CHAPITRE n

Transformations de quelques substances protéiques

sous l'influence directe de quelques

champignons parasites.

Parmi les aliments qui conviennent particulièrement bien à Talimentation des champignons inférieurs, se placent en première ligne les substances albuminoïdes. Comme tant d'autres aliments, elles ne sont assimilées qu'après avoir subi l'action de diastases qui les transforment. On désigne généralement sous le nom de protéolyse l'acte par lequel s'opèrent ces modifications digestives, sans spécifier la nature du corps protéique et celle de l'enzyme qui entrent en jeu.

Les ferments solubles protéolytiques connus à l'heure actuelle sont nombreux, et leur nombre est encore appelé à s'accroître dès que la constitution des matières albuminoïdes nous sera mieux connue. Parmi eux, il en est qui sont d'introduction assez récente, la kinase, l'érepsine, etc., mais, ce sont les plus anciennement connus qui ont plus spécialement attiré mon attention : la présure, la caséase, la trypsine, la gélatinase. On n'est pas encore complètement d'accord sur l'individualité de quelques unes de ces diastases. L'étude que j'en ai faite sur divers champignons parasites m'invitait à reprendre cette question encore obscure et mal précisée, de la spécificité de ces enzymes protéolytiques. Si la modeste contribution que j'apporte ici, n'est pas de nature à faire la lumière définitive, elle pourra néanmoins, en s'ajoutant aux résultats déjà connus, faciliter les recherches dans cette voie.

§ 1. MODIFICATIONS PHYSIQUES ET CHIMIQUES ÉPROUVÉES PAR LA CASÉINE DANS LE LAIT.

Présure et caséase sont deux diastases antagonistes dont la coexistence a été fréquemment observée chez les espèces animales ou végétalesi

Elles agissent sur une substance albuminoïde spéciale, la caséine ; la première pour la coaguler, la seconde pour la solubiliser. Leur présence simultanée dans quelques organismes vivants a de bonne heure été signalée; Duclaux (1) les a découvertes un des premiers chez les organismes inférieurs ; il les a rencontrées chez les Tyrothrix variés qui peuplent le lait exposé à l'air, et qui sont les précieux agents de l'industrie fromagère. Boullanger (2), ainsi que Geret et Hahn (3) les ont trouvées chez quelques levures, et MM. Bodin et Lenormand (4) ont révélé leur présence chez une Mucédinée parasite, la forme Oospora du ^A icrosporum da cheval. Je rappellerai aussi pour mémoire, que M. Javillier a récemment décelé la présure dans un grand nombre de Phanérogames et, chez quelques-unes d'entre elles, associée à la caséase. Je me suis demandé si cette production de présure et de caséase ne s'-eflfectuait pas chez un plus grand nombre de végétaux inférieurs, et en particulier chez les champignons parasites, si étranges par leur mode de vie, où cette étude n'a pas encore été fai^e avec toute l'amplitude qu'elle comporte.

Dans ce but, les microorganismes en question ont été ensemencés sur du lait bien pur, complètement débarrassé de sa matière grasse par un écrémage mécanique. Le lait constitue dans ces conditions un réactif propre à caractériser une action coagulante et décoagulante. Par sa composition chimique, il réalise d'ailleurs un excellent milieu de culture naturel.

Les espèces cryptogamiques que j'ai ensemencées sur lait sont les suivantes :

Aspergillus fumigatiis, Rhizopus equinus, Rliizomucor parasilicus, Miicor corymbifer, Trichophyton gypseum, Tr. violaceum, Microspormn Audouiniy Microsp, canis, Achorion Shœnleini, Ach, Quincheanurn ^ Actinomyces hovis, Streptothrix de Vallée,

Ces espèces sont mises à cultiver sur iry^% de lait dans des matras placés à l'étuve à 22". Ils y croissent rapidement en faisant subir au lait des modifications graduelles d'ordre physique et chimique, sous l'action des diastases qu'ils sécrètent.

Ces modifications, très apparentes, et faciles à observer, se produisent

(i) DccLAix : Mémoires s»»' le lait. Ann. losMtut agroDomique. 18S0. 1882. 1883. 1884.

(2) Bou.LA.NGER : Cou'riù.i.ion à l'étude de qu 'qucs levures de birc. Acn, Inst, Pasteur, t. X. p. 598, 13^6.

(3) Geret et Hahn : Ber. d. d. ch Ges., t. XXXI, p 202, 18^8.

(4) BoDiî» et Lenormand : Sur la production de caséase par un streptothrix parasite. Ann. Inst# Pasteur, t. XV, p. 285, 190li

suivant le même processus général avec toutes les espèces en expé-^ rience. Le lait s'épaissit jusqu'à la formation d'un coagulum. Ce coagulum ne devient jamais très cohérent ; il reste toujours un peu gélatineux ; puis il diminue encore de consistance et en même temps d'opacité, pour se transformer peu à peu en un liquide trouble, légèrement opalescent, ou dans certains cas, fortemement coloré. Indépendamment de toute trace d'organismes vivants, ce liquide filtré à la bougie est capable d'opérer sur un lait stérile, les mêmes transformations qu'il a lui-même subies sous l'influence directe du champignon, c'est-à-dire, coagulation, puis liquéfaction du coagulum formé. Il perd cette faculté si on le chauffe à 100'". Ce sont bien là des phénomènes purement d iastasiques ; et les champignons^n question sont évidemment producteurs de présure et de caséase.

Si, dans les grandes lignes tout se passe suivant ce shéma, on observe en réalité des variations de détail pour chaque espèce ; chacune d'elles réalisant en des temps difl*érents, et à des degrés variables, les transformations que je viens d'indiquer. La différence concerne surtout les vitesses de coagulation et de décoagulation, le degré de fermeté du coagulum, la coloration du liquide résiduel etc. Chaque espèce prend aussi sur le lait un aspect caractéristique, dit aspect cultural, qui lui est propre, et qui diffère un tant soit peu de celui qu'elle possède sur les autres milieux Uouels.

Voici en résumé, les observations que j'ai faites sur les caractères morphologiques de quelques espèces mycéliennes en végétation sur le lait, et les modifications présentées par ce dernier liquide au cours de leur développement.

Aspergillus f uniigatus. — Les qu( Iques spores tombées à la surface du lait au moment de rensemencement, y produisent un piqueté verdàtre au bout du troisième jour, et déjà le lait est coagulé. Le mycélium se développe peu à peu, forme une nappe continue, de couleur grise, tachetée de vert, puis acquiert bientôt la teinte fumée caractéristique de l'A. fumigaius. Le coagulum augmente de fermeté ; il est surmonté de la couche aqueuse du petit lait. Vers le septième jour, sa liquéfaction commence et se poursuit très apparemment } la caséine solide disparaît peu A peu et, au vingtième jour, il ne reste plus sous le mycélium qu'un liquide brun jaunâtre, contenant en suspension un reste de casé, ne, non encore solubilisée, et un dépôt formé par les sels insolubles du lait.

Rhizopus equinus. — Au bout du troisième jour qui suit Tensemencément, le mycélium s'est développé uniformément sur la surface du lait ; il forme une couche feutrée, lâche, d'une hauteur de 2 cent. 1/2 ; sa couleur est alors blanche. Au bout du quatrième jour^ le lait, est. coagulé et^^ déjà ou

peut observer une liquéfaction graduelle du coagulum qui se propage de la surface vers le fond» La culture devient entièrement grise et ne forn>e plus qu'une couche de faible épaisseur, à filaments serrés. Au bout de vingt à vingt-cinq jours, il ne reste plus qu'un liquide très mobile, rouge brun, avec un dépôt constitué par un reliquat de caséine et par des sels insolubles (phosphates).

Rhizomucor parasiticus. — Dès le cinquième jour qui suit l'ensemencement, le mycélium se présente avec un aspect floconneux, blanc, couvrant toute la surface du substratum ; puis il passe à la couleur gris de plomb et devient finalement brun fauve. La coagulation apparaît entre le septième et le dixième jour ; toutefois le coagulum manque encore de cohérence et de fermeté. Sa liquéfaction s'opère graduellement et aboutit en dernier lieu à un liquide résiduel brun foncé, presque noir.

Trlchophyton gypseum. — Sur lait, ce champignon revêt son aspect plâtreux ordinaire. La culture présente des crêtes cérébriformes, séparées par des dépressions rayonnantes qui donnent à la surface du mycélium un aspect godronné caractéristique. La coagulation apparaît ici vers le dixième jour. Le coagulum reste mou, diffluent, et se liquéfie lentement pour donner naissance à un liquide rougeâtre, limpide et très mobile.

Mucor corymblfer. — Le coagulum n'est apparu nettement que dix jours après l'ensemencement ; il n'a pas de fermeté et reste à l'état muqueux. Au bout du vingtième jour, le mycélium couvre presque toute la surface du liquide ; il a environ 1 cent, d'ép lisseur. Le coagulum est alors surmonté d'une mince couche de liquide jaunâtre, et sa liquéfaction s'effectue progressivement pour être achevée à peu près au trentième jour. A ce moment, le liquide résiduel sous-jacent est limpide, jaune ambré, avec dépôt.

Actinomyces bovls. — Au vingtième jour après l'ensemencement, le coagulum apparaît ; il est comme dans les cas précédents, fort peu consistant, et soumis à une redissolution graduelle. La croissance du champignon s'effectue assez lentement. La culture consiste d'abord en petites colonies punctiformes grisâtres, bordées de jaune ; ces petites masses finissent par confluer, et la culture présente un aspect bosselé, jaunâtre. La liquéfaction du coagulum semble assez longue, peut-être même en raison de la lenteur de la végétation ; elle n'est achevée qu'au quarante-cinquième jour environ.

La présure et la caséase sont donc indistinctement sécrétées par toutes les espèces cryptogamiques précitées, en végétation sur le lait : leur facile développement sur ce milieu en est d'ailleurs un parfait indice.

Mais, il est difficile dans ces conditions, sinon impossible, de préjuger de la quantité ou de l'activité respectives des deux diastases, présure et caséase, sécrétées par une espèce donnée. On ne saurait faire la part exacte de ce qui revient à chacune d'elles; car ce que Ton observe est une résultante de leurs deux actions coaibihéês^ Les de\x%

diastases étant antagonistes, leurs effets se masquent mutuellement'. Pour cette raison, la coagulation par la présure n'a pas ici la netteté qu'elle aurait en l'absence de caséase, car cette dernière neutralise à un moment donné, l'action présurante et finit toujours par l'emporter sur elle. Tout cela contribue à donner à l'ensemble du phénomène observé une certaine ambiguïté. Une coagulation lente n'aboutissant qu'à un coagulum mou, diffluent, ne doit pas être considérée comme l'indice d'une faible teneur en présure; elle indique seulement que la caséase est en bien plus grande abondance que la présure. On pourrait même noter une absence totale de coagulation sans être en mesure pour cela de conclure à l'absence de diastase présurante.

Les résultats que j'ai obtenus avec quelques champignons parasites, permettent néanmoins de voir qu'ils sécrètent en présence du lait, une présure très active, et en même temps, une caséase dont l'intervention s'oppose nettement à la constitution d'un coagulum ferme et permanent.

Indépendamment de ces modifications d'ordre physique, j'ai voulu voir aussi, mais sans entrer dans le détail à cause de la complexité de la question, quelles étaient les modifications chimiques éprouvées par la substance albuminoïde du lait à la suite de ces mêmes actions diastasiques. Cette incursion dans le domaine de la chimie^ se limite à la constatation de quelques réactions nécessaires pour résoudre le problème que je me propose. Toute investigation approfondie en cette matière est réservée au chimiste, qui seul a qualité poiir démêler les réactions si complexes qui se passent dans la dégradation des matières albuminoïdes.

Pour faciliter l'exposition et la compréhension de ce qui suit, il m'a paru nécessaire d'exposer brièvement ce que l'on sait actuellement des matières azotées qui entrent dans la constitution du lait, et des enzymes aptes à les modifier. La question a donné lieu à de savantes controverses ; je signalerai particulièrement, les travaux d'Arthus et Pages (1), ceux d'Hammarsten (2), qui ont mis en lumière les phénomènes de la digestion du lait par les diastases ; et surtout ceux de Duclaux dont les travaux font encore autorité, et paraissent rallier l'opinion de la plupart des savants.

Les discussions scientifiques ont surtout porté sur le nombre et l'appellation des substances albuminoïdes renfermées dans le lait. Pour les uns, il y en avait deux : (caséine et albumine) ; pour d'autres, trois î

(1) Arthos et Page* : Recherches sur l'action du labet la coagulation du lait, Arch. de physiologie, t ^I, p. 331, 1890, Recherches sur le lab*ftrment de la digestion du lait. Id. p. 4&0*

(2) Uaimarstbn : Milchzeitung^ 1875, et Zeiti physio^og. Cbemie, XXil, S, 103^

(caséine, albumine, lactoprotéine) ; enfin, certains voulaient qu^il y en eut six ou huit.

Duclaux (1) démontre à son tour, en s'appuyant sur des faits précis, que le lait normal ne renferme qu'une seule et même substance albuminoïde, la caséine. L'albumine du lait de certains auteurs ; sa lactoprotéine, (Millon et Gommailles) ou protéine du petit lait, (Hammarsten) ou encore peptones, (Kirchner) ne sont qu'une seule et même substance à des degrés divers de solution ; la caséine.

Pour Duclaux, la caséine existe dans le lait sous trois modifications différentes : solide, colloïdale et dissoute. Ces trois modifications constituent un système en équilibre stable, que peuvent modifier différents facteurs tels que : température, acidité ou alcalinité, diastases etc.. . .

Le lait normal renferme sa plus grande quantité de caséine à l'état colloïdal ; or, en cet état, les molécules de caséine ont à peu près les mêmes affinités, le même degré d'adhésion entre elles, qu'avec les molécules du solvant. Il suffira donc d'un assez faible effort pour modifier cet élat d'équilibre, et le déplacer en faveur de la forme solide ou de la forme dissoute.

C'est ce dont sont capables la présure et la caséase.

La présure aurait pour effet, non de toucher aux molécules mêmes, mais de diminuer l'espace intermoléculaire et d'augmenter l'adhésion des molécules entre elles. L'action de la caséase, inversement, diminuerait cette adhérence et augmenterait celle des molécules de caséine avec les molécules du solvant. De sorte que, en résumé, la présure agit au profit de la forme solide, et la caséase au profit de la forme dissoute. Mais les actions se contrariant mutuellement, et la caséase l'emportant en définitive sur la présure, la réaction globale marche vers une redissolution de la caséine, c'est-à-dire, vers le système le plus stable dans les conditions de l'expérience. Il se produit un nouvel état d'équilibre.

Il ne faut donc voir, somme toute, dans les changements d'ordre physique du lait sous l'action de la présure ce que les effets des variations produits dans le jeu des adhésions moléculaires (2). »

Mais, si là se borne l'action de la présure ainsi qu'on l'admet aujourd'hui, on ne sait pas au juste le rôle qu'il convient d'attribuer à la caséase.

Est-ce là une diastase bien spécifique, ayant son individualité

(1) VvCLhvt : Le Wt. Paris) 1894. BaJUière. »

(t) DocLAUJi : LoCé cit,i

propre ? ou bien est-elle identique à ses congénères qui liquéfient l'albumine et la gélatine ? D'autre part, est-ce une diaslase simple ? oïl bien représente-t-elle un complexe de diastases qui se partagent le mécanisme physico-chimique de la dislocation du coagulum de caséine, que la présure a formé sans intervenir chimiquement. ?

Duclaux ne pense pas que la caséase soit l'agent unique du procès si complexe de digestion, auquel la caséine est soumise en présence des microorganismes qui s'en nourrissent. Il admet que la caséase ne fait que liquéfier la caséine en la transformant en une substance présentant les réactions confuses des peptones ; et, que les transformations ultérieures de la caséine sont dues à d'autres diastases associées à la caséase. Sur ce point, je ne saurais mieux faire que de citer les propres phrases du savant auteur, qui sont d'une clarté remarquable, à laquelle je ne saurais prétendre dans un sujet aussi sévère :

«... La caséase se borne à rendre, nous ne savons par quel mécanisme, la caséine soluble et assimilable. Elle ne la peptonise même pas, en employant ce mot dans le sens mal défini qu'il a aujourd'hui ; à plus forte raison, elle est incapable de pousser la destruction plus loin et de donner leucine, tyrosine, urée, acide carbonique, hydrogène. Tous ces résidus variés sont des produits de la vie et de la nutrition des microbes qui ont fourni la caséase, mais non de la caséase elllemême. ... » (1)

(( ... Si nous voyons bien qu'il s'agit d'une action diastasique, nous ne savons pas s'il n'y en a qu'une ou plusieurs superposées. La question présente une certaine importance, car si elle était élucidée, elle conduirait à assimiler ou à séparer la caséase, la trypsine, la diastase qui liquéfie la gélatine, et un certain nombre d'autres diastases moins connues, disloquant plus ou moins profondément les matières albuminoïdes. Il est probable que la fibrine, la caséine, l'albumine coagulée ont chacune leur diastase décoagulante, distincte comme leur diastase coagulante. Puis, il est possible qu'amenées à l'état de peptones, elles soient toutes tributaires d'une même diastase tryptiquequi les disloque, mais cela n'est pas démontré (2). »

Telle est, en cette partie de mon étude sur les sécrétions diastasiques protéolytiques, l'importante question qui se pose et à laquelle j'essaierai d'apporter quelque contribution.

^1) DcniAix : Loc. cit.. Principes de laiterie, 4892, Pari<». Le Lait, 1894, Paris. (2) DrciAix : Lne. rit,. Traité de Microbiologie. 1899 t. II. p. fijS.

Dans les expériences qui viennent d'être rapportées plus haut, lorsque, dans le cours de la redissolution du coagulum formé par la présure on filtre le lait en voie de digestion, il passe un liquide louche, duquel l'acide trichloroacétique précipite une certaine quantité de caséine. (1) Il suffît d'une nouvelle filtration pour séparer le précipité ; le liquide passe alors limpide, sans être troublé par un excès d'acide. Mais, en revanche, il précipite abondamment par le réactif de Tanret, par une solution de tannin, et fournit à la réaction dite du biuret une coloration pourpre, analogue à celle que donnent les peptones.

A cette substance, donnant ainsi les réactions des peptones, Duclaux a donné le nom de caséone pour rappeler sa parenté avec la caséine et avec les peptones ; car il n'admet pas que la caséine ainsi modifiée soit devenue une peptone. Elle représente l'état assimilable de la caséine, son premier pas dans la voie de conversion en peptones. « Nous sommes, dit-il, si ignorants au sujet de la structure et de la propriété de la caséine initiale que nous ne pouvons suivre la façon dont l'édifice primitif se démantelle, ni dire quels sont les premiers produits de la destruction, ils sont trop compliqués. Ce n'est rien de dire que tout commence par la formation des peptones puisque nous ne savons pas Ce que c'est qu'une peptone. y> (2)

Rien n'autorise en effet, à identifier les peptones provenant de substances albuminoïdes différentes ; et c'est même là, ce qui empêche de se prononcer définitivement sur l'identité ou l'individualité des diastases digestives qui engendrent des substances à réaction de peptones.

Mais, sans vouloir l'identifîer aux peptones dont on ignore la constitution chimique exacte, on peut appeler caséone la substance qui, dérivant de la caséine, n'en a plus les réactions essentielles, mais présente au contraire celles des peptones. Ce terme de caséone, souvent employé ici, aura donc une signification bien définie.

Gela étant établi, les observations que j'ai poursuivies sur le liquide résiduel provenant de la digestion de la caséine par les Mucédinées en expérience, m'ont permis de constater une dislocation plus profonde encore, de cette substance albuminoïde.

En répétant avec une culture de deux mois environ, les réactions indiquées précédemment, j'ai remarqué que le liquide filtré ne précipite nullement ni par l'acide trichloroacétique, ni par le réactif de Tanret, ni par le tannin.

(1) Cette caséine est un reste de caséins colloi lai* ; parce que la réaction, limitée comme la plupart des réactions diastasiques. n'a pu en opérer la transformation intégrale.

(2) DiîOLAi X : loc, eit, — Principes de laiterie. — p. 73.

Il possède alors une forte réaction alcaline, et renferme une assez grande proportion de principes ammoniacaux fixes et volatils, ainsi que des produits de destruction avancée de la molécule albuminoïde, urée, leucine, tyrosine, etc.

La caséine n'y est plus décelable, même sous la forme de caséone ; elle a subi une dégradation plus profonde encore. Cette dégradation ultime, est-elle ainsi que le pense Duclaux, le fait de quelque diastase tryptiqne qui compléterait l'action de la caséase ?

Mais, pour mieux faire ressortir l'unité de ce travail dont les différents paragraphes s'enchaînent étroitement ; il me paraît indispensable de donner quelque développement à la question que je viens de poser.

Si nous sommes ici en présence d'une caséase incapable à elle seule d'edectuer tout le cycle des réactions complexes que l'on vient d'entrevoir, il reste à déterminer la diastase ou les diastases qui pourraient lui être associées pour achever l'œuvre de destruction qu'elle a ébauchée. Il se pourrait que ce fut la trypsine elle-même qui, comme on le sait, donne naissance à des termes très simples dans ses digestions. La recherche de la trypsine m'était donc indiquée.

D'autre part, l'absence de trypsine, ou bien sa présence conjointement avec celle de la caséase, constitue un fait, gros de déductions ; car il conduit inévitablement à examiner la question individualité ou identité des deux diastases.

En effet, si la diastase qui peptonise ici la caséine, peptonise également l'albumine, on pourra tout au moins en conclure que de la trypsine est associée à la caséase ; ou que peut-être, les deux diastases sont identiques. Si au contraire, la caséase est dénuée de pouvoir trypsique, on en conclura qu'elle n'est pas associée à la trypsine et qu'elle a une individualité propre, puisqu'elle ne peut se substituer à cette dernière dans les mêmes conditions.

Ces quelques considérations me semblent nécessaires pour faciliter l'interprétation des faits qui suivent ; heureux si je puis échapper au reproche facile à mériter de n'avoir pas éclairci sutlisamraent un sujet complexe et délicat.