II. — Technique

Méthodes de culture. — Il est nécessaire, si Ton veut obtenir des préparations suffisantes pour observer la structure du noyau et sa division, de prendre comme objet d'études deâ cellules jeunes et vigoureuses, dans lesquelles le protoplasme est encore dense et homogène.

Plus tard les vacuoles augmentent de volume, se fusionnent et repoussent le protoplasme veirs la périphérie de la cellule : le noyau se trouvant ainsi comprimé entre la vacuole et la membrane

(i) Poirault, dans son compte rendu de V Année biologique^ serait disposé à considérer le noyau de Wager comme un centrosome.

se déforme, se contracte et devient fort difficile à différencier ; en même temps le protoplasme et les vaclioles se remplissent de produits de nutrition qui sont susceptibles de prendre la couleur d'une manière plus intense que le nbyau et exposent à des erreurs d'interprétation, n fàut.en outre que les cellules examinées aient vécu dans un milieu très favorable afin d'éviter les phénomènes de dégénérescence précoce.

Les liqfçides que nous avons le plus souvent employés^ sont : le*liquide Pasteur et le liquide Mayer; ce sont du moins ceux qui paraissent les plus propres à la végétation des levures, sauf de très rares exceptions. Pour Fétude dés moisissures (Dematium et Oïdium) nous avons substitué à ces liquides le liquide Raulin, qui nous a paru partiôulièrement favorable à leur développement. Nous n'avoi\s jamais employé que des cultures pures. Ces liquides étaient placés dans des flacons d'Erlenmayer et stérilisés à l'autoclave •

Pour ce qui concerne les phénomènes de sporulation, nous avons utilisé quelquefois des blocs de ^ypse suivant le procédé ordinaire, mais seulement dans les cas où la formation des spores s'obtenait dîflîcilement. Cette méthode a en effet le grand inconvénient de provoquer quelquefois une dégénérescence partielle du

protoplasme et de déformer les cellules. Enfin elle ne réussit à la production des spores que lorsque les cellules ont séjourné préalablement dans un milieu très nutritif. Le meilleur procédé est la culture sur tranches de carotte suivant la méthode de Reess. La carotte constitue un milieu défavorable à la vie de la levure puisqu'elle amène la sporulation, mais qui paraît cependant très nutritif. Les cellules placées dans de telles conditions se multiplient assez abondamment, accumulent une très grande quantité de produits de réserve ei la sporulation 1^'obtient 'ordinairement très vite, au bout de deux ou trois jours. Ce procédé a l'avantage de permettre de s.uivre tout le cycle évolutif du développement d'une levure. L'étude des germinations peut aussi se faire facilement par ce mêi?ie genre de culture; en y plaçant, à l'aide d'un Mil de platine, une certaine quantité de levures ayant sporulé, et en l'y laissant quelques heures, on peut obtenir tous les stades de germination de la spore. Un autre procédé très commode consiste à mettre dans un petit cristallisoir contenant, quelques gouttes de liquide Pasteur une certaine quantité de spores. On peut également se se.rvir avec avantage des cultures sur cellules Van Tieghem ; on suit les phénomènes de germination à l'aide du microscope et dès que le développe- * ment des spores a atteint le stade que l'on veut

étudier, on enlève la lamelle recouvi;ant le 'dispositif, on laisse évaporer la gouttelette de liquide nutritif et on fixe en plongea At la lamelle dans le bain fixateur. Le défaut de cette méthode est de contracter les cellules petidant la dessiccation et de donner de mauvaises fixations.

Procédés pour recueillir les cellules. — Le moyen le plus commode et îe plus souvent employé pour l'étude des êtres mono-cellulaires est la méthode des frottis : elle consiste à promener un fil de platine contenant un certain nombre de cellules sur un cover ou sur fine lame de verre, enduits d'une légère couche d'albumine afin de faciliter l'adhérence des cellules sur le verre; puis, la dessiccation faite, on plonge le cover ou la lame dans le bain fixateur. Wager a fait remarquer que ce procédé déterminait une assez forte contraction des cellules ; aussi préfère-t-il déposer une certainç couche de levure dans le bain fixateur et ne se sert de la méthod,e des frottis que pour la coloration ; nous avons constaté le même fait et comme d'autre part, il est difficile de faire des frottis humides sans perdre la plus grande partie des cellules disposées sur le cover, nous avons employé le *f)rocédé de Wager. Lorsque mos levures provenaient de cultures sur carotte, nous raclions à l'aide d'un scalpel la couche de levure déposée

sur' le substratum et nous la placions dans le bain fixateur. Pour les cultures en milieu liquide, l'opération est plus compliquée et nous devions filtrer et recueillir le résidu. Malgré cela, nous avons presque toujours observé que l'emploi des frottis même après la fixation offrait de sérieux inconvénients. Il amène tbujojirs une contraction de la cellule, et soit par suite de cette contraction, soit que la pénétration soit entravée, une partie de la surface de contact adhérente au cover ne recevant pas la couleur, les colorations ne soat jamais très bonnes. Nous avons pu n^ius persuader par un grand nombre d'observations que la contraction du noyau avait eu une large part dans les insuccès de beaucoup des histologistes qui ont étudié la structure des levures (t). Pour y remédier nous avons essayé de faire des cultures sur milieux solides (carotte, pomme de terre) et lorsque nous voulions examiner la culture, nous coupions une légère tranche du substratum chargé de levure que nous déposions, après avoir fixé,

(I) Il existe toujours une difféi*enee très sensible entre les préparations obtenues à Taide de la méthode des frottis (soit ayant, soit après la fixation) et celles qu*on a faites par les procédés que nc^s indiquons. Dans les premières, Ife' noyau très contracté^ a un aspect presque toujours homogène; dans les secondes au contraire, il montre une structure distincte.

dans le bain colorant, puis dans le bain décolorant et l'opération terminée nous raclions la couche de levure qui remplissait ce substratum pour en déposer une partie sur une préparation. 'De cette façon on pouvait colorer le^ cellules sans les cjéposer sur un cover et sans s'exposer à les perdre dans le bain colorant. Un tel procédé ne nous a jamais donné de résultats satisfaisants. La carotte se colore fortement et il reste sur la lamelle dm cellules de carotte mêlées aux levures, qui empêchent d'avoir des préparations suffisamment nettes. D'autre part, une cer^ine quantité de levure disparaît dans ces bains successifs et ce qui reste se color^ difficilement. Le procédé qui nous a donné les meilleurs résultats est le suivant : on sème dans un liquide Pasteur, eu même temps que la levure/ un champignon capable de vivre dans ce milieu sans gêner le développement de la levure, tel par exemple le Pénicillium glaucum. Au' bout de quelques jours, on prend à l'aide d'une aiguille une petite portion du mycélium, on la fixe et on la colore et il reste toujours une forte proportion de cellules de levure enchevêtrées dan^ le myéélium. Lorsqu'on a étalé le fragment de mycélium sur la lame on aperçoit très distinctement les cellules de levure dans les interstices, sans que la moisissure gêne en quoi que ce soit la netteté de la préparation.

Cette méthode compliquée ne nous a servi que dans les cas difticiles où il nous fallait chercher à différencier la structure du noyau ou étudier sa division. Dans les autres cas la méthode des frottis» après la fixation, et souvent même * avant la fixation, nous a été largement suffisante.

Fixation. — Les agents de fixation dont nous avons fait usage sont: la ahaleur, la liqueur de Flemming, le sublimé, l'alcool à 95" et les solutions aqueuses saturées d'acide picrique. La fixation par la chaleur, qui consiste à promemer les frottis pendanjL quelques instants sur une flamme, contracte fortement le protoplasme, mais malgré cela, peut donner dans certains cas des préparations suffisantes. C^tte méthode a l'avantage d'être rapide et nous l'avons employée dans des observations qui ne demandaient pas une grande précision. En comparant les divers autres fixateurs, nous avons pu constaté qu'ils étaient tous capables de donner des résultats satisfaisants. La liqueirr de Flemming n'a cependant pu être employée que rarement: elle entrave en effet les 'colorations à l'hématoxyline qui sont les seules qui permettent de différencier le noyau .d'une façon suffisamment précise. L'alcool à go"" ou à 95^* et le sublimé nous ont paru favorables : dans

î. certains cas avec la fixation par la chaleur c'est la métho*de qui permet de se rendre le mieux compte des corpuscules métactiromatiques. Les autres procédés de iixation et surtout l'acide picriquQ rendent la plupart du temps leur coloration un peu plus difficile et moins régulière. L'aleool a le désavantage de provoquer quelques contractures du protoplasme. Le lixateur qui nous a rendu le plus service et que nous recommandons le plus particulièrement pour l'étude du noyau est sans contredit Vacide picriqae en solution aqueuse concentrée! Un lavage très soigneux dans l'alcool à 70° est nécessaire.

Méthode des coupes. — Wager a employé pour la première fois, dans l'étude histologique des levures, la méthode des coupes à la paraffine. Il place une portion de levure colorée par le carmin et la nigrosine (Hartog) dans un petit flaccTn, dans lequel il versa de l'ialcool à faible degré qu'il remplace successivement par des

, alcools de plus en plus forts, du xylol, et enfin de la. paraffine, sans vider le contenu de levure renferiùé au fond du flacon. Lorsque les levures ont séjourné pendant un temps suffisant dans la paraffine pure, il solidifie cette paraffine,

• casse le flacon et place un morceau du bloc ainsi obtenu sur le microtome.

Nous avons repris cette méthode tant chez « les levures et chez les moisissures,* et nous l'avons essayée avec un certain nombre de colorants (hématoxyline de Heidenhain, hémalun, carmin et nigrosine, violet de gentiaup, etc.). Les coupes s'effectuent assez facilement; il y a peu de contraction dans les cellules et les résultats sont souvent satisfaisants. Nous n'avons, il est vrai, jamais obtejiu à l'aide de cette méthode des préparations supérieures à celles que nous ont données les levures colorées sans avoir préalablement été coupées.. Néanmoins le procédé es,t intéressant, il sert de contrôle dans les interprétations délicates et nous l'avons utilisé fréquemment.

Colorations. — Les colorations et surtout celles du noyau sont fort difficiles et cette difficulté provient de la forte colorabilité du protoplasme et de la présence d'un grand nombre de granulée qui fixent les matières colorantes, plus énergiquement que le noyau, et que nous apprendrons à connaître sous le , nom de corpuscules métachromatiques. Aussi est-il très délicat de différencier ces granules des noyaux et afin de ne pas nous exposer à de fausses interprétations, avons-nous jugé indispensable d'employer un très grand nombre de * colorants et de comparer leurs effets.

Les colorants spécifiques de la nucléine (vert de méthyle, safranine), de même que le violet de gentiane et la fuschine, sont susceptibles de donner dans certains cas de bonnes préparations, mais la plupart du temps ils offrent des résultats insuffisants. Le carmin boracique ne différencie ordinairement pas le noyau. Le carmin de Meyer et la nigrosine suivant la méthode de Haçtog sont quelquefois d'un bon secours. La nigrosine employée seule eât également susceptible de colorer le noyau. Le bleu de toluidine (Maire) colore en rouge intense les corpjiscules métachromatiques et laisse parfois apercevoir le noyau en bleu sombre.

Les méthodes de Wager (vert de métliylène et fuschine, éosine et bleu de méthylène, bleu de méthylène et fuschine), nous ont paru tout à fait défavorables à Tinterprétation de la structure des levures ainsi qu'on le verra dans la suite ; elles ne permettent pas de différencier le noyau des corpuscules métachromatiques dont elles ne laissent pas apercevoir la coloration caractéristique .

Le rouge dc^ Magenta nous a fourni quelquefois d'excellentQS différenciations nucléaires : les corpuscules métachromatiques et le protoplasme se décoloraient et le noyau apparaissait en rouge.

Mais les colorants qui nous ont donné les

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résultats les plus instructifs sont le bleu de métylène et rhématoxyline.

Le bleu de méthylène^ employé en solution aqueuse à i p. loo, colore le protoplasme en bleu clair et donne aux corpiiscules métachromatiques une teinte Variant du bleu intense légèrement yiolet au rouge vif. Le noyau se différencie quelquefois en bleu un peu» plus sombre que le protoplasme. # Le bleu polychrome d'Unna produit encore de plus belles colorations, mais qui se conservent- plus difficilement : le protoplasme acquiert une teinte bleu pâle, et les corpuscules métacliromdtiqugs se colorent toujours en rouge étincelant. Le bleu Borel (Laveran) ne différencie ordinairement pas les noyaux et n'offre pas des résultats supérieurs à ceux obtenus par le bleu de méthylène pour ce qui regarde les, corpuscules métachromatiques. Ces trois colorants feont les plus utiles pour l'étude du protoplasme et des coçpuscules métachronpiatiques.

Le noyau au contraire ne se différencie clairement qu'avec les colorants hématoxyliques, surtout après, fixation à Pacide» picrique. Les hémat<?xylines de Delafield et G-renacher fournissent des résultats satisfaisants, mais nous nous sommes mieux trouvé de l'hématoxyline de Bœhmer. On emploie des solutions diluées et on laisse l'objet pendant un temps qui varie

d -une demi-heure à vingt-quatre heures; puis on lave pendant vingt-qusitre heures dans une solution à I p. loo d'alun. Les corpuscules métachromatiques se décolorent en grande partie; le noyau apparaît dans une teinte bleu foncpe. • '

Uhémalun fournit des résultats équivalents en ce qui concerne le noyau, mais a Tavantage d'être beaucoup plus- rapide et de différencier à la lois les corpuscules métachromatiques et le noyau. La coloration dure dix minutes ou une demi-heure an maximum et on lave quelques instants à l'eàu distillée. Le noyau se dilîérencie du protoplasme bleu clair en bleu mat un peu plus sombre. Dans les cas les plus favorables, on aperçoit les détails de sa structure. Enfin les corpuscules métacliromatiques restent colorés en rouge sombre.

Le procédé qui nous a donné les plus belles préparations pour le noyau, est rhématoxy- Une au fer de Heidenhain. Il consiste à mordancér pendant une durée de temps qui varie de quatre à six heures dans une solution de fer ammoniacal à 2 7a p* 100. On lave à grande eau et on colore pendant vingt-quatre heures dans une solution d'hématoxyline à i p. 100. On décolore dans la solution d'alun de fer.

On obtient par ce procédé des préparations où Ton distingue avec la plus grande netteté

-Soles noyaux avec leur structure et les phases de leur division, qui se. détachent en noir sur un protoplasme incolore. Pour avoir une netteté encore plus grande, il est facile de colorer le protoplasme avec Téosine, Les corpuscules métachroihatiques se colorent également en ûoir, mais Talun de fer les décolore généralement avant le noyau. Malheureusement cette méthode donne des résultats très irréguliers et à côté de très bonnes préparations elle peut produire, sans qu'on en connaisse bien la raispn, des colorations anormales qui ont eyposé les auteurs à de graves confusions ; aussi afin de remédier à cet inconvénient, avons-nous toujours comparé les résultats que nous obtenions à l'aide de ce procédé à ce que nous donnait rhémalun dans les mêmes circonstances.

Conservation des préparations. — Il est très difficile de conserver les préparations; celleç qui sont colorées par Thémalun ou par Thématoxyline au fer peuvent se maintenir assez longtemps sans s'altérer; il est au contraire impossible de conserver les préparations obtenues à l'aide du bleu de méthylène ou du bleu polychrome, car les corpuscules métachromatiques perdent très facilement leur coloration, dans quelque substance qu'on les place.

Nous avons essayé pour les premières le

baume de Canada, mais ce procédé détermine ifne grande contraction des cellules et surtout des noyaux qui perdent leurs caractères dfe structure.

La glycérine gélatinée contracte beaucoup moins, et .c'est la méthode que nou3 avons adoptée.

Nous nous sommes mieux trouvé encore de la glycéj'ine aqueuse ; malheureusement, elle décolore assez vite les préparations et ne permet guère de les conserver plus de quelques mois.