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tuées que les larves sont plus nombreuses et plus grosses. Si l’on introduit, en effet, dans un bocal renfermant de la marmelade de pommes stérilisée des Mouches sauvages, celles-ci apportent avec elles différents Microbes où Moisissures qu'elles ensemencent sur le milieu. Lorsque ces Mouches sont très peu nombreuses, il arrive que les Moisissures se développent abondamment — les quelqués larves produites étant incapables de labourer toute la surface du milieu — au point d’entraver ou même d’étouffer complètement l'élevage de Drosophiles. Si, au contraire, les Mouches sont très nombreuses, les larves sont produites en abondance et les Moisissures n'apparaissent pas. Par contre, dès que la plupart des larves se sont transformées en pupes, les Moisissures n’étant plus brassées par ces larves, commencent à développer leurs formes mycéliennes aériennes et à fructifier. Certaines de ces Moisissures, le Penicillium glaucum entre autres, exercent une action néfaste sur le développement de la Mouche : dans tout bocal en effet où cette Moisissure développe ses fructifications vertes, l'élevage peut être considéré comme perdu.

On conçoit combien de semblables conditions aussi variables du milieu nutritif sont défavorables pour toute recherche expérimentale. Tantôt ce sont les adultes qui meurent rapidement sans avoir pondu, tantôt on assiste à une mortalité considérable des larves et des pupes, au point que certaines lignées sont irrémédiablement perdues ; tantôt enfin, en raison des variations survenues, une partie de l’élevage peut être amenée à bien, tandis que tout le reste meurt, ce qui fausse naturellement tous les pourcentages et toutes les statistiques.

D'autre part on admettra facilement, même sans être très convaincu de limportance du milieu en matière d'évolution, qu'il n’est pas indifférent que certaines larves se nourrissent d’un milieu alcoolique, d’autres d’un milieu acide ou neutre ou parfois alcalin, d’autres d’un milieu sucré ou enfin que les organismes se trouvent successivement en présence de semblables modifications de leur milieu nutritif. En fait, Dercourr et moi (13) avons nettement constaté les variations que ces états différents du milieu nutritif introduisent dans la vitalité, la taille, la durée du développement, les tropismes, la coloration, la fécondité des descendants, d’une façon générale dans la structure et le comportement de ces organismes.

Importance des microorganismes pour le développement de Mouches autres que les Drosophiles.

La nature des relations existant entre le développement des Drosophiles et celui des microorganismes du milieu nutritif m’apparut, dès le début de mes recherches, d'autant plus intéressante à préciser que des expériences antérieures (25), effectuées sur d’autres Mouches dont les larves habitent la viande putréfiée, m'avaient permis d’en juger l'importance. Ce sont ces recherches que je vais brièvement résumer ici.

Des expériences rudimentaires de J.-H. Fagre (19) lui avaient montré que des larves de Zucilia, placées sur de petits cubes de blanc d'œuf coagulé ou sur des fragments de viande, en déterminent très rapidement la liquéfaction, alors que les milieux témoins conservent leur consistance et leur aspect. Ce célèbre naturaliste en avait conclu que cette liquéfaction était due au rejet à l’extérieur de « quelque subtile pepsine », élaborée par les larves de Lucilies. Le fait observé par J. H. Fagre est certainement exact. Il est incontestable, en effet, que la présence des larves de Mouches hâte la putréfaction des viandes. Dès que ces larves sont écloses, on les voit s’agiter par groupes, au fond des anfractuosités où la Mouche a déposé ses paquets d'œufs et c’est 1à que débute la liquéfaction des albuminoïdes.

I ne semble pas, par contre, que linterprétation donnée par Fagre, du rejet à lextérieur d’un suc digestif sécrété par la larve, soit conforme à la réalité, Une série d’expériences m'ont nettement montré, en effet, qu’il n’en était pas ainsi.

1° En stérilisant à 120° du blanc d'œuf, dans une fiole conique à fond plat, on obtient une tablette d’ovalbumine coagulée, stérilisée. Si on introduit dans la fiole de jeunes larves de Lucilia, celles-ci se promènent en tout sens à la surface du milieu nutritif, sans réussir à pénétrer dans sa profondeur. Si lon retire ces larves au bout de quelques heures, on n’observe aucune digestion du blanc d'œuf, tant que les colonies microbiennes liquéfiantes, ensemencées par ces larves, n’ont pas acquis un développement notable. Mème dans ces conditions, la liquéfaction est d’ailleurs opérée très lentement.

0 Si on maintient un grand nombre de larves en contact avec

une substance inerte, on peut broyer ensuite cette substance avec de Peau, sans que la liqueur obtenue présente aucune propriété digestive. Dans ces conditions, les larves n’ont donc rejeté à l'extérieur aucun suc digestif.

30 Enfin j'ai préparé des extraits aqueux ou glycérinés, en milieux neutres, acides ou alcalins, soit de larves presque adultes, maintenues au préalable pendant 24 heures en état de jeune et broyées en leur totalité, soit de glandes isolées (glandes salivaires; cœcums gastriques). Tous ces extraits se sont montrés dépourvus d’action digestive vis-à-vis des diverses albumines (fibrine, blanc d'œuf, viande) ainsi que vis-à-vis des matières amylacées. Au cours de ces essais, des précautions avaient naturellement été prises pour éliminer les actions microbiennes qui auraient pu fausser les résultats.

Mèêmes résultats négatifs ont été obtenus en précipitant les extraits aqueux par l’alcool absolu et en redissolvant le précipité, après dessiccation, dans l’eau distillée. Enfin des extraits préparés, selon la méthode utilisée par L. FREDERICQ, pour la recherche des ferments digestifs des Invertébrés, n’ont également donné que des résultats négatifs.

Non seulement ces expériences me conduisirent ainsi à rejeter l'interprétation donnée par J.-H. FaBre, mais elles me permirent de constater ce fait inattendu que, dans les conditions où Jopérais, les larves des Mouches étudiées ne secrétaient pas de sucs digestifs en quantité décelable. Pour comprendre, dès lors, comment s'effectue la nutrition de ces organismes, il faut envisager deux ordres de faits.

Les larves sont dépourvues de tout appareil buceal de broyage où de mastication. Les crochets chitineux qui terminent leur appareil pseudo-mandibulaire se meuvent parallèlement et ne peuvent servir qu’à la locomotion de l’animal ou à lui permettre de creuser une galerie dans le milieu nutritif. Le diamètre filiforme de l’æsophage s'oppose au passage de particules solides tant soit peu volumineuses et la nutrition s'effectue uniquement par succion d'aliments liquides. Sur un milieu solide, ne subissant aucune liquéfaction, les larves meurent sans pouvoir se nourrir. Cest ce que Bocpaxow (4), puis moi-même avons constaté en plaçant des larves rendues aseptiques sur de la

viande stérilisée. Toutes moururent sans pouvoir se nourrir.

Comment donc se fait-il que, dans les conditions ordinaires, ces larves, qui ne fabriquent pas de sucs digestifs qu’elles puissent rejeter à l'extérieur, se développent aussi rapidement, et présentent cette croissance prodigieuse qui caractérise la vie larvaire des Mouches, sur des milieux primitivement solides. Ceci est dû uniquement, ainsi que J'ai pu m'en rendre compte, au travail des Microbes protéolytiques.

J'ai dans ce but ensemencé diverses albumines stérilisées (blanc d'œuf, viande) avec certaines espèces protéolytiques et j'ai constaté que les larves se nourrissaient parfaitement aux dépens des produits de la digestion opérée par ces microorganismes, produits parmi lesquels j'ai toujours pu constater l'existence de peptones vraies.

J'ai constaté d’autre part que les larves, en parcourant en tous sens le milieu nutritif, en le creusant, en pénétrant dans sa profondeur, ensemencent de tous côtés les Microbes protéolytiques et par suite accentuent d’une façon considérable leur œuvre liquéfiante et digestive. C’est là vraisemblablement la cause réelle du phénomène observé par Fagre. J'ai pu le reproduire artificiellement de la façon suivante.

Deux tablettes d’albumine stérilisée en fiole sont ensemencées en surface, à la température ordinaire, avec une culture pure de Micrococcus flavus liquefaciens Five. Au point ensemencé, on voit apparaître de petites colonies jaunâtres, circulaires ou ovales, à bord net ou dentelé. Plusieurs colonies confluent en une tache lobée, au niveau de laquelle le substratum se ramollit et se liquéfie lentement. Si dans certaines fioles, dès que les colonies sont apparues, on en prélève avec une anse de platine et qu'avec cette anse on laboure en tous sens la tablette d’albumine, d'innombrables colonies se développent de toutes parts et la liquéfaction s'opère rapidement.

Si nous envisageons le phénomène de la putré faction de la viande dans son ensemble, nous voyons donc que la liquéfaction due aux Bactéries protéolytiques est d'autant plus rapide qu'il y a plus de larves, c’est-à-dire que ces Bactéries sont ensemencées et réparties d’une façon plus universelle. D'autre part cette pullulation microbienne et la digestion du substratum qui en résulte

sont la condition essentielle de la nutrition et du dévelop-

146 E. GUYÉNOT

pement des larves de Mouches. Ces conclusions ont depuis été complètement confirmées par les recherches de Bogpanow (4). Cet auteur ayant réussi à obtenir, par un procédé que ] ’indiquerai tout à l’heure, des larves de Calliphora aseptiques, constata qu’elles étaient incapables de digérer la viande et de s’en nourrir, mais que cette nutrition était rendue possible dès que cette viande avait été digérée par la trypsine ou transformée par des Bactéries protéolytiques, avant d’être stérilisée.

Ces recherches montrent combien sont étroits les rapports de dépendance mutuelle entre les microorganismes et les larves de Mouches, qui vivent sur la viande en putréfaction.Selon toute vraisemblance, les larves de Drosophiles se développant sur des milieux végétaux en fermentation, leur nutrition doit dépendre non moins étroitement des microorganismes qui constituent une bonne partie du substratum alimentaire. Il y a donc un intérêt majeur à connaître cette flore microscopique et, si possible, à l'uniformiser ou même à la supprimer. C’est pourquoi, tant pour avoir des conditions d’élevages convenables permettant de recueilir un nombre suffisant de descendants et d'assurer la conservation de toutes les lignées que pour avoir des conditions de milieu plus comparables et mieux connues, je me suis efforcé d'obtenir des élevages aseptiques de Dr. ampelophila.

Dès le début de cette tentative, une difficulté surgissait dont mes recherches antérieures et celles de Bocpaxow me montraient la vraisemblance. Mème en supposant qu'il fut possible d'obtenir des organismes aseptiques et surtout d'en continuer lélevage pendant de nombreuses générations, il fallait penser à trouver pour ces organismes une nourriture capable d’être utilisée par eux, dans les conditions nouvelles. Les larves aseptiques de Calliphora, obtenues par Bocpanow, ne pouvaient se nourrir que de viande préalablement digérée. Peut-être une semblable préparation serait-elle nécessaire dans le cas des Drosophiles. Bien plus, une série de constatations m’avaient permis de supposer que l’aliment de ces Mouches et de leurs larves consistait essentiellement en certains microorganismes (Levures) qu’elles absorbent abondamment et digèrent, ainsi que le montre lobservation directe.

Ces difficultés d'ordre spécial se compliquaient de difficultés

d’un ordre plus général. Etait-l vraiment possible d'élever aseptiquement des êtres vivants ?

La vie aseptique : Historique

A cette question nombre de grands esprits ont répondu par la négative. Pasteur lui-même se montra persuadé que la vie aseptique était impossible. Il déclara à l’Académie des sciences que « depuis des années, il désirait voir un expérimentateur tenter d'élever un animal mis dans un air pur dès sa naissance avec une nourriture privée de germes, car il était convaincu que la vie dans ces conditions deviendrait impossible ».

Pourtant, depuis, toute une série de recherches expérimentales ont montré que cette opinion «Œ priori n’était pas conforme à la réalité. Les premières expériences sont celles de THreRFELDER et Nurazz effectuées en 1895. Ces auteurs élevèrent aseptiquement de jeunes Cobayes mis au monde par opération césarienne. Ces animaux purent croître dans des conditions assez comparables à celles des animaux ordinaires. Malheureusement les difficultés de technique obligèrent les auteurs à interrompre leurs expériences au bout d’un temps très court (treize jours au maximum), ce qui en diminue la valeur démonstrative.

En expérimentant sur des Poussins provenant d'œufs stérilisés extérieurement et élevés dans des conditions aseptiques, Scnot- TELIUS COnStata, par contre, que ces jeunes animaux vivant sans Microbes restaient petits et maigres, devenaient cachectiques et dépérissaient rapidement. Ils se développaient avec vigueur lorsqu’à leurs aliments on ajoutait une culture pure de Colibacille, résultats qui paraissaient indiquer l'action bienfaisante de Microbes indispensables.

Les recherches de Mne O. Mercuxikorr sur les tétards de Grenouilles aboutirent à des conclusions analogues. Les tétards aseptiques ne mouraient pas immédiatement, mais ils restaient arriérés et étaient deux fois plus petits que les témoins. Des expériences de Moro sur des tétards de Crapauds donnèrent des résultats comparables. Les tétards aseptiques purent s’accroître, mais aucun ne put être canduit jusqu’à la métamorphose.

Cependant de très intéressantes observations de Portier (50)

148 E. GUYÉNOT

tendent au contraire à montrer que certaines larves d’Insectes vivent naturellement dans des conditions aseptiques. Ce physiologiste s'adressa à des chenilles qui habitent l’intérieur des feuilles de diverses plantes. Ces Teignes, fort bien étudiées par RéAUMUR, creusent des galeries dans le parenchyme foliaire dont elles se nourrissent et s’y trouvent ainsi protégées contre les risques de contamination par les Bactéries ou les Moisissures qui pourraient se trouver à la surface des feuilles. L'auteur, après avoir lavé les deux faces de la feuille avec de l’eau oxygénée au tiers, ouvrait la galerie avec une pointe rougie au feu et projetait la chenille, saisie avec une pince flambée, dans un tube de bouillon stérilisé. Dans ces conditions, certaines chenilles, telles que celles de Nepticula (N. du rosier), se sont toujours montrées stériles. Les chenilles de Lithocolletis (L. du Chêne, de l'Orme) furent trouvées aseptiques dans un tiers des cas. On peut toutefois émettre quelques doutes sur ces conclusions, à cause de l'existence possible de Microbes anaérobies ou de microorganismes incapables de se développer dans le bouillon simple.

En 1908, Bocpaxow (4) a publié le compte rendu de ses tentatives d'élevage aseptique des Mouches de la viande. Le procédé utilisé consista à stériliser les œufs par des lavages au sublimé, puis à les déposer sur de la viande stérilisée. Les larves qui éclorent dans ces conditions ne se développèrent qu'avec une extrême lenteur et, sauf de rares exceptions, n’atteignirent jamais la taille normale. Dans aucun cas, le développement n’aboutit à la formation de pupes. Par contre, la croissance larvaire se fit bien sur de la viande stérilisée à laquelle on avait ajouté, au préalable, de la trypsine ou une Bactérie protéolytique.

Tel était l’état de la question lorsqu’en 1908 j'entrepris, avec la collaboration de A. Deccourt (13-14-15), de rendre aseptiques nos élevages de Drosophila ampelophila. En 1910, nos efforts étaient couronnés de succès et ce premier résultat fut l'objet d’une note que nous publiâmes en juillet 1910 (14).

Depuis, d’autres travaux sur cette question ont paru qui n'ont fait aucune mention ni de mes recherches publiées en r907 sur les larves de Mouches de la viande, ni de la note publiée avec A.Dercourr sur l'élevage aseptique des Drosophiles, en juillet r910.

Ces travaux plus récents confirment d’ailleurs pleinement nos conclusions relatives à la possibilité de la vie aseptique.

En janvier 1911,E. Wozzmax(59) publia, notamment, d’intéressantes expériences relatives à l'obtention de Mouches stériles de l'espèce Calliphora vomitoria. Les œufs étaient stérilisésau moyen de sublimé à 1/1000 ou à 4 /r000 ou bien d’eau oxygénée à 10 volumes. Les œufs étaient transportés sur de la viande stérilisée à 119-1209 pendant vingt minutes. Ces larves se développèrent, mais un grand nombre restèrent «arriérées » et moururent sans se transformer en pupes. Les différences individuelles furent d’ailleurs considérables. Même les larves dont la croissance fut la meilleure se montrèrent, pendant les premiers jours, peu actives, se promenant indifféremment sur la viande et les parois du tube. Cependant quelques-unes se mirent vraisemblablement à produire des ferments et finirent par atteindre la taille normale. WozLman put ainsi obtenir quelques Mouches stériles, dont deux absolument naines. Reprenant les recherches de Boapanow, il constata combien le développement était plus rapide sur de la viande additionnée de trypsine ou de certains Microbes, tels que le Bacterium coli, le Proteus vulgaris.

Ces recherches, ainsi que celles de Bogpaxow, confirment pleinement les conclusions de mon travail sur les Mouches de la viande. Celles de Wozzmax montrent notamment que si la plupart des larves sont incapables de digérer la viande par ellesmêmes, certaines peuvent cependant, au bout d’un certain temps, acquérir les sucs digestifs nécessaires. Ces différences individuelles sont très intéressantes et j'aurai souvent à fournir des exemples comparables au cours de Pexposé de mes recherches.

En 1912 enfin, ConEnpy (11) reprenant les expériences de SGHOTTELIUS montra qué, contrairement à l’opinion de cet auteur, on peut, à condition d'employer une technique convenable, élever de jeunes Poussins aseptiquement, pendant 15, 20, 30 et même ho jours, sans que cette vie aseptique entraine aucune déchéance

de ces organismes.

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Stérilisation des élevages de Dr. ampelophila (1).

Deux méthodes au moins s’offraient pour tenter d'obtenir des élevages aseptiques de la Mouche choisie comme objet d'expérience. La plus naturelle et aussi la plus rapide consistait à stériliser des œufs, au moyen d’un antiseptique. C'est celle qu'avait utilisée Bogpaxow dans ses recherches, et que j'avais employée pour les œufs de Lucilia et de Calliphora. Je commençai par l'appliquer au cas des Drosophiles, en plongeant des œufs, pendant un temps varié, dans une solution de sublimé à 1 p. 1000 ou de permanganate de potasse à 1 p. 1000 ou dans leau oxygénée à 10 volumes. Ces essais, d’ailleurs difficiles en raison de la petitesse des œufs, n’ont peut-être pas été continués avec beaucoup de persévérance, car ils donnèrent des résultats peu encourageants. Le sublimé tuait nettement les œufs, alors que certains microorganismes persistaient ; même résultat fut obtenu avec les solutions de permanganate. L’eau oxygénée se montra moins toxique, mais les larves qui éclorent, placées sur de la purée de pommes de terre stérilisée, errèrent lentement à la surface de ce milieu et moururent au bout de 2 ou 3 jours sans s’être aucunement développées. La suppression des Microbes était bien obtenue, mais mes connaissances relativement à la nourriture utilisée par les Drosophiles étaient alors trop peu avancées pour que Je sache quel aliment leur offrir, qu’elles puissent assimiler.

Le passage brusque de l’état septique à l’état aseptique soulevait donc des problèmes que je ne pouvais résoudre ; il risquait ou d'amener une prompte disparition des individus aseptiques, ou, en Supposant que je réussisse à les nourrir tant bien que mal, de déterminer dans la lignée une modification importante de la vitalité ou de la fécondité. C’est pourquoi je choisis une méthode beaucoup plus longue, mais plus sûre, qui me permit tout en acheminant mes élevages vers l’état aseptique, d'étudier de plus près la nutrition des Drosophiles et la façon dont les microorganismes interviennent dans ce processus.

La méthode que j'ai employée n’est qu'une application à ce cas particulier des procédés d’enrichissement et d'isolement

(t) Travail effectué avec la collaboration de À, DeLcourr

utilisés couramment en bactériologie. Lorsqu'on se trouve en présence d’un complexe microbien d’où lon veut séparer telle ou telle Bactérie, on ensemence le produit sur des milieux où la Bactérie cherchée pousse électivement et on fait plusieurs passages successifs sur ces mêmes milieux; on dilue ensuite la dernière culture dans de l'eau stérilisée et l’on part de cette dilution pour obtenir des colonies pures du Microbe étudié. Si on dilue suffisamment une culture en ensemençant par exemple tr goutte dans 10 centimètres cubes d’eau, puis 1 goutte de cette émulsion dans une nouvelle quantité d’eau et ainsi de suite, on arrive à une dilution telle que si on ensemence en autant de tubes de culture un grand nombre de gouttes de cette dilution, on pourra arriver à Ce que seulement 1 goutte sur D, 1 goutte sur 10 contienne un germe et serve de point de départ à une nouvelle culture pure.

Mon plan à donc été : 1° après avoir étudié la flore d’un élevage donné, choisi

parmi les moins contaminés, d’en faire

passer aseptiquement les représentants sur

une série de milieux stérilisés de façon à KW )

n'introduire dans le système aucun micro + Fig. 1. — De gauche à

organisme nouveau; 2° d'utiliser, dans la mesure où cela ne nuirait pas à l’évolution de la Mouche, des milieux spéciaux afin de simplifier progressivement le complexe microbien et d'obtenir un élevage avec seu-

droite : a, tube d’élevage ; D, obturateurs cn basuette rem plaçant l’obturateur, lorsqu'on veut presser sur la sur-

face du milieu nutritif pour la rendre plus humide.

lement un ou deux microorganismes, choisis parmi ceux paraissant les plus utiles ; 3° de laisser en route le ou les microorganismes en question en recueillant sur des milieux successifs la ponte de femelles transportées toutes les heures sur des milieux nouveaux. Les Mouches absorbant incessamment une nourriture stérilisée nouvelle, et quittant chaque milieu bien avant que les microorganismes qu’elles y ont déposés aient eu le temps de pousser, on pouvait espérer obtenir, à la longue, dans cer-

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tains milieux, quelques œufs pondus dans des conditions aseptiques. C'est ce qui s’est en effet produit.

Technique. — Pour réaliser une semblable opération, il fallait avant tout mettre au point une technique permettant d'élever, de transporter, d'examiner aseptiquement les mouches en expérience. Cette technique après bien des tâtonnements à été obtenue, et c’est elle que je vais décrire tout d’abord.

1° Récipients d’élevages. — Les récipients utilisés sont de deux types ; pour obtenir des Mouches en grand nombre, j'ai utilisé des fioles coniques à fond plat de 1 litre à 3 litres de capacité. Sur le fond est disposé en une couche plus ou moins épaisse le milieu nutritif (marmelade de pommes, purée de pommes de terre) additionnée ou non de certaines substances. Dans ces fioles peuvent se développer plusieurs centaines ou même quelques milliers d'individus. Lorsque je désirais recueillir la descendance d’un couple, ou transporter fréquemment d’un milieu sur un autre une même femelle, j’employais des tubes à culture (forme tubes à essai, fig. 1,4) contenant soit de lamarmelade de pommes, soit de la purée de pommes de terre, soit un fragment de pomme de terre, ainsi que cela se fait couramment en bactériologie. Pour maintenir ce dernier milieu suffisamment humide, je plaçais au fond du tube un tampon de coton imbibé d’eau. Le tube à étranglement pour cultures sur pommes de terre n'aurait pas convenu, car les Mouches ou les larves auraient pu tomber dans l’eau du fond du tube et s’y noyer. Tous ces milieux ont été stérilisés à l’autoclave à 120° pendant une demi-heure à une heure.

Fioles et tubes sont bouchés à l’ouate, mais d’une façon un peu spéciale. Une baguette de verre plein (fig. 1. 4), présentant à sa partie supérieure un renflement, constitue l'axe autour duquel on enroule la bande de coton servant à confectionner le bouchon. Une fois ce bouchon en place, si l’on retire la baguette de verre ou obluraleur, il reste un canal central perméable, dans lequel on peut introduire à nouveau la baguette ou n'importe quel tube de verre de même calibre. Le renflement conique de la baguette donne à l’orifice du bouchon une forme évasée qui facilite l’introduction des tubes ou baguettes utilisées.

2 Transport aseptique des Mouches. — Jai employé pour transporter les Mouches, des tubes de verre (fig. 2) présentant

trois parties : une boule renfermant du coton destiné à arrêter les microorganismes de l'air et terminée à son extrémité libre par un goulot permettant d’y adapter un tube de caoutchouc; à la boule fait suite un tube large de 8 millimètres,

Fig. 2.—Tube de transport à orifice Fig. 3. — Schéma représentant l’enlatéral ou terminal. semble de l'installation utilisée pour le transport aseptique des

Mouches.

long de 3 à 4 centimètres environ, formant une chambre dans laquelle plusieurs dizaines de Mouches peuvent prendre place ; enfin ce tube est soudé à un tube plus fin ayant exactement le calibre de la baguette utilisée comme obturateur, long de 20 à

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25 centimètres, et se terminant par une ouverture à bords rodés

terminale où par un œil latéral.

Le transport des Mouches se fait de la façon suivante : après

Fig. 4. — Gros tube servant à stériliser et à conserver les tubes de transport.

avoir introduit le tube de transport dans un récipient d'élevage contenant des Drosophiles, on aspire les Mouches qui s'accumulent alors dans la partie élargie du tube de transport ; on cesse à ce moment aspiration, le tube est retiré du flacon d'élevage, puis introduit dans un récipient neuf où l'on fait pénétrer les Mouches en renversant le courant d'air, c’est-à-dire en soufflant au lieu d’aspirer.

L’aspiration et le refoulement des Mouches se font au moyen d’une soufflerie à pied, reliée par un robinet à 4 voies, à un caoutchouc que l’on adapte lui-même au tube de transport (fig. 3).

Suivant que l’on donne à la manette du robinet une situation verticale ou horizontale, les mouvements de la "pédale ont pour effet de déterminer un courant d'aspiration ou de refoulement.

Les tubes de transport sont stérilisés dans des tubes de grand calibre par groupes de 5 ou 6 (fig. 4). Les tubes de transport traversent le bouchon decoton de ces tubes et peuvent en être retirés au fur et à mesure des besoins.

Chaque opération de retrait d’un obturateur où d'introduction d’un tube de transport se fait le bouchon de coton du tube d'élevage étant maintenu dans la flamme d’un bec Bunsen.

Pour mieux faire comprendre le détil de cette technique je vais décrire

par temps successifs la façon dont on transporte des Mouches d’un récipient d'élevage À, dans un récipient B.

10 On prend un des gros tubes, contenant les tubes de transport stérilisés, et on flambe le bouchon de coton que traversent ces tubes de transport.

2° On flambe le bouchon de coton du tube d'élevage A; on en retire l’obturateur tout en maintenant le bouchon du tube A dans la flamme ou à son voisinage immédiat.

30 On prend un tube de transport stérilisé et on l’introduit — toujours au milieu de la flamme — dans le bouchon du tube A, à la place de lPobturateur, jusqu’au niveau voulu. On laisse le tube de transport se refroidir.

49° On place verticalement la manette du robinet et on donne quelques coups de pédale qui déterminent un mouvement d’aspiration. Il faut en quelque sorte viser les Mouches avec l’orifice terminal du tube de transport. L’œil latéral, que l’on peut diriger dans n'importe quel sens, en faisant tourner le tube de transport, permet de les recueillir sur les différents points de la paroi. Quelques secousses font descendre les Mouches situées trop haut jusqu'au niveau de l'ouverture du tube de transport. On peut d’ailleurs enfoncer plus ou moins profondément ce dernier dans le tube d'élevage, à condition de flamber le bouchon, lors de cette opération (pour ne pas introduire sans flambage les parties du tube laissées à l'extérieur et pouvant avoir reçu des poussières). Par ce procédé les Mouches sont rapidement aspirées et se trouvent réunies dans la partie élargie du tube de transport. Cet espace est fermé en haut par la boule de coton contenue dans le renflement.

50 On cesse l’aspiration. Les Mouches restent dans la partie élargie du tube de transport à condition de maintenir cette partie en haut et dans la direction de la lumière (les Mouches sont retenues dans cette situation par leur géotropisme négatif et leur phototropisme positif). On flambe fortement l’obturateur qui avait été retiré au temps 2. On retire le tube de transport et — dans la flamme — on le remplace par l’obturateur flambé. Le tube A se trouve ainsi fermé à nouveau.

60 On prend le tube neuf B. On retire son obturateur comme il a été dit au temps 2, et on introduit à sa place le tube de transport comme il a été dit au temps 3. Avant d’être introduite, la partie mince de ce tube, c'est-àdire celle qui doit pénétrer en B, a été fortement flambée.

79 On laisse refroidir le tube de transport; on place horizontalement la manette du robinet à 4 voies et on donne quelques coups de pédale. Le courant d’air inversé refoule les Mouches et les chasse dans le tube d'élevage B. l’air est stérilisé par son passage sur le filtre de coton stérile que renferme la boule du tube de transport.

80 On retire le tube de transport et le remplace par l’obturateur flambé comme il a été dit au temps 5. Le tube B se trouve ainsi à nouveau fermé.

Ces manipulations paraissent au premier abord fort compliquées ; avec un peu de pratique, elles deviennent cependant très simples. Je suis arrivé à effectuer facilement plusieurs transports en une minute et à manipuler aseptiquement des centaines et des milliers de Mouches par jour. Je ferai remarquer que ce procédé, rendu nécessaire pour éviter que des Mouches s’envolent, est. supérieur à la technique d’ensemencement utilisée en bactério-

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logie, puisqu’alors on ouvre complètement les tubes de culture pendant un certain temps et à plusieurs reprises. lei le récipient est en somme toujours fermé et pendant les quelques secondes où le canal central du bouchon est ouvert (entre le retrait de l’obturateur et lPintroduction du tube de transport ou inversement), cet orifice est constamment maintenu dans la flamme d’un

< bec Bunsen. L'air qui pénètre dans le tube d'élevage est filtré, lors de laspiration, sur le bouchon de coton et pendant le refoulement, sur le tampon de coton du tube de transport. La valeur de cette méthode ressort du fait que, pendant cinq ans, j'ai manipulé ainsi des centaines de mille de Mouches aseptiques sans avoir pour ainsi dire jamais eu de contaminations accidentelles.

Il restait à concilier cette méthode de transport avec un procédé permettant d’examiner attentivement les mouches et à un grossissement suffisant. Il fallait pour cela en assurer limmobilisation sans toutefois les faire sortir de leur enceinte aseptique. Dans ce but, j'ai employé des tubes de transport dont la partie élargie est aplatie de façon à présenter deux faces à peu près planes (Hg. 5). De plus cet aplatissement est fait de telle manière que l’espace entre les deux faces va en diminuant progressivement. La

section perpendiculaire de cet espace a donc la forme d'un triangle allongé dont le som- Fig.5.—Tubed'exa- met aigu se trouve du côté du renflement men vu de face et :

don contenant le tampon de coton. En aspirant une Mouche dans ce tube d'examen, celleci entraînée par le courant d'air est légèrement coincée entre les deux faces de plus en plus rapprochées et se trouve par suite immobilisée. Il suffit alors de placer cette partie du tube d'examen sous l'objectif d’une loupe binoculaire pour pouvoir examiner, tout à son aise, sur toutes les faces et avec de forts gTOSsissements, les Mouches en question. L'examen terminé, il nya qu'à renverser le courant pour chasser la Mouche et la refouler

dans le récipient d'élevage où elle se trouvait primitivement. Il va sans dire que l'introduction et le retrait de ces tubes d’examen se fait exactement comme pour les tubes de transport ordinaires et qu'ils peuvent remplacer ces derniers pour le transport isolé des Mouches examinées delle re

Passage d’élevages septiques à des élevages sur une Levure en culture pure. — Disposant de plusieurs lignées de Drosophiles transportées aseptiquement, suivant le procédé que Je viens de décrire, sur des milieux stérilisés, constitués par de la marmelade de pomme et de la purée de pomme de terre, je commençai par étudier la flore que chacune de ces lignées transportait avec elle de récipient en récipient. Je ne décrirai pas toutes les constatations que j'ai faites alors, ayant d’ailleurs négligé bien souvent de poursuivre Pidentification des formes trouvées. Je me contenterai d'indiquer la présence de nombreuses Moisissures ({Mucor, Oospora, Penicillium, Aspergillus), de Levures (Mycoderma aceti, Saccharomyces), de Bactéries diverses (B. mesentericus vulqatus, B. aceti, M. prodigiosus… etc).

Parmi ces différentes lignées, je choisis celle qui me parut la moins riche en microorganismes. Les cultures faites sur bouillon, gélatine, gélose et pomme de terre montrèrent lexistence de Penicillium glaucum: Oospora sp.? S'accharomyces, B. acetr et d’un Bacille indéterminé.Je commençai par essayer de me débarrasser du plus dangereux de ces microorganismes, du ?. glaucum. Pour cela je mis à profit l'observation que j'avais faite que ce Champignon prospérait mal sur les milieux contenant du vinaigre ou de l'acide acétique.

Je relate ici, en mettant entre parenthèses les numéros des bocaux et des fiches correspondantes, l’histoire de cette lignée (1).

ve étape. — Les Mouches capturées dans une vinaigrerie le 5 novembre 1909, élevées sur marmelade de pommes (/77) et ayant apporté avec elles les microorganismes que Jai décrits, furent transportées le 11 novembre, au nombre de 300 environ, sur de la marmelade de pommes additionnée de vinaigre (485) (50 grammes par litre). L'examen du milieu montra lexistence des mêmes microorganismes que précédemment, mais le >S fil: aments mycéiiens de Penicillium présentaient des traces de dégénérescence Cette Moisissure ne put fructifier et ses filaments se divisèrent en éléments rectang ulaires, souvent vides de protoplasmi \ ou présentant des altérations

variées. Les Mouches furent ainsi transportées de milieu vinaigré en milieu vinaigré pendant quelques générations. Le 4 avril, 30 de re descendants

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furent placés dans une fiole contenant, au lieu de marmelade, du coton stérilisé imbibé de vinaigre stérilisé, puis ensemencé avec une culture pure de B. aceti (677). Un couple témoin, placé sur pomme de terre (678) apporta avec lui des Moisissures et des Levures qui se développèrent abondamment. Les Mouches de 677 furent laissées pendant dix jours sur le vinaigre, dont les ensemencements ne donnèrent que du B. aceti. Le 19 avril, les 27 survivantes furent isolées et réparties une par une dans >7 tubes (701 à 727) renfermant divers milieux nutritifs stérilisés. Dans certains tubes, les Mouches moururent sans laisser de descendants. Parmi ceux où se développèrent des larves, on trouva, suivant les cas, de la Levure et du ferment acétique avec ou sans Moisissure blanche ou verte. Cette dernière se présentait d’ailleurs sous forme de filaments en voie de dissociation. Dans un des tubes (723) où le milieu nutritif était de la purée de pommes de terre additionnée, avant stérilisation, de vin et de vinaigre, on ne trouva que des Levures en sporulation et du ferment acétique. Le Bacille indéterminé et les Moisissures se trouvaient donc éliminés.

Les observations faites entre temps avaient montré que les larves et les Mouches paraissaient se nourrir moins du milieu nutriuf lui-même (marmelade, pommes de terre, vinaigre) que des microorganismes et principalement de la Levure qui se développaient sur ces milieux. La rapidité de croissance des larves sur les divers milieux était fonction de l’intensité de la culture de la Levure sur ces milieux. Les coupes de larves montraient l’intestin bourré de Levures, à divers stades de digestion. Je fus donc conduit par ces observations à tenter d'obtenir des élevages sur Levure pure, en éliminant le B. acetr.

2e élape.— Pour cela la femelle pondeuse de 7235 fut transportée le 14 mai, sur un milieu artificiel (Sz0) où se développèrent des larves et où on trouva encore dela Levure et du ferment acétique Le 4 juin, un couple de ses descendants, nés en #70, fut mis sur pomme de terre en tube (87/), puis fut transporté chaque jour du 13 au 18 juin sur une nouvelle pomme de terre. Les préparations indiquèrent la présence, dans tous ces tubes, de Levure et de queiques Bacilles de plus en plus rares Le 19 juin, la femelle fut transportée sur une pomme de terre en tube que l’on avait préalablement ensemencée avec une culture pure de la même Levure que celle dont la Mouche était infestée. Ce transport fut renouvelé le lendemain à 10 heures du matin (922) puis à 6 heures du soir (425). Le 21, nouveau transport sur un milieu semblable de pomme de terre préalablement ensemencée de Levure pure, mais la Mouche mourut par accident {926).

Dans le tube 925, cette Mouche avait déposé des œufs qui donnèrent des larves, puis des imagos. Les Mouches écloses dans ce tube furent transportées le 11 juillet sur divers milieux dans lesquels elles u’apportèrent que de la Levure en culture pure ; la 2e étape était ainsi franchie. Ces Mouches à Levure pure furent mises en reproduction, en grand, sur de la purée de pomme de terre, de juillet 1910 à mai 1971.

à ! TRS TO) . ù Tous les élevages, réalisés dans ces conditions, contrastaient

singulièrement, par l'intensité et l'uniformité de leur développement avec tout ce que J'avais obtenu précédemment. Plus de ces récipients où des générations entières mouraient étouffées par les Moisissures et les Bactéries de la putréfaction, développant des odeurs exécräbles ; plus de ces élevages souffreteux dans lesquels les femelles mouraient après avoir laissé quelques descendants dont bon nombre n’arrivaient pas au terme de leur développement. Au contraire, J’'obtenais des Mouches grosses et vigoureuses, vivant et pondant régulièrement pendant deux à trois mois, à 24°. A cette température, les larves évoluaient en 12 jours et la quasi totalité des descendants aboutissaient à l’imago. Ce premier résultat fut des plus encourageants.

2° partie. — Passage d'élevages avec levure pure aux élevages aseptiques. — [1 fallait maintenant essayer de laisser en route la Levure en culture pure et d'obtenir des Mouches réellement aseptiques. Pour cela il était nécessaire au préalable de fournir aux Mouches un milieu nutritif sur lequel elles puissent prospérer. Persuadé que la Levure vivante constituait la partie essentielle de leur alimentation, je préparai des milieux constitués par une dilution de Levure de bière légèrement autolysée et stérilisée et par du coton hydrophile. En juillet r910, des Mouches à Levure pure furent isolées et transportées sur une série de milieux ainsi préparés. Ce milieu se montra très favorable au développement des Mouches et très défavorable à celui de la Levure vivante. Après un grand nombre de passages sur Levure, les Mouches furent transportées — toujours individuellement — sur de la pomme de terre. Quelques-unes, bien qu’elles aient abondamment pondu, ne déterminèrent la culture d'aucune Levure sur ces pommes de terre. Des larves purent bien éclore, mais elles errèrent à la surface de la pomme de terre sans se nourrir et moururent. Ces Mouches sans Levure furent alors transportées sur de nouveaux milieux à base de Levure stérilisée et donnèrent une descendance qui se montra aseptique (fin juillet 1910).

Obligé d'abandonner momentanément ces recherches, je fus dans l'impossibilité de suivre plus loin cette lignée asepuque. En mai 1911, Je cherchai à nouveau, en partant de mes Drosophiles sur levure en culture pure, à réaliser des élevages aseptiques.

Pour cela, des Mouches qui se développaient avec Levure pure, sur

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pomme de terre (71/6), furent réparties le 18 mai. isolément ou par groupes de 15 à 20, dans 13 tubes renfermant de la Levure de boulangerie stérilisée, sur coton, Ces Mouches furent transportées chaque jour dans de nouveaux tubes de levure stérilisée du 18 au 20 mai. Le 21 mai toutes les femelles furent isolées et réparties dans autant de tubes de levure stérilisée, et transportées tous les jours dans de nouveaux tubes. A partir du 22 mai, on examina attentivement, au moyen de cultures sur carotte ou pomme de terre ou sur gélose sucrée, la flore des tubes pour savoir s'ils contenaient ou non la Levure vivante apportée par les mouches. De temps en temps, j'intercalais entre deux tubes à Levure stérilisée, des tubes à pomme de terre servant d'indicateurs. Dans tous ces tubes, les femelles, pendant leur passage, déposèrent des œufs fécondés. Les descendants nés dans tous ces récipients, furent recueillis un à un, au fur et à mesure de leur éclosion et isolés dans autant de tubes où on examina leur état aseptique ou non,

L'étude, tant des milieux de passage des diverses femelles, que des descendants nés dans ces milieux, montra que certains contenaient encore la Levure vivante, tandis que ‘d’autres en étaient dépourvus. Le tableau suivant indique comment, pour Q femelles prises en exemple, la stérilisation des pontes fragmentées par les transports effectués toutes les 24 heures s’est trouvée réalisée ; les chiffres gras correspondent aux tubes où on observa la présence de levure vivante.

Dares Numéros des passages successifs 23 Mai| 1253 | 1248 | 4243 | 1254 | 4247 | 1242 | 1245 | 1254 | 1244 21 1206 | 1257 | 4258 | 1259 | 4260 | 1261 | 1262 | 1265 | 1266 25 1274 | 1207 | 1270.| 1273 | 4275 | 1276 | 1277 | 1268 | 1267 26 1284 | morte | 1282 | morte | morte | 1285 | 1278 | 1280 | 1284 27 1201 1200 1286 | 1289 | 1288 | 1292 28 1299 . 1208 morte | 1297 | 1296 | 1300 2) 1300 1309 1304 | 1303 | 1307 30 1912 1311 1310 | 1309 |1313(1) 31 1327 1326 1325 | 1324

1Juin| 1339 1338 1337 | 1336

() » » morte »