ART. 1%. — FORMATION DE L’'ALEURONE DU RICIN PENDANT LA MATURATION

Nous nous sommes occupés d'abord, de l'origine des grains d’aleurone de l’albumen, puis de leurtransformation pendant la germination. C’est donc toute la série des états par lesquels passe l’aleurone que nous avons observée au moyen d’une méthode nouvelle.

Le colorant vital qui convient le mieux dans l'étude de l'aleurone est le rouge neutre et après lui vient le bleu de crésyl : nous avons donc employé ces deux colorants presque exclusivement.

En examinant une graine de Ricin, on est amené à distinguer deux catégories de cellules dans l’albumen : les cellules périphériques et les cellules profondes. Ces dernières seules renferment les inclusions caractéristiques des grains d’aleurone bien connues depuis Pfeffer (cristaloïdes et globoïdes) ; les cellules de la périphérie ont au contraire des grains d’aleurone homogènes. Entre ces deux cas extrêmes. on observe tous les états intermédiaires, dans les cellules d’albumen qui se trouvent les plus proches de la couche externe. Ces différences de structure des grains d'aleurone ne paraissent pas avoir été signalées jusqu à présent.

À. Indications sur le mode de développement de l'albumen du Ricin. — C'est pendant le mois d'octobre, à Paris, que l’on peut observer des fruits et des graines du Ricin assez développés pour permettre l'étude de l'ailbumen et des grains d'aleurone.

Les premiers stades examinés correspondaient à des fruits déjà assez gros : dans chacune des loges de ceux-ci, la graine est encore dépourvue de coque résistante et une grande partie de l’amande est occupée par les téguments de l'ovule.

Lorsque l'albumen commence à se différencier, il forme d’abord une sorte de sac dont les parois sont hyalines et composées d’un petit nombre d'assises cellulaires. Ge sac est plus vite constitué dans la région occupée par le jeune embryon, que dans l'extrémité opposée, où la paroi du sac d’albumen ne prend qu'’assez tard de la fermeté. La zone interne de l'albumen, c’est-à-dire l’intérieur du sac, est vide de cellules et ne sera comblé que très tard lorsque l'embryon se sera accru et aura développé ses deux grands cotylédons dans cette région médiane : c'est alors seulement que les dernières assises de l’albumen se constituent au contact intime des surfaces cotylédonnaires.

Auparavant, la zone interne de l'albumen sera absorbée par les cotylédons pendant leur accroissement. Cette zone est hyaline ; elle montre des alignements de cellules qui indiquent que des cloisonnements se produisent qui ont pour résultat d'accroître la masse de l’albumen vers l'intérieur.

Cette zone se trouve peu à peu digérée dans sa partie la plus interne par l'embryon, dont les cotylédons prennent un grand accroissement très rapidement. C'est ainsi que lorsque ceux-ci n’ont encore que la moitié de leur longueur définitive, la zone hyaline ést nettement plus épaisse dans la région qu'ils n’atteignent pas (fig. 15, pl. V).

La croissance de l'albumen de Ricin se fait donc normalement de la périphérie vers le centre, de sorte que les couches internes de l’albumen sont les dernières formées.

Ces grands traits du développement de l’albumen sont utiles à rappeler, avant d'aborder l'élude de la différenciation cellulaire.

En effet, de même que l’albumen s'accroît par des divisions successives de ses cellules vers l'intérieur, de même la transformation du vacuome en grains d'aleurone, se produit d'abord dans les couches périphériques el s'effectue en dernier lieu dans la partie profonde.

B. Technique. — La technique employée est celle des colo-

Formation des grains d’aleurone chez le Ricin ; observations après coloration vitale ; les vacuoles sont métachromatiques.

Fig. 1, 2, 3, 4, 5, 6, cellules de la couche externe de l’albumen, — Fig. 7, 8, 9, cellules du parenchyme de l’albumen : 1, cellule à grosse vacuole unique (on voit le début de la formation de l'huile); 2, vacuole fragmentée (l'huile est plus abondante) ; 3, cellule dont les vacuoles ont un contenu épais de nature colloidale (l'huile est abondante); 4 et 5, cellules dont les vacuoles ont acquis une consistance semi-fluide et se sont auastomosées en réseaux (le cytoplasme est très riche en goutteleltes d'huile); 6, grains d’aleurone formés dans une graine un peu avant sa maturité; 7, cellule à grosse vacuole très aqueuse ; 9. cellule d’albumen mûr montrant des grains d’alenrone et de l'huile ; 8, état intermédiaire.

rations vitales. Sa réussite est nouvelle en ce qui concerne l’albumen du Ricin, car M. Beauverie n'a pas fait de véritables colorations de cellules vivantes. On sait que l'abondance de l'huile qui accompagne l’aleurone dans les cellules d'albumen est un obstacle très gênant pour l'observation vitale. Celle-ci est considérée ordinairement comme impossible dans la graine mûre pour celle raison.

À cause de ces difficultés, et afin de répondre aux objections possibles concernant la valeur des figures observées, nous insisterons sur la méthode et discuterons les résultats au cours

de l'exposé pour chaque cas particulier.

C. Observalions vilales des cellules jeunes d'albumen. — Dès que l’albumen présente une consistance qui permel sa séparation et son isolement, on peut faire l'observation vitale de ses cellules, après coloration du vacuome dans une solution de rouge neutre ou de bleu de crésyl (1). Il n'existe alors, dans ces jeunes stades, que de grandes cellules à vacuoles typiques énormes, généralement uniques, et remplissant la plus grande partie de la cavité cellulaire. Le noyau est nettement visible, situé contre la paroi; sa forme est arrondie et il possède un nucléole. Le cytoplasme renferme d'assez nombreux granules dont les plus gros sont placés autour du noyau : leur nature “exacte ne peut être donnée par le simple examen vital (fig, x. pl. V).

La coloration réussit bien avec le rouge neutre ou le bleu de crésyl : la grande vacuole se colore seule et la teinte prise est métachromatique, orangée avec le rouge neutre, violette avec Le bleu de crésyl, ce qui indique une réaction alcaline du suc vacuolaire. Ge liquide est d’abord très aqueux (fig. +, pl. IX), mais il s'épaissit assez vite par la suite.

Dans ces jeunes albumens, il y a déjà une-différence notable entre les cellules périphériques et les cellules profondes. Le vacuome de ces dernières est conslilué par une vacuole énorme ;

(i) La éoloration et l'observation vilale ne présentent aucune difficulté spéciale dans un tissu qui esl eucore très aqueux.

le cytoplasme ne forme qu'une mince couche pariétale et ne renferme que quelques rares granules. Le noÿau se trouve logé dans une dépression de la vacuole et en partie dissimulé par elle. La taille des cellules profondes est beaucoup plus grande que celle des cellules périphériques elle atteint presque le double en diamètre dans l'albumen jeune (fig. 9, pl. V).

Malgré ces dissemblances, le point de départ de l'évolution vacuolaire est le même pour toutes les cellules de l’albumen c'est l’état de grande vacuole aqueuse ; dans les albumens plus âgés, au contraire, les différences qui se manifestent, vont nous obliger pour la commodité de l'exposition à noter séparément l’évolution dans les cellules périphériques et dans les celiules profondes.

D. Evoluion dans les cellules phériphériques. — La série des transformations de l'appareil vacuolaire s'’observe facilement au début sur l'albumen examiné à plat sur la lameile ; plus tard, lorsqu'il s’est épaissi et qu'il est devenu opaque, sur des coupes tangentielles très minces qu'on observe de la même façon.

Le rouge neutre et le bleu de crésyl peuvent être employés indifféremment : les résultats obtenus sont équivalents. Il est toujours nécessaire d'opérer les colorations sur les albumens entiers avant de pratiquer les coupes; l’albumen absorbe le colorant avec une grande facilité par toute sa surface extérieure (1) et lorsqu'on juge à l'œil que la teinte est sufAsante, on pratique une coupe mince avec un bon rasoir et on observe immédiatement dans l'eau. Un excellent éclairage de la préparation est absolument nécessaire pour l'examen aux forts grossissements. Si l'on réalise ces conditions, la préparation se lit aussi bien que la meilleure coupe, colorée après fixation.

Le morcellement des grandes vacuoles primitives se fait de bonne heure et débute à la base de l'albumen, au stade où l’on

(x) Il est toujours nécessaire de mettre à nu une partie aussi grande que pos:

sible de le surface de l'albumen, sans l’endommager ; on y arrive assez facilement en enlevant avec des pinces le tégument séminal.

commence à pouvoir séparer du nucelle cette région qui a acquis une fermeté suffisante.

Ce morcellement s'accompagne d'une production d'huile qui apparait sous forme de nombreuses petites goutteleites dans lie cytoplasme, autour du noyau et dans les travées qui délimitent les vacuoles (fig. 2 à 4, pl. V).

Enfin, il se produit une accumulation de substances protéiques à l'intérieur du vacuome qui entraîne une aptitude de pius en plus marquée à fixer les colorants. La teinte prise, de plus en plus foncée, est toujours d'un beau violet avec le bleu de crésyl, rouge brique avec le rouge neutre, par conséquent toujours métachromatique.

Lorsque la coque de la graine devient noire, tout en gardant encore sà fragilité, on commence à pouvoir isoler l’albumen dans son entier. C’est le stade qui ‘montre le plus grand nombre &e phases d'évolution cellulaire, car la différenciation ne se produit pas en même temps partout et toute la gamme des états vacuolaires se rencontre sur un même albumen. Il existe encore quelques cellules à grandes vacuoles uniques, des stades divers de fragmentalion, des réseaux, des petites vacuoles nombreuses et isolées. L'huile s'est amassée en si grande quantité que le noyau est ordinairement invisible; en même temps, l'abondance des albuminoïdes, donne aux vacuoles une consistance demi-Huide qui est attestée par les variations de forme auxquelles on assiste (fig. 5 à 7, pl. V).

Ces changements montrent quil s'agit bien de cellules vivantes et que les formes observées ne sont pas artificielles.

À une période plus avancée de la naturation, les formes en réseau du vacuome deviennent très nombreuses. Pour lies observer, il faut choisir l’albumen d’une graine à coque noire et déjà un peu dure. Sur une graine plus âgée, à coque noire et dure et à la base de l’albumen, les grains d’aleurone sont déjà isolés et constitués avec l'aspect qu'iis auront dans la graine complètement mûre. Dans la partie moyenne de l'atbumen au contraire, il existe encore des réseaux très variables

de formes. Ceci montre que l'assise périphérique de l’albumen se différencie dans la direction micropylaire, (région où se développe la caroncule).

Les formes réticulées du vacuome sont extrêmement remarquables : on les trouve dans les cellules périphériques d'albumen pendant la période où la cellule est bourrée de petits globules d'huile qui constituent une très fine émulsion dans le cytoplasme (/ig. 5 e16, pl. V). Malgré celte accumulation, il existe encore un certain mouvement de brassage dans la cellule, ce qui occasionne des modifications très régulières dans la forme du réseau. Au contraire, lorsque ce dernier s'est résolu en petites vacuoles arrondies, dont chacune a la valeur d'un grain d’aleuroné, il ne se manifeste plus aucun mouvement d'ensemble : les globules d'huile apparaissent comme juxtaposés délimitant un réseau occupé par le cytoplasme. La cellule va entrer dans une phase de repos (fig. 8, pl V).

Les réseaux correspondent, on le voit, à la période qui précède la maturation, alors que se produit un dessèchement progressif de la future graine : ils correspondent aussi à une phase de mouvements cytoplasmiques intenses. Ils sont bien réels, car ils peuvent se voir, difficilement il est vrai, sans coloralion vitale, comme des diverticules clairs, parce que le vacuome à ce stade est légèrement réfringent. C'est une vérification que l’on fait ainsi d’un phénomène constaté d'une manière tout à fait générale, la conservation parfaitement fidèle du vacuome par les colorations vitales.

L'évolution du vacuome chez le Ricin, pendant la maturation de l’albumen, consiste donc dans le morcellement d'une grande vacuole primitive, dont les éléments finissent par s’isoler sous forme de grains d'aleurone. Un stade réticulé du vacuome précède la transformation en grains. Cette évolution s’accompagne d'une augmentation du cytoplasme et du dépôt d'huile en quantité considérable à son intérieur.

E. Evolution dans les cellules profondes. — Ces cellules comme les précédentes, renferment chacune au début une grande

vacuole {ypique gorgée d’eau (fig. 9. pl. V); l’ensemble du tissu est hyalin. La différenciation débute au contact de la couche cellulaire externe, où le lissu de l'albumen prend bientôt une couleur blanche opaque et elle gagne à partir de Bà de plus en plus en profondeur. Sur une graine à coque noirâtre, mais qui n'est pas encore dure, il y a deux zones très nettes dans lalbumen, une tranche extérieure blanchâtre, opaque ct une mince tranche interne hyaline ‘fig. 19, pl V). La première correspond à des éléments déjà riches en huile et qui renferment des vacuoles aleuriques presque achevées, la deuxième est formée encore de cellules à grandes vacuoles aqueuses qui commencent seulement à se fragmenter. Il est donc possible de connaître toutes les élapes de la formation des grains d’aleurone sur une coupe transversale d’albumen, dans une graine de cet âge. |

Pour observer les cellules profondes d'albumen vivantes et colorées vitalement, certaines précautions sont indispensables : la coloration doit se faire sur une tranche coupée, transversale ou longitudinale, de l'albumen; mais on ne doit pratiquer la coupe destinée à l'observation qu'une fois la coloration effectuée, autrement on aurait peu de chances de conserver des cellules vivantes. Le fragment d’albumen étant placé dans la solution colorante, la teinture pénètre peu à peu par la surface de secticn, au delà de la zone des cellules lésées par le rasoir, et vient produire des colorations vitales dans les éléments plus profonds. Quand on estime que la teinte est suffisante. on fait une coupe épaisse qu’on examine immédiatement dans l’eau : les cellules colorées vitalement se détachent néttement au milieu des éléments altérés ct sont protégés par eux, ce qui permet une observation de plusieurs minutes. Il est certain que cette technique, rendue nécessaire par la position des cellules profondes, donne moins de garantie que l'observation des cellules périphériques, protégées par des membranes continues. Même lorsqu'une cellule est colorée vitalement et qu’on a l'assurance de sa vitalité, il se péut que

l'appareil vacuolaire très sensible soit néanmoins altéré par suite du contact de l’eau, car l'entrée du colorant vital ne peut guère se comprendre qu'accompagnée d’une pénétration correspondante de l'eau dans laquelle il est dissout. Nous nous sommes assurés d’ailleurs que ce phénomène pouvait se produire et nous avons pu assister dans une cellule vivante à la confluence de plusieurs vacuoles par suite de fluidification ; maigré tout, ces faits sont relativement rares et lorsqu on connaît une fois ces cas anormaux on les distingue facilement des fails vitaux.

Sur une coupe transversale d’albumen, dans une graine à coque noirâtre, non très dure, on observe tous les états du vacuome depuis les grandes vacuoles des cellules les plus pro- - fondes, jusqu'aux grains d’aleurone à inciusions des éléments de surface : les états intermédiaires du vacuome, faisant transition, sont donc normaux et réels comme les termes euxmêmes. Pour avoir une certitude plus compiète encore, nous avons examiné plusieurs fois des coupes épaisses d’albumen, aussitôt faites, sans aucun réactif et à sec, afin de ‘vérifier l'exactitude de notre description.

La formation des grains d’aleurone a lieu de la façon suivante. Le morcellement des grandes vacuoles primitives donne näissance par division à un petit nombre d'assez grosses vacuoles disposées autour du noyau central (fig. 10, pl. V);: puis ces vacuoles elles-mêmes se divisent, pour donner un certain nombre de vacuoles assez grosses, dont le suc est très épais et qui deviendront chacune un grain d'aleurone. Les inclusions apparaissent assez tard dans le liquide des vacuoles où elles sont d'abord petites et animées de mouvements browniens (fig. 14, pl. V). Leur forme est très variable; elles restent incolores en coloration vitale.

Enfin au coniact de la couche périphérique, il y a des grains d’aleuronecomplètement formés avecinclusions caractéristiques (cristalloïdes et globoïdes), sans que j’ai pu déterminer laquelle des deux inclusions apparaissait la première (fig. 12, pl. V).

ART. ?, — ETUDE DE L'ALEURONE DANS LA GRAINE MURE®. Indications techniques.

La graine mûre du Ricin se prête mal à une coloration vitale de l’aleurone. On sait en effet que les grains d’aleurone du Ricin ne peuvent pas être observés sans précaution spéciale, par suite du très rapide bouleversement que produit l’arrivée de l’eau dans les grains d’aleurone, dont la substance a la propriété de se fluidifier rapidement dans ces conditions, Eu outre l'abondance de l'huile qui s'échappe des cellules, vient obscurcir complètement la préparation la plus soigneusement montée. Tout ces graves inconvénients expliquent que les auteurs, qui ont étudié les grains d'aleurone du Ricin, aient employé des méthodes spéciales d'observation.

De nombreux procédés de fixation ont été préconisés : les principaux sont l'alcool absolu, l'acide picrique, le sublimé, le formol. Ils donnent de bons résultats dont nous parlerons plus loin. On a recommandé également l'observation des coupes fraiches d'albumen dans l'huile et ce n'est pas un . Mauvais moyen de connaître l’état des grains d’aleurone dans la graine. A côté de ces méthodes classiques, nous devons décrire celle qui nous a servi à obtenir des colorations vitales de l’aleurone.

À. — Cellules périphériques d’albumen,

Ces cellules forment une seule assise continue qui entoure complètement l’albumen. Dans la graine, elles sont recouvertes directement par une pellicule mince, formée de cellules mortes, qui représente le reste des téguments ovulaires. Cette pellicule, qui adhère d’une façon très intime à l’albumen, doit être enlevée pour que l'on puisse observer la surface de celui-ci.

Cette opération est assez difficile à réussir sur la graine sèche sans endommager l’albumen; cependant quand on est parvenu à dénuder une petite portion de ce dernier, il est

Ut, me

possible de pratiquer une coupe mince tangentielle et d'observer la couche des cellules périphériques, après l'avoir déposée à plat sur une lamelle. On voit ainsi à sec, avec un grossissement moyen, que cette assise est formée de grandes cellules allongées, amincies en pointes aux extrémités el dont l’ensemble rappelle la disposition d'un épiderme.

Il n'est pas possible, par contre, au moyen de cette méthode, d'obtenir une coloration vitale, car les cellules sont rapidement tuées ; nous avons donc employé l’artifice suivant :

Les albumens intacts, tels qu’on les extrait de la coque séminale, sont placés entiers dans une solution concentrée de rouge neutre : ils comprennent alors l'albumen proprement dit et l'embryon, le tout recouvert par la pellicule ovulaire.

Au bout d'une demi-heure environ, la surface de l’objet a pris une teinte brun rouge. On enlève alors la pellicule extérieure, qui se détache à ce moment avec facilité et l'on met à découvert la surface extérieure de l’albumen, qui a pris une teinte brun jaunâtre peu foncée.

Cette coloration est due à la pénétration du rouge neutre qui est passé à travers la zone des cellules mortes, puis est venu donner une coloration vitale dansles cellules périphériques d'atbumen. Il suffit en effet, de pratiquer une coupe mince tangentielle de la surface colorée et de l’observer à plat, pour se rendre compte qu'il s’agit d’une parfaite coloration vitale.

Dans chaque cellule d’albumen, on constate la présence d'un noyau central étoilé, non coloré et de grains d’aleurone nombreux et petits, arrondis, teints d’une matière homogène par le rouge neutre en rouge brique foncé. Entre les grains d'aleurone, se trouvent de nombreux globules d'huile qui donnent au cytoplasme un aspect alvéolaire (x).

On peut encore observer une coloration vitale des cellules périphériques dans la région de l’albumen correspondant au micropyle de l’ovule. Il existe là une zone assez large, en

(x) Le cytoplasme est donc réduit à un réseau, pressé entre les globules d'huile et les grains d’aleurone.

forme de pyramide très surbaissée à trois faces, qui n’est pas normalement recouverte par les téguments ovulaires : la surface de l'albumen s’y trouve done à nu et le colorant vital y pénètre rapidement, lorsqu'on place l’albumen entier dans la solution de rouge neutre. Les cellules y sont plus courtes qu'ailleurs et elles renferment des grains d'aleurone assez gros,

se colorant en totalité par le rouge neutre.

B. — Cellules profondes.

Les cellules profondes d’albumen ne diffèrent pas essentiellement des cellules périphériques que nous venons d'étudier, mais elles sont plus volumineuses et cela d'autant plus qu'on s'éloigne de la surface.

En outre, elles renferment des grains d’aleurone beaucoup plus gros qui contiennent des inclusions.

Les cellules qui sont immédiatement sous jacentes à la couche périphérique ont des cristalloïdes, mais sont dépourvues ordinairement de globoïdes. Plus profondément, au contraire, les grains d’aleurone ont des inclusions complètes (cristalloïdes et globoïdes).

r. Cellules sous jacenles à la couche périphérique. — Pour vpérer une coloration vitale, nous avons enlevé la coque de la graine et placé l’albumen entier dans une solution diluée de rouge neutre. Au bout de deux minutes, la pellicule mince qui recouvre la surface de l’albumen se détache facilement; on met à nu de cette façon la couche périphérique de l’albumen qui apparaît intacte lorsqu'on a enlevé avec précaution là pellicule.

Si on replace alors l’albumen dans le colorant, on constate au bout de quelque temps à lexamen microscopique que la couche périphérique de l’albumen est tuée et montre seulement ses noyaux colorés. Au contraire l'assise sous jacente apparaît colorée vitalement d’une manière très belle et comme Passise

épidermique est très mince, formée de cellules très plates, il est facile d'observer les éléments qu’elle recouvre et protège. Ceux-ci montrent des grains d’aleurone dont la substance fondamentale est colorée en orangé et chaque grain contient un cristalloïde incolore, mais est dépourvu de globoïdes. C’est un état de l’aleurone intermédiaire entre celui de l’assise périphérique et celui des cellules profondes.

Le procédé que nous indiquons est un des meilleurs qui soit pour étudier des cellules d’albumen en coloration vitale, sans que l’arrivée de l’eau produise d’altération nuisible à une bonne observation, en même temps qu’à une image exacte de la réalité. IL est certain que cette méthode permet l'observation des grains d’aleurone dans d'aussi bonnes conditions que si l’on emploie une des méthodes de fixation classique. Elle à en outre l'avantage d'être très rapide, (elle demande une demi-heure à peine) et elle permet de mettre en valeur les propriétés de la substance fondamentale de l’aleurone.

Lorsqu'on a opéré de cette façon, il se produit bien une” entrée de l’eau dans la cellule, puisque le colorant ne peut arriver au contact des grains d’aleurone que dissout dans l’eau, mais celte arrivée estménagée et n’amène pas de pertubations, comme ce serait le cas pour des cellules d’albumen qui se trouveraient en contact direct avec l’eau. La couche périphérique de cellules mortes qui est interposée, suffit à protéger contre cet effet la couche sous jacente.

2, Cellules de la masse de l'albumen. — Il est très difficile d’en faire l’observation vitale dans la graine mûre. Les artifices employés pour les autres cellules ne peuvent servir dans ce cas.

I n’est cependant pas complètement impossible de faire de bonnes colorations vitales en opérant de la façon suivante :

On coupe un albumen en deux parties, sur lesquelles on refait avec le rasoir une surface de section bien plane et bien nette, puis on immerge les moitiés dans le bain colorant. Au bout de quelques heures, la zone coupée a pris une teinte rouge

brique foncée : on fait alors une coupe épaisse qu'on observe à un grossissement moyen.

Les cellules coupées sont vidées en général de leur contenu et leurs membranes seules sont colorées : au dessous d'elles, on distinguera généralement un certain nombre de cellules d’albumen colorées vitalement au milieu d’autres cellules mortes. Dans les cellules colorées, on remarque les grains d’aleurone qui ont leur taille et leur forme ordinaire et ne sont pas déformés : leur substance fondamentale est colorée en rouge brique et les inclusions sont restées incolores; tout le reste de la cellule demeure sans coloration. Il s’agit donc d’une coloration vitale, que seule l'épaisseur de la coupe et le trouble produit par les cellules désorganisées empêche d'examiner d’une façon détaillée.

Nous voyons donc que la méthode vitale peut s'appliquer à l'albumen mûr de Ricin. Outre sa rapidité, cette méthode a l’avantage de mettre en évidence les propriétés de l’aleurone et de laisser voir en même temps l'huile, et le réseau cytoplasmique, ce que ne permettent pas de faire la plupart des méthodes de fixation qui produisent une dissolution de l'huile. Nous avons aussi obtenu des images de la cellule d'albumen de Ricin plus exactes que celles qui avaient été décrites jusqu’à présent. Elles sont entièrement comparables à celles que nous avons obtenues par l'emploi d'une méthode de fixation spéciale la méthode de Regaud.