LOCALISATION DES TANNINS

Bichromate de K à 3 0/0. — C'est le réactif qui donne les meilleurs résultats pour la recherche du tannin et sa localisation dans les tissus et à l’intérieur des cellules.

On peut l’employer seul : les jeunes plantules fraîches sont placées entières ou par fragments dans une assez grande quantité de bichromate; au bout de quelques heures, l’épiderme prend une teinte jaune brun dans toute l’étendue de la zone tannifère. L'examen au microscope montre des masses jaune brun, précipitées dans les vacuoles de toutes les cellules à tannin, mais on remarque que les réseaux, si fréquents dans

(1) Cette différence de perméabilité aux colorants vitaux s'observe également pour l’embryon de la graine, bien qu'il n’ait pas encore de fonction absorbante

marquée.

les cellules vivantes ne se retrouvent plus après l’action du réactif : les trabécules sont rompus et remplacés par des alignements de globules, libres ou précipités dans des vacuoles.

Au contraire, si l’on mélange du formol à 40 o/o avec Île bichromate, dans la proportion du fixateur de Regaud, on obtient une image très fidèle du vacuome, dont les réseaux même très délicats sont conservés tels qu'ils étaient dans la cellule vivante. Comme ces réseaux se trouvent colorés en brun par l'effet du bichromate, il en résulte que ce réactif est précieux dans l'étude des cellules à tannin. Nous avons vérifié que la localisation est lai même que si l’on emploie le bichromate seul. Enfin, au lieu de faire l'essai des tannins dans le bichromate formol, mélange qui se trouble rapidement, il vaut mieux fixer au préalable des plantules dans du formol à ho o/o, puis les traiter ensuite par le bichromate. Il est facile, en opérant de cette façon, de fixer une série complète de plantules par le formol, puis de faire la recherche du tannin plus tard au moyen du bichromate. Il devient facile alors de connaître sur quelles plantules apparaît le tannin et quelles sont les lois qui président à la transformation d'un épiderme indifférencié en un épiderme sécréteur.

Règles d'apparition du lannin. — On constate que l'embryon de la graine est complètement dépourvu de tannin et que les très jeunes plantules demeurent également complètement incolores dans le bichromate. (Stade de plantule très jeune, coque de la graine non ouverte). Dès que la coque de la graine s’est ouverte sous l'effet de la poussée germinative, le tannin se montre dans les cellules épidermiques de la radicule. Dans l’'hypocotyle et dans les cotylédons, l’'épiderme ne brunit pas encore et l'examen microscopique des cellules n’y montre pas de précipitations brunes. Seuls les tubes sécréteurs (1) sous épidermiques se colorent et apparaissent comme de courtes

(r) Ces tubes sécréteurs ont été signalés chez les plantules de Gymnospermes par M. Chauveaud,

lignes brunes; on constate au microscope que les tubes sont déjà assez allongés, mais qu'ils ne se colorent pas dans toute leur étendue.

Sur une plantule un peu plus âgée, les tubes sécréteurs sont plus longs. L'épiderme de la radicule se colore comme précédemment, mais en outre, la base de l’hypocotyle commence à son tour à devenir sécrétrice. Plus tard, l'hypocotyle tout entier devient tannifère, puis la base des cotylédons.

L'extrème pointe des cotylédons reste longtemps dépourvue de tannin et reste blanchâtre après l’action du bichromate jusque dans les plantules ayant 2 ou 3 em. de longueur, c'est-à-dire à peu près tant que les cotylédons ont un rôle absorbant au contact de l’endosperme.

Lorsque les cotylédons sont proches de leur épanouissement, on peut faire quelques remarques sur la répartition du tannin dans l’épiderme : toutes les cellules épidermiques de la face externe ou des faces internes du cotylédon sont tannifères, à l'exception toutefois des cellules stomatiques qui se détachent en clair sur l’épiderme coloré en brun par le bichromate ; (1) Ily a des tubes sécréteurs sous épidermiques sur les trois faces (Essai au moyen de bichromate pendant 48 heures).

Dans l’hypocotyle, de même, le bichromate montre du tannin dans toutes les cellules sauf dans les cellules stomatiques.

Cette abondance du tannin dans l’épiderme des jeunes plantules donne toute sa valeur à nos observations relatées précédemment sur les colorations vitales. En effet, si l'on fait exception des cellules stomatiques. faciles à distinguer grâce à leur disposition spéciale, on voit que l’évolution des cellules épidermiques consiste dans la succession des étapes suivantes : 1° cellules à vacuome aleurique ; 2° cellules à vacuome filamenteux ou réticulé non tannifère; 3° cellules à vacuome tannifère (réticulé ou non). Un quatrième stade est constitué, nous l'avons vu, par les cellules à vacuome anthocyanifère.

(1) Elles contiennent en réalité une très petite quantité de tannin, et leur coloration vitale n’est pas métachomatique.

Acide osmique 1°/,. — Ce réactif si sensible des tannins ne peut nulleinent remplacer le bichromate dans la recherche du tannin des plantules, parce qu’il est réduit en même temps par les huiles qui sont très abondantes dans les jeunes plantules. Cependant, on arrive avec un peu d'habitude et sur des coupes tangentielles très minces d'épiderme, à distinguer la couleur noire du vacuome tannifère, de la teinte brunâtre prise par les globules d'huile. Cela suffit pour constater que la disposition des cellules tannifères se révèle identique par ce procédé à celle que montre le bichromate. D'ailleurs, lorsque la plantule a quelques centimètres, l'huile n’est plus gênante parce qu’elle est beaucoup moins abondante et l’acide osmique peut rendre exactement les mêmes services que le bichromate, car il fixe le vacuome dans ses détails (réseaux).

Sels de fer. — Le perchlorure de fer est un mauvais réactif microchimique des tannins, car il désorganise la cellule. Il colore bien les tubes sécréteurs en noir ou brun noir, mais donne de moins bons résultats dans les cellules épidermiques.

Acélolungstate de soude. — Le tannin des vacuoles ne se colore par ce réactif que lorsqu'il est en quantité notable, comme dans les vacuoles de la radicule. Il forme alors des masses de couleur jaune fauve ; dans l'hypocotyle, à l'époque où celui-ci est peu tannifère, il se précipite de petits granules qui paraissent incolores. La localisation des cellules tannifères est la même qu'avec le bichromate et l'acide osmique.

Hypochlorile de soude. — Ce réactif donne une coloration jaune citron dans les vacuoles tannifères. Dans quelques cas, la teinte prise est jaune vert très nettement. Ces colorations s’observent, bien entendu, après une action ménagée de l’'hypochlorite, car si l'effet est prolongé, il se produit comme l'on sait une destruction complète du contenu cellulaire. Ce réactif est considéré comme indiquant la présence d'acide

ellagique.

Réactif de Courtonne. — (Acétate neutre de plomb). = Après un contact de 24 heures, on constate un précipité jaune grisâtre dans les cellules tannifères de l’hypocotyle. Ce réactif donne au contraire un précipité formé de petits grains verts dans les vacuoles à anthocyane.

Les tubes sécréteurs se colorent en jaune grisàtre.

B. — Ktudes des autres lignées cellulaires dans la

plantule de Pin maritime,

Dans les pages précédentes, l'évolution vacuolaire a été suivie avec détail, dans un seul lissu, l’épiderme des cotylédons et de l'hypocotyle chez la plantule; il est nécessaire en effet, pour des recherches aussi délicates, de se limiter à une seule lignée cellulaire et de l'étudier complètement, car les résultats obtenus ont une importance théorique très grande qui dépasse beaucoup le simple exposé des faits : il s'agit en effet de prendre parti au sujet de questions telles que celles-ci : les vacuoles constituent-elles un système d'éléments autonomes? peuvent elles apparaître de novo dans un cytoplasme précédemment homogène? L'évolution de l'aleurone telle que nous venons de la décrire, prouve nettement que les vacuoles dérivent toujours d'autres vacuoles ou de corpuscules vacuolaires préexistants, et que par conséquent elles ne se forment jamais de novo.

Les autres tissus de l'embryon du Pin, renfermant des grains d’aleurone tout comme l'épiderme; il est déjà certain par analogie que ces grains se transforment en vacuoles pendant la germination, mais il est naturellement plus difficile de suivre leur évolution au moyen de colorations vitales, car il est nécessaire d'opérer les colorations sur des coupes. — Toutefois, il n’y a pas là une difficulté insurmontable.

Lorsque la plantule de Pin maritime est jeune, on peut facilement la séparer en deux moitiés longitudinales au moyen du rasoir. Les deux parties ainsi isolées peuvent être ensuite

colorées dans une solution de rouge neutre ou de bleu de crésyl et l’on obtient de bonnes colorations vitales dans les cellules vivantes qui se trouvent un peu au-dessous de la surface de section.

On constate de cette façon que les grains d’aleurone, au cours de leurs transformations, restent toujours colorables vitalement. Leur évolution pendant la germination consiste en une liquéfaction progressive qui aboutit au système des vacuoles de la plantule.

A ce sujet, il existe de nombreuses variantes. Dans les cellules de l'écorce et de la moelle, les grains d’'aleurone sont volumineux de forme ovale et renferment un globoïde. Lorsqu'ils se transforment en vacuoles, leur substance fondamentale devient de plus en plus liquide et le volume du grain augmente. En cet état, le grain est déjà transformé en une petite vacuole et la paroi de celle-ci, facilement dépressible, se déforme sous l’effet des pressions à son contact, d’où résultent les formes un peu irrégulières ou étoilées qu’on observe à ce moment. Le globoïde, assez longtemps visible comme une inclusion incolore, finit par disparaitre.

À mesure que le suc aleurique devient moins épais, il se montre plus facile à précipiter et dans les colorations vitales il est fréquent d'observer le dépôt de corpuscules variés, très colorés, qui s'appliquent sur les parois des vacuoles.

En cet état, les vacuoles aleuriques ayant perdu leurs inclusions dissoutes et possédant un suc peu épais, ne diffèrent pas sensiblement des vacuoles typiques. D'autre part. leur suc qui était assez alcalin au début, (teinte rouge brique du rouge neutre), est devenu neutre ou légèrement acide, (teinte rose du rouge neutre).

Il est assez fréquent d'observer dans les cellules de parenchyme dont nous venons de parler, (écorce et moelle), à côté des gros corps aleuriques à inclusion précédemment cités, de petits grains d'aleurone sans inclusion qui les accompagnent. Ges grains ne sont pas des néoformations, car ils existent déjà

dans la graine ; au cours de la germination, ils se comportent d'une façon un peu différente de celles des gros grains à inclusions, car ils prennent sous l'effet des pressions internes des formes allongées qu'on ne saurait mieux comparer qu’à celles développées dans l'épiderme. Ils finissent par se fusionner avec les autres vacuoles.

En dehors des parenchymes, il y a dans les autres tissus de l'embryon de Pin, des grains d’aleurone petits et sans inclusion comparables à ceux de l’épiderme; il en est ainsi dans le méristème terminal de la radicule, dans le méristème vasculaire de l’hypocotyle et des cotylédons, enfin dans la gemmule.

Dans le méristème vasculaire, les colorations vitales sur coupes, montrent que l'évolution de l’aleurone en vacuoles a lieu avec passage intermédiaire par des formes filamenteuses et des réseaux. (fig. 17, pl. IT).

Dans la gemmule une évolution analogue se produit; comme elle est plus facile à observer, nous l'avons suivie en détail.

Gemmule. — Dans la graine mûre, la gemmule constitue une zone en forme de coussinet située entre les cotylédons. On peut colorer vitalement les cellules de cette région au moyen du rouge neutre qui met en évidence de nombreux petits grains d’aleurone arrondis, sans inclusions, répartis uniformément dans un cytoplasme épais et oléifère. Ces petits corps sont à ce moment de réaction alcaline, car ils prennent une teinte jaune orangée (fig. 14, pl. IT).

Au moment de la germination, il apparaît sur le point de végétation des protubérances correspondant aux futures feuilles et qui sont disposées en plusieurs verticilles. Lorsque la plantule à une racine de un centimètre environ, les jeunes feuilles du verticille externe sont déjà individualisées et présentent une forme triangulaire ; leur longueur est encore très faible. Les cellules épidermiques ont leur vacuome formé de filaments ou de réseaux d’une finesse extrême, dont la couleur

est orangée, indiquant toujours une nature un peu alcaline de la substance dont il sont formés (Fig. 15, pl. 11). Ces réseaux sont très modifiables. Il n'y a pas de doute qu’ils proviennent des grains d’aleurone présents dans les cellules embryonnaires de la gemmule, dans la graine. Ceux-ci subissent donc dans la gemmule une évolution comparable à ce qui se passe dans l’épiderme des cotylédons.

La transformation ultérieure en grandes vacuoles peut s’observer facilement sur des plantules de même âge, car déjà l'évolution des vacuoles est plus avancée dans la pointe de la jeune feuille, où les vacuoles sont assez grandes, prennent déjà une réaction acide et se colorent en brun ou en rouge.

Sur les feuilles des plantules plus âgées, les cellules à vacuome filamenteux ou réticulé sont beaucoup plus rares etelles ne s’observent plus qu’à la base; quant aux cellules à vacuoles évoluées qu'on observe dans la plus grande partie du limbe, elles sont à divers stades de transformation. Nous avons constaté, non sans surprise, que les grosses vacuoles qui sont refoulées aux extrémités de la cellule par suite de la position centrale du noyau, restent reliées entre elles par de fins trabécules anastomosés eux-mêmes en réseau dont l’ensemble forme une sorte de corbeille autour du noyau (fig. 18, pl. IT).

Il y a là certainement un dispositif extrêmement favorable aux échanges : il est bien probable que ces relations de grosses vacuoles entre elles ont dû passer inaperçues dans un grand nombre de cas. En effet, si l'on ne fait pas de coloration vitale, les trabécules très fins qui sont autour du noyau ne se distinguent pas aisément : surtout, ils sont extrêmement sensibles aux modifications de la tension superficielle et ne tardent pas à se résoudre, sous les yeux de l'observateur, en un certain nombre de vacuoles à contours arrondis et de tailles diverses.

Remarquons que dans les plus jeunes feuilles primordiales, lorsque le vacuome est à l’état de réseau ténu, il est absolument invisible sans coloration ; sa coloration vitale se fait progressivement, et l'intensité de la teinte s’accroît peu à peu,

ce qui prouve bien l'authenticité indiscutable de ces éléments qui appartiennent à la cellule vivante et ne sont aucunement modifiés par l'entrée du colorant vital au début d'une observation. Lorsque le vacuome se trouve au stade de réseau assez gros, et qu'il est tannifère, il devient réfringent et il est alors visible directement dans les cellules vivantes sans aucun artifice. C'est encore là un moyen qui permet de s'assurer de la réalité des images fournies en coloration vitale, car il suffit d'un peu de bleu de crésyl introduit sous la lamelle pour colorer ces réseaux sans modification. D'ailleurs, si l’on observe fréquemment la transformation d’un réseau vacuolaire en petites vacuoles séparées, à la suite d'un examen microscopique prolongé, l'inverse n'a jamais lieu : les réseaux vacuolaires sonl donc bien un des aspects normaux du vacuome sons l'influence des phénomènes de la vie cellulaire.

Nous avons fait l'essai de l’acide osmique sur les jeunes feuilles. La réduction a lieu au contact des vacuoles à tannin qui sont abondantes au sommet d’une jeune feuille ayant: millimètre de longueur. Le tannin apparaîtde bonne heure, car l'acide osmique colore et fixe des réseaux parfois très fins sans altérer sensiblement leur forme. On trouve cependant à la base d'une feuille suffisamment jeune, des cellules moins différenciées qui ne réagissent pas et doivent être encore dépourvues de composés phénoliques : elles correspondent aux cellules dont le vacuome est en réseau orangé. Comme d'autre part les grains d'aleurone dont dérivent les vacuoles, n’offrent dans la graine aucune des réactions du tannin, il est certain que l’apparition de ces composés ne conslitue qu'un stade de l'évolution chimique du vacuome, ce qui est conforme à ce que nous connaissons ailleurs. ;

Les cellules à grains d’aleurone et celles à l'intérieur desquelles, à la germination, on colore des réseaux orangés, sont des éléments qui ne montrent aucun système de vacuoles sur le vivant, sans coloration. On pourrait croire qu’il s’agit de cellules à cytoplasme plein, d’où l'intérêt que présente leur

coloration vitale. Au contraire, dès que le système renferme du tannin, il devient réfringent et l’on pourrait croire que l’on assiste alors à une néoformation des vacuoles : en réalité,

il n’en est rien comme nous venons de le démontrer.