgr. d'azote, en chiffres ronds. Dans le ballon 5, sur 117 mgr. d'azote ammoniacal utilisés, on ne retrouve que 47 mgr. dans la levure.

Bien entendu, les produits de l’activité cellulaire se retrouvent tous dans le liquide de culture ; non seulement leur isolement est impossible, mais on ne peut tenter dans un tel liquide un dosage précis de l'urée employée, sinon par des méthodes compliquées. L'intérêt de ce dosage est d’ailleurs bien relatif. :

L'expérience a été refaite dans des conditions presque analogues à plusieurs reprises, avec des résultats très voisins. Voici les chiffres obtenus dans une expérience où la levure s'est montrée particulièrement active. Chaque ballon a reçu 0 gr. 197 de levure séchée à 105° contenant 12 mgr. 32 d’azote, soit 6,25 0/0. La fermentation a été arrêtée après 5 Jours :

glucose

formé

azote 0/0 de la levure azote total du liquide

110 cc. d'urée law.

114 mgr. N }ap.

20 cc. d’urée ( av.

228 mgr.N ap.

. 30 cc. d’urée ( av.

342 mgr. N ap.

. 10cc COSHNH, av.

87 mgr. N ap.

NO, Oo

. 20cc EN av.

174 mgr. N ap.

. 30e COSHNHS av. » | 0,497 264 mgr. N }ap 5| 29,5| 14469

270 y DES

Ici, contrairement aux résultats de l'expérience précédente, la fermentation en présence du sel ammoniacal est en avance sur celle qui a lieu en présence d’urée. La contradiction n’est qu'apparente : en effet, la présence de l’ammoniaque a toujours pour résultat d'accélérer la disparition du sucre dans les débuts de la culture, celle-ci devenant ensuite plus paresseuse.

Quoiqu'il en soit, les expériences qui viennent d’être rapportées permettent d'appuyer les conclusions suivantes, que j'avais déjà formulées en 1901 (1) :

1° Lorsqu'on offre à la levure l'azote sous forme d’urée, dans un milieu minéral sucré, la fermentation est lente pour des teneurs en glucose voisines de 10 0/0 et la prolifération des cellules reste faible ; l’assimilation de cette forme d'azote est médiocre et la levure formée est pauvre en azote.

2° Si les conditions restant les mêmes on élève la proportion de sucre à 20 0/0, la fermentation devient très rapide, Le poids de levure est plus grand, la quantité d'azote assimilé augmente beaucoup, la levure est plus riche en azote.

3° Si, toutes choses égales d’ailleurs, on introduit dans plusieurs ballons des quantités croissantes d’urée, on observe quela quantité de levure formée tend vers un maximum, ainsi que la quantité d'azote assimilé ; il en est de même, par conséquent, de la teneur centésimale de la levure en azote. Lorsque ce maximum est atteint, des quantités de plus en plus grandes d'urée n'ont plus aucune action.

4° Si on substitue à l’urée le sel ammoniacal correspondant, c’est-à-dire le bicarbonate d'ammonium, on voit que la concentration de 20 0/0 de sucre est également la pius favorable . à la bonne assimilation de l'azote. En augmentant la dose de sel ammoniacal, on voit le poids de levure, la quantité d'azote fixée et la richesse de la levure en azote s'élever et tendre également vers un-maximum, mais celui-ci est notablement plus élevé que pour l'urée.

La valeur de ce maximum dépend de la quantité de levure

(1) P. Tuomas, C. À. Acad. Sciences, t. 133, p. 312 (1901).

ensemencée, et de la nature de l'aliment agoté, Il y à vraisemblablement là un fait général : Srerx a signalé en effet (1) un fait analogue en utilisant l’asparagine comme source d’azote.

J'ajouterai à ces conclusions la suivante :

IL y a un parallélisme remarquable entre les fermentations produites dans un milieu donné, avec une levure déterminée, lorsque l'azote est fourni, tantôt sous forme d’urée, tantôt sous forme du sel ammoniacal correspondant. // est donc extrémement probable que l'assimilation de l'urée est précédée de sa transformation en ammoniaque.

Les résultats obtenus sont susceptibles d'être critiqués en raison de ce qu’ils ont été déduits d'expériences faites avec une seule espèce de levure. Afin de pouvoir les généraliser avec certitude, je Les ai comparés avec ceux que fournissent dans des conditions identiques des levures très différentes. J'ai choisi, à côté dé la levure de vin ML, les levures suivantes provenant également de la collection du laboratoire de fermentations de l'Institut Pasteur :

Désignation une levure de bière basse : . . . . Boss ne = ns haute rh Bruxelles = ON OA ER TE M J

On a stérilisé par chauffage à l’autoclave huit ballons Ferx- BAca contenant chacun 300 cc. de la solution minérale glucosée à 20 0/0 qui a déjà été utilisée; quatre de ces ballons reçoivent en plus 10 cc. d’une solution d'urée à 2,4 0/0, préalablement stérilisée par filtration, et contenant 107 mgr. d'azote, les quatre autres recevant 10 cc. d’une solution de bicarbonate d'ammonium à 6 0/0, également stérilisée par filtration et renfermant 105 mgr. d’azote.

Les quatre levures, rajeunies au préalable dans un milieu convenable (eau de touraillons sucrée), sont lavées rapidement et émulsionnées dans l’eau stérile ; on ensemence un ballon à urée et un ballon à sel ammoniacal avec 10 ce. d'émulsion de chacune des levures. Ces émulsions ont été préparées de façon

(1) Stern, J.of the chem. Society, t 79, p. 941 (1904).

à avoir des quantités assez semblables de levure dans un même volume ; l’ensemencement est ainsi comparable (quoiqu'un peu supérieur pour la levure J).

On a laissé les cultures à l’étuve à 25° ; après trois jours, les fermentations ont été interrompues et on a obtenu les chiffres

suivants :

azote 0/0 de la levure azote total du liquide

de levure de la levure

B ve

= © QC (=)

ML urée

ML COH\H"

Boss urée

Boss COSANH"

Bruxelles urée

Bruxelles COSHNH*

J » 0,3615 COHNH: 3 fs 17,0! 0,6552

Tous les ballons contenaient un excès d’aliment azoté.

Les quatre levures conservent, comme on le voit, leur caractère propre dans les milieux artificiels où on Les force à se développer : les deux levures de bière restent à développement un peu lent et font disparaitre le sucre assez peu rapidement; la levure de distillerie, au contraire, le consomme activement et prolifère beaucoup plus. Mais le caractère déjà Imdiqué, le

parallélisme étroit entre les cultures à urée et à bicarbonate

d’ammonium, persiste d’une manière frappante. D'une façon générale, on voit aussi que dans les milieux évidemment un peu trop spéciaux qu’on lui donne, la levure de récente formation, développée dans les premiers jours de la culture, est beaucoup plus riche en azote que dans la période suivante. Elle doit done être le siège de phénomènes autolytiques plus marqués que la levure qui se développe dans des milieux naturels.

Expériences avec les amides autres que l'urée

Il est intéressant d’étendre les résultats obtenus avec l’urée à d’autres amides susceptibles de servir d'aliments azotés à la levure.

En principe, la liste de ces corps peut être considérable ; cependant, il ne faut pas oublier que si Les amides sont hydrolysées par la levure suivant l'équation :

R-CONEP + 0 = NH° + R -COOH

ces corps ne pourront être utilisés qu'autant que la présence de l’acide R - COOH correspondant ne viendra pas perturber les résultats.

D’autre part, il n’est pas toujours facile d'obtenir des amides pures, ne contenant pas de traces où même de quantités notables de sels ammoniacaux, et il en est qui paraissent s'hydrolyser très rapidement dans leurs solutions aqueuses stériles. Autant de causes qui viennent restreindre la liste des corps susceptibles d'expérimentation.