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ÉLEVAGES DE DROSOPHILA AMPELOPHILA SUR MILIEUX NUTRITIFS ARTIFICIELS PRÉCISION CHIMIQUE DU MILIEU

Il est incontestable que l'emploi de levure stérilisée pour la nutrition des Drosophiles aseptiques réalise des conditions d’élevage exceptionnellement bonnes : non seulement on peut dire que la totalité des individus — hormis les cas de mort purement accidentelle — se développent régulièrement, mais il est certain que le milieu nutritif possède une constance qu'aucun autre procédé d'élevage ne saurait égaler. J’aurais donc pu m'en tenir à ce degré de précision dans la connaissance du milieu et étudier l’influence des différents facteurs externes sur les Drosophiles, en même temps que J'aurais recherché la nature héréditaire ou non héréditaire des variations ainsi produites. En fait j'ai pu réaliser, dans ces conditions, d’intéressantes expériences relatives aux facteurs de la fécondité des Mouches, expériences que je relaterai dans un chapitre ultérieur.

Cependant le milieu nutritif constitué par la Levure stérilisée présente, eu égard au but que je poursuivais, deux défauts. D'abord sa constance n’est que relative : la Levure en pains que J'utilisais peut renfermer diverses impuretés provenant du milieu sur lequel elle s’est développée; de plus elle peut présenter des différences assez grandes de composition suivant son âge, suivant notamment qu'elle est depuis plus ou moins longtemps en état de jeûne et consécutivement d’autophagie. Telle Levure, qui fraîchement récoltée renfermera beaucoup de glycogène, pourra n'en plus contenir après quelques heures d’inanition. D'autre part, la Levure est un aliment complexe qu'il faut employer tel quel, sans en connaître très exactement la composition et surtout sans qu'il soit possible d’en faire varier à volonté les éléments consütutifs.

Cette connaissance et cette maîtrise aussi complètes que pos-

sible des conditions du milieu que je m'étais proposé d’atteindre, je ne pouvais espérer l'obtenir qu’en réalisant des milieux nutritifs artificiels, fabriqués de toutes pièces en partant d’éléments connus. Une fois établie la liste des constituants nécessaires et suffisants, ainsi que leur utilisation dans la nutrition de l’organisme étudié, ce ne serait plus qu’un jeu d'introduire à volonté, et d’une façon raisonnée, des variations en plus et en moins dans la constitution qualitative et quantitative de ces milieux.

Cette entreprise qui, théoriquement, paraît assez facile à réaliser, se heurte pratiquement à des difficultés énormes. Sans doute, par l'usage combiné des cultures aseptiques et sur milieux chimiquement définis, M. Mozriarp à pu réaliser, sur des végétaux, des expériences du plus puissant intérêt, mais toutes les tentatives de ce genre ont complètement échoué, en ce qui concerne les animaux. Il s’agit cependant d'expériences où lon a utilisé des principes alimentaires qui sont loin d’être des produits aussi simples et aussi définis que ceux dont j'avais l’intention de me servir.

C'est ainsi que Lunix, après avoir constaté que des Souris pouvaient être maintenues en vie très longtemps lorsqu'on les nourrissait exclusivement de lait, chercha vainement à remplacer cet aliment naturel par un mélange de ses éléments constitutifs ou de substances analogues. Il utilisa comme graisse et comme protéique, le beurre et: la caséine, obtenues après précipitation du lait étendu d’eau par l'acide acétique. A ces substances il ajouta du sucre de canne et un mélange des sels normalement contenus dans le lait. Le milieu nutritif artificiel ainsi constitué fut accepté aisément par les Souris, mais celles-ci ne tardèrent pas à manifester des signes de déchéance et toutes moururent au bout de 20 à 30 jours.

Un autre expérimentateur, Soin (!), n’obtint pas de meilleurs résultats en essayant de nourrir des Souris avec un mélange de sérum de Cheval, de graisse, d’amidon, de sucre, de cellulose (destinée à éviter l’obstruction intestinale), de sels minéraux et d’un aliment ferrugineux.

{t) Cité d’après E. LammranG, Précis de biochimie, p. A75.

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De même Kwapr (35) ne put réussir à maintenir en vie des Rats nourris avec un mélange d’albuminoïdes, de graisses, d’hydrates de carbone et de sels. Les animaux s’affaiblirent, beaucoup devinrent malades et tous moururent assez rapidement.

Au cours d’expériences faites sur les Pigeons, Jacog (31) fut également impuissant à faire vivre ces animaux en les soumettant à une alimentation arüficielle, même en utilisant le gavage. Des Rats que le même auteur nourrissait avec un mélange de caséine, de graisse, de sucre, de sels et de cellulose, utilisés en proportions diverses et donnés à discrétion, ne vécurent que peu de temps, le maximum ayant été de 124 jours. Dans certains cas, ces Rongeurs présentèrent une diminution de poids régulière que rien ne put enrayer.

Un résultat un peu plus satisfaisant a été obtenu par Rôu- MANN (b1) en fournissant à des Souris une alimentation très complexe, formée de caséine, ovalbumine, vitelline, amidon de pomme de terre, amidon de blé, margarine et sels minéraux. Les jeunes Souris purent être maintenues assez longtemps en vie et même atteindre la maturité sexuelle, mais ces animaux demeurèrent d’une taille inférieure à celle des témoins et de plus ne donnèrent que des petits non viables.

Pensant que les mauvais résultats constatés dans les expériences de cet ordre pouvaient être dus à l'absence dans la ration alimentaire de certaines substances telles que les lipoïdes ou les nucléoprotéides, Fazra et NœGGEeraTH (20) firent toute une série d'essais très intéressants, en nourrissant des Rats blancs avec diverses nourritures artificielles contenant ou non du nuceléinate de soude, de la iécithine et de la cholestérine. Ces milieux artificiels comprenaient : comme albuminoïdes, l’ovalbumine très pure, la caséine pure, la séralbumine, la séroglobuline, la fibrine et l’hémoglobine ; comme graisses, celles du lard de Pore, purifiées par plusieurs dissolutions dans l’éther ; comme hydrates de carbone, l’amidon et le sucre de raisin ; comme sels, des mélanges de carbonate et phosphate de chaux, chlorure de magnésium, etc., ou les sels du lait obtenus par calcination, ou les sels du sérum de cheval. Les animaux acceptèrent volontiers cette nourriture et ne présentèrent pas de troubles intestinaux ; leur courbe de poids ne fléchit même que pendant les derniers Jours. Cependant tous moururent, quelle que soit la ration ali-

mentaire, que celle-ci contienne ou non du nucléinate de soude et des lipoïdes. Les Rats nourris à la séralbumine moururent au bout de 51 à 53 jours, après avoir perdu les 3/5 de leur poids initial. L’emploi des autres albuminoïdes permit une survie un peu plus longue, de 83 à 94 jours ; au moment de la mort les animaux n'avaient alors perdu que la moitié ou les trois quarts de leur poids. Pendant ce temps, des Rats témoins, nourris avec du lait de Vache, ou du lait en poudre, ou de la viande de Cheval maigre, continuaient à vivre normalement.

Il est bien difficile de dire à quoi sont dus les échecs de toutes ces tentatives de nutrition artificielle. L’insuffisance de la nourriture employée est-elle due à l’absence de quelque substance indispensable à la vie, même en petite quantité, que contiendraient les aliments naturels? Ou bien faut-il admettre que les principes utilisés, du fait des manipulations subies pendant leur préparation, ont été modifiés au point d’avoir perdu de leur valeur alimentaire ou même d’avoir acquis un certain degré de toxicité ? La seule indication que l’on puisse tirer de la comparaison des diverses expériences est que les résultats paraissent avoir été d'autant plus mauvais que la nourriture était formée d'aliments plus simples et plus purs. À cette question se trouvent ainsi rattachées diverses constatations faites sur la nocivité de certains aliments trop purifiés. Des animaux ont, en effet, pu être maintenus en vie au moyen d’une alimentation exclusive avec du pain riche en son, tandis qu'il n’en est pas de même si on emploie du pain blanc, fait avec une farine très purifiée- Il semble qu’il y ait dans les aliments naturels certaines impuretés que lon ne saurait exclure impunément de la ration alimentaire. Je reviendrai ultérieurement sur ce problème auquel certaines de mes expériences nous ramèneront.

On voit par cet exposé que le projet que j'avais formé d'élever aseptiquement des Drosophiles sur des milieux nutritifs artificiels risquait de se heurter à de graves difficultés. Mais on comprendra aisément l'intérêt qu'il y avait à tâcher de préciser les conditions nécessaires à la réalisation d’une semblable tentative.

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Nécessité d’opérer avec des élevages aseptiques

Avant d'exposer le résultat de mes expériences, il est un fait que je tiens à mettre dès maintenant en relief : c’est qu'il eut été absolument vain de chercher à constituer des milieux nutritifs artificiels en opérant avec des Drosophiles septiques. L’obtention d’élevages aseptiques de ces Mouches était la préface nécessaire aux recherches ayant pour but d'étudier de plus près la constitution chimique du milieu nutritif.

Il est, en effet, facile de comprendre que tous les milieux artificiels que l’on peut imaginer conviennent nécessairement plus ou moins au développement des Microbes ou des Champignons qu’apportent avec elles les Mouches prises dans la nature ou provenant d’élevages septiques. Ces microorganismes ne sauraient être considérés comme indifférents puisque leur activité biochimique souvent considérable peut opérer dans le milieunutritif des transformations de grande amplitude (fermentation des sucres, destruction des albuminoïdes avec production d’acides gras, d'acides amidés, d’éthers, de gaz, etc.). D’autre part, on ne saurait tenir pour négligeable la masse même formée par la culture de ces microorganismes : nous avons vu que les Levures constituaient pour la Mouche un excellent milieu nutritif et que ce sont ces Champignons qui, dans les conditions naturelles, représentent son principal aliment. Il est dès lors évident que tout milieu artificiel, incapable par lui-même d’assurer la nutrition des Mouches, paraîtrait cependant leur convenir parfaitement sil permettait une culture abondante des Levures apportées par les Drosophiles.

En voici d’ailleurs la démonstration expérimentale :

Alors que je ne possédais pas encore de Mouches aseptiques mais seulement des élevages de Mouches avec une Levure vivante, en culture pure, j'essayai, pour orienter mes recherches ultérieures, divers milieux nutritifs artificiels. L'un d’eux, par exemple, composé de peptone, de glucose, de tributyrine émulsionnée et de sels minéraux (phosphate de chaux, de soude, de potasse, sels de magnésie, de fer, etc.), donna des résultats très encourageants. Les Mouches pondirent abondamment, les larves se développèrent régulièrement, quoiqu’un peu moins vite que

sur les pommes (le terre servant de milieux témoins. La plupart d’entre elles se transformèrent en pupes et donnèrent naissance à des Mouches de belle taille. Celles-ci, transportées sur des milieux de même composition, y fournirent une deuxième génération assez abondante.

A la vérité, ces résultats si satisfaisants ne laissèrent pas de m'étonner, d'autant que je m'attendais à rencontrer d’énormes difficultés dans ces tentatives d’élevages sur milieux artificiels. Bien plus, même en introduisant dans ces milieux des modifications assez importantes dans la nature des protéiques, des graisses ou des sels minéraux employés, les résultats restaient assez comparables.

Cependant, en abaissant considérablement le taux de peptone ou même en supprimant cet élément, le développement des Mouches devenait misérable ou cessait. Sur milieu sans peptone, par exemple, les larves s'accroissaient très lentement pendant les premiers jours, puis mouraient bien avant d’avoir atteint leur taille maxima ; exceptionnellement quelques-unes se transformaient en pupes très petites qui se desséchaient aussitôt. Au contraire, le développement se faisait de mieux en mieux, au fur et à mesure que l’on ajoutait des quantités croissantes de peptone (1, 2,9; 10 p. 100)-

De même, la teneur en glucose parut exercer une très grande influence. Très réduit sur des milieux sans glucose, le développement des Mouches devenait de plus en plus luxuriant à mesure que l’on ajoutait des quantités plus élevées de ce sucre (1,5, 10, 15, 18 p. 100).

De ces expériences j'aurais pu, semble-t-il, tirer les conclusions suivantes : 1° qu'un milieu artificiel, composé de peptone, glucose, graisse et sels minéraux suffisait à assurer la nutrition des Mouches ; 2° que celles-ci utilisaient la peptone et le sucre et se nourrissaient d'autant mieux que ces deux substances leur étaient fournies en plus grande quantité.

Cependant, désireux de préciser toutes les conditions du phénomène, j’étudiai comparativement le développement de la Levure vivante, apportée par les Mouches, sur ces différents milieux et je me rendis nettement compte que ces milieux renfermaient une culture de Levure d'autant plus abondante qu’ils paraissaient être plus favorables au développement des Mouches. Ce fut mème

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cette constatation qui me conduisit à m’assurer d'une façon plus directe, de la valeur alimentaire de ces champignons pour les Drosophiles. Dans ces conditions, l’action favorisante du glucose, même en concentration élevée (18p. 100), s’expliquait d’ellemême.

Lorsque plus tard j’essayai à nouveau les mêmes milieux artificiels, mais cette fois avec des Mouches aseptiques, les résultats furent totalement différents. Sur aucun de ces milieux, en effet, les larves aseptiques n’arrivèrent à se transformer en pupes. Toutes moururent d'une façon plus ou moins précoce, sans avoir pu accumuler de réserves dans leur tissu adipeux et sans avoir atteint en aucun cas, le terme de leur croissance. Sur les milieux dépourvus de peptone, la croissance des larves, qui paraît alors due surtout à une absorption d’eau, est infime, cesse au bout de 48 heures et la mort survient aussitôt après. L'augmentation du taux de peptone ne favorise le développement des Mouches que jusqu’à une certaine concentration optima (voisine de 4 p. 100), au delà de laquelle son action devient nuisible. Enfin, le glucose, loin de favoriser la croissance des larves, exerce une action inverse et d'autant plus marquée que sa concentration est plus élevée.

La comparaison entre les résultats de ces deux séries d’expériences faites, l’une avec des Mouches et une Levure vivante, l’autre avec des Mouches aseptiques, montre la nécessité absolue d'effectuer les recherches de cet ordre en utilisant des élevages aseptüques. Je laisse à penser les résultats que fourniraient de semblables expériences faites avee des Mouches élevées dans les conditions ordinaires, c’est-à-dire avec toute une flore variée et changeante de Bactéries, de Levures et de Moisissures !

On comprendra que, dans ces conditions, je laisse systématiquement de côté les très nombreux essais de milieux artificiels que j'avais entrepris avant d’avoir obtenu des Mouches aseptiques. Toutes les recherches que je vais rapporter ont, au contraire, été effectuées avec des Mouches aseptiques, transportées aseptiquement sur des milieux stérilisés.

a Qc

Choix de la méthode à employer

En commençant ces expériences, j'avais à choisir entre deux procédés pour tenter de préparer un milieu nutritif artificiel, capable d'assurer la nutrition des Drosophiles aseptiques. L'un, le procédé synthétique, consistait à fabriquer de toutes pièces des milieux artificiels, en m’inspirant seulement des notions de physiologie générale de la nutrition et à les améliorer par une série d’approximations. L'autre, le procédé analytique, consistait à prendre pour point de départ le meilleur aliment naturel des Drosophiles, la Levure, et à essayer d'en séparer, par des opéraüons en série, les éléments chimiques reconnus indispensables.

Cette dernière méthode, en apparence la plus logique, se trouve être en réalité la plus difficile à suivre. Cela tient à notre ignorance, très grande encore, de la composition chimique de la Levure et à ce que les résultats d'analyse ne donnent que des indications très lointaines sur la façon dont les différents constituants sont unis ou associés. C’est ainsi, par exemple, que l’on a bien pu analyser les cendres de Levure et y doser les différentes bases (potasse, soude, chaux, magnésie) et les différents acides (chlore, acide phosphorique, acide sulfurique, etc...) mais cette analyse ne nous indique nullement à quels sels correspondent ces divers éléments. La reconstitution de ces principes minéraux est essentiellement délicate et hasardeuse. Certains éléments peuvent d’ailleurs provenir de la destruction de substances organiques complexes (albumines, lipoïdes) dont ils faisaient partie intégrante.

On sait de même que les Levures contiennent du glycogène, des graisses et des lipoïdes (présence de choline, provenant de l'hydrolyse des lécithines), mais la nature exacte de ces graisses, leurs quantités relatives n'ont été objet d'aucune étude systématique.

La connaissance des albuminoïdes de la Levure est encore des plus précaires. Ici aussi l'analyse nécessite l'emploi de procédés souvent brutaux de dissociation qui nous mettent en présence de termes que nous pouvons caractériser, mais dont le mode de groupement demeure inconnu. On a bien signalé la présence de divers acides amidés, de bases puriques, de bases hexoniques, ete.,

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mais ce ne sont là que des indications fragmentaires plutôt que les résultats d’une étude approfondie et méthodique des consttuants des matières protéiques des Levures. Récemment, il est vrai, en employant des procédés d'extraction moins violents, P. Taowas (56), puis P. Trouas et MS. KoconzresskA (57), ont pu retirer de la Levure de bière deux substances albuminoïdes : l’une qui se rapproche de la caséine et qui renferme, comme bases hexoniques, de lhistidine, de l’arginine et de la lysine, l’autre, la cérévisine, véritable albumine végétale, assez semblable à la léguméline étudiée par Ossorx et qui est caractérisée par sa teneur remarquablement élevée en lysine. Si intéressantes qu’elles soient, ces recherches n’ont encore fourni que des résultats partiels.

Vouloir partür d’une connaissance approfondie de la constituüon chimique de la Levure, pour réaliser d’après cela des milieux artificiels, aurait donc nécessité au préalable une étude chimique complète de la Levure, ce qui eut exigé un temps considérable, une installation et un matériel dont je ne pouvais disposer. C’est pourquoi j'ai d’abord cherché à réaliser des milieux nutritifs artificiels par la voie synthétique.

1'° série d'expériences : Æssais de constitution d’un milieu nutritif artificiel par voie synthétique

S'il paraît simple, a priori, de constituer un milieu nutritif artificiel en mélangeant des représentants des principales catégories de principes alimentaires, cette opération se heurte cependant à de sérieuses difficultés. C’est que nous sommes encore très peu avancés en ce qui concerne la nature des éléments indispensables à la continuation de l’existence. Si lon se reporte aux notions de physiologie générale de la nutrition qui avaient cours, il y a quelques dix ou vingt ans, il semble qu’il suffirait de fournir à un organisme de l’eau, des sels minéraux, un élément albuminoïde quelconque, des graisses et des hydrates de carbone pour qu’il fut capable, avec ces éléments, de continuer à édifier sa propre substance et püût couvrir toutes ses dépenses énergétiques. En réalité, les choses sont loin d'être aussi simples. C’est ainsi que certains minéraux sont susceptibles d'exercer une action considérable, même à des doses infinitésimales que l’on

serait tenté au premier abord de tenir pour négligeables. On discute encore pour savoir sous quelle forme certaines substances minérales doivent être présentées pour être facilement assimilables, si l'organisme les emprunte surtout à des sels minéraux ou à des sels organiques, ou encore à certains édifices moléculaires plus complexes (albuminoïdes, lipoïdes) dont elles font partie. Il n’y a que quelques années que l’on a commencé à se rendre compte de l'importance des lipoïdes dans les phénomènes vitaux et dans ceux de la nutrition en particulier. La valeur nutritive de bien des constituants des albuminoïdes est encore inconnue : on ne sait que depuis peu que le tryptophane paraît être indispensable à l'entretien de la vie. Les résultats sont encore très fragmentaires. Le cycle des transformations des bases puriques, celui des substances dites extractives, sont encore presque entièrement à étudier. Aussi ne faut-il pas s'étonner que les diverses tentatives d’alimentation artificielle, que j'ai rapportées au début de ce chapitre, n’aient abouti qu’à des insuccès.

A ces difficultés d’ordre général, s’ajoutait, dans le cas particulier d'animaux suceurs comme les larves de Drosophiles, celle tenant à la nécessité de n’utiliser que des produits solubles dans l'eau ou pouvant y être maintenus en fine suspension, et en tout cas n'étant pas modifiés dans leur état physique par un chauffage prolongé à 120°.

Malgré ces constatations peu encourageantes, j'entrepris un nombre considérable d'expériences, dont aucune ne fut, il est vrai, couronnée de succès, mais qui eurent l'avantage de préciser bien des faits et de préparer le chemin à une deuxième série de recherches opérées par voie analytique et qui furent plus fructueuses.

Expérience préliminaire. — Un des premiers milieux employés fut constitué très simplement en mélangeant à une solution de sels minéraux un représentant de chacune des trois catégories classiques de substances alimentaires. Comme protéique, J'utilisai la peptone Chapoteaut, très employée en bactériologie et qui est entièrement soluble dans l’eau, comme hydrate de carbone, le glucose, et comme graisse neutre, la tributyrine. Ce milieu (4 97) avait exactement la composition suivante :

Peptone. rprEe GICOSE EEE EE Nr 1 90-00 Tributyrine RARE NEC 2 gouttes Chlorure de potassium . . . 0 gr. 2 Phosphate trisodique. . . . 0,2

Chlorure de magnésium. . . 0,/ Phosphate monocalcique . . 0,1

Chlorure Here 0,01

Acide acétique cristal © © D: 1 goutte Hatidistilléo Se EP Q. S. pour 100 cm.

Les sels minéraux étaient dissous, à part, dans l'eau acidulée par l'acide acétique, de façon à maintenir les phosphates en solution, puis la quantité voulue du mélange minéral était ajoutée à la solution de peptone et de glucose. La graisse était ajoutée au dernier moment et mise en état d’émulsion par un secouage prolongé. 10 centimètres cubes de ce milieu étaient versés dans chaque tube de culture et l'on y introduisait aussitôt 1 gramme de coton hydrophile, servant à donner à ce milieu liquide une consistance suffisante. En même temps les mailles du coton retenant les globules graisseux contribuaient à maintenir à peu près stable l’'émulsion.

Sur ces milieux stérilisés, des Mouches aseptiques furent transportées; en même temps des Mouches de même génération furent placées sur des tubes témoins, constitués par de la Levure de boulangerie stérilisée. Les élevages furent faits côte à côte dans la même étuve maintenue à 24°. De semblables témoins ont été ainsi constitués dans {outes les expériences que j'ai effectuées.

Voici quels ont été les résultats de ces essais. Tandis que les larves nées sur Levure s’accroissent normalement, aboutissant à la pupe au bout de 6 jours et à la Mouche le onzième ou douzième Jour, les larves écloses sur milieu artificiel grossissent aussi, mais beaucoup plus lentement. Au début, il est vrai, cette croissance est assez rapide et les larves manifestent une grande activité, aspirant avec force le milieu nutritif. Bientôt cependant la croissance diminue, puis cesse; vers le dixième jour, les larves mesurent seulement le tiers ou la moitié de leur taille adulte. Elles sont minces et transparentes, leur activité diminue. Elles se promènent mollement à la surface du milieu, n’effectuant que de temps à autre des mouvements de succion ou restent immobiles pendant des heures, parfois dans les positions les plus diverses. Ces larves inertes ne se laissent distinguer des cadavres que par

er

les mouvements d’ailleurs très ralentis du cœur et de l'intestin. Souvent même, je n'ai pu m’assurer qu'il s'agissait de larves encore vivantes qu'en chauffant légèrement la paroi du tube contre lequelelles étaient collées. L’échauffement détermine alors des mouvements réflexes (mouvements des crochets buccaux, contractions du cœur, reptation} qui cessent aussitôt et la larve retombe dans son immobilité.

Quelques larves vivent ainsi jusqu'au vingt-cinquième ou tren= tième Jour, mais la plupart d’entre elles meurent beaucoup plus tôt, certaines dès le onzième jour.

En résumé, sur un semblable milieu, bien qu'il soit activement absorbé, tout au moins au début, les larves sont incapables d'aboutir au terme de leur croissance et à la pupaison. Sans doute, il ÿ a croissance, puisqu'elles passent de la taille de Pœuf à celle de 2 mm. 5 à 3 millimètres environ, mais cette croissance est lente, s’arrête bientôt et surtout ne s'accompagne pas de cette élaboration des réserves qui est indispensable à la continuation du développement.

Ce qui frappe le plus, en effet, dans ces larves élevées sur milieu artificiel, c’est leur extrême transparence. Toutes les larves sont, il est vrai, semblablement transparentes au moment de leur éclosion, mais, élevées sur Levure par exemple, elles ne tardent pas à devenir de plus en plus opaques, ce qui est dû à l’accumulation progressive de réserves, principalements de graisses, dans leur tissu adipeux. Les cellules adipeuses augmentent de volume, deviennent turgescentes, bourrées d’inclusions et leurs nappes pénètrent entre tous les organes larvaires. Sur les larves élevées en milieu artificiel, au contraire, les cellules adipeuses restent petites, formant les files ou les mailles d’un réseau qui est comme le squelette protoplasmique du tissu adipeux. Dans ces cellules qui n’augmentent pas de volume, aucune réserve n’est déposée ; cette absence totale de réserves entraine la transparence extrême des larves élevées dans ces conditions. Cette question de l'élaboration des réserves du tissu adipeux est extrèmement importante et c’est d'elle que dépend toute la suite du

développement.

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importance de l'élaboration des réserves du tissu adipeux ; la question de l’origine des graisses

Les phénomènes de nutrition sont d'autant plus intéressants à suivre sur les larves de Mouches qu'ils s’y accomplissent avec une rapidité et une intensité prodigieuses. Ce fait paraît dans foute sa netteté quand on songe qu'au cours de ses recherches sur les Mouches de la viande, E. WEINLAND a trouvé qu’au bout de 5 jours d'existence, à 25°-30°, les larves pesaient 700 fois leur poids initial.

Dans cet accroissement, l'accumulation des réserves adipeuses entre pour une part très importante puisque dans certaines évaluations la quantité de graisse contenue dans les larves représente presque la moitié du poids sec. C’est ainsi que dans ses études sur une Mouche des cadavres, Ophyra cadaverina, F. Tan@z (55) a obtenu les chiffres suivants :

Poids.soumis Teneur p. 100 en au dosage Eau Poids sec Azote Graisses Cendres Harves ARE 0,0133 69,1 30,9 2,23 14,1 1,72 PBUPDES MCE 0,009 59,7 40,3 3,19 16,4 2,81 Mouches venant d'éclore 1°: 0,0073 66,6 33,4 2,61 14,1 1,20

Les estimations fournies par E. WeixLanp (66) et faites sur Calliphora vomitoria donnent une teneur en graisse voisine du quart du poids sec. Ainsi sur 0,079 de pupes l’auteur trouva 68,4 p. 100 d’eau, 31,6 p. 100 de substances sèches dont 3,15 d'azote, 0,63 p. 100 de glycogène, 2,21 de chitine et 6,96(8 p. 100 au maximum) de graisses.

J'ai effectué sur Drosophila ampelophila aseptiques quelques dosages qui donnent une proportion assez semblable de substances grasses. En recueillant un très grand nombre de larves de divers âges, j'ai obtenu 4 gr. 445 de ces organismes représentant un poids sec de 1 gr. 375. Le dosage des acides gras fut effectué après saponification totale par la soude, mise en liberté des acides gras par un excès d'acide chlorhydrique, extraction dans Pentonnoir à décantation par l’éther anhydre, évaporation, redissolution dans l’éther de pétrole et dessiccation à 55° pendant

8 heures. Je trouvai dans ce cas o gr. 220 d'acides gras, pour la plupart solides à la température ordinaire. Ce chiffre, qui représente les acides gras, plus l’insaponifiable (cholestérine), correspond évidemment à un chiffre plus élevé de graisses neutres.

Un semblable essai fait sur une quantité beaucoup plus petite, o gr. 625, de larves transparentes, élevées sur milieu artificiel . contenant de la tributyrine, n’a donné, après évaporation de l’éther de pétrole, qu'un résidu insignifiant, o gr. 0027, formé d'acides gras liquides à la température ordinaire.

Avant de pratiquer ces dosages, les larves avaient été plongées dans Peau — ce qui détermine l’expulsion réflexe du contenu intestinal qui aurait pu fausser les résultats — puis lavées à Peau chaude et broyées.

Si l'évolution des larves de Mouches représente un cas d’accroissement d'une rapidité énorme, elle constitue donc en même temps un objet exceptionnel pour l'étude de lélaboration des réserves adipeuses ; cette étude effectuée chez des organismes aseptiques, élevés sur des milieux artificiels, paraît être particulièrement indiquée pour la solution du problème encore si controversé de l’origine des graisses animales. J’aurai à revenir sur ce sujet, lorsque j'établirai les différentes conclusions de mes recherches, mais je crois bon de résumer ici ce que lon sait de cette question, pour faciliter l'intelligence de ce qui va suivre.

C’est naturellement aux graisses alimentaires que Pon a tout d’abord rapporté l'origine des graisses des organismes animaux. La réalité d’une semblable origine, indiquée déjà par Prousr et Dumas, a été démontrée nettement par Pexpérience. HorManx par exemple a fait jeuner des Chiens d’une façon prolongée, dosé alors les graisses de lun d’eux pris comme témoin, puis nourri les autres avec des rations connues de viande et de lard. Pendant toute la durée de Pexpérience les ingesta et les excreta furent soigneusement dosés, puis les animaux furent pesés, sacrifiés et on dosa la quantité de graisse qu'ils renfermaient à la fin de l'expérience. On constata une augmentation très nette de la quantité de graisse, augmentation telle qu’elle ne pouvait provenir de la ration albuminoïde (viande), en supposant qu'une semblable transformation fut possible. La graisse en excédent dérivait nécessairement de la graisse ingérée sous forme de lard.

180 E. GUYÉNOT

On ne pouvait pas, en effet, admettre que cette graisse provint d'une dégénérescence des albuminoïdes mêmes du Chien, car cette transformation eut été accompagnée d’une excrétion énorme d'azote, excrétion dont lanalyse des urines ne montra nullement l’existence.

D’autres expériences, dont le principe est dû à Künxe, établirent, d’une façon encore plus nette et plus élégante, Putilisation par l’organisme animal des graisses alimentaires pour l’édification de ses réserves adipeuses. On sait que les graisses de chaque animal sont normalement constituées par un mélange de graisses à acides gras plus ou moins élevés et ayant un point de fusion déterminé. La graisse de Mouton, très riche en stéarine, a un point de fusion plus élevé que la graisse de Chien. Celle-ci fond en effet vers 20°, celle-là seulement au-dessus de 50°. L’expérience consiste à faire Jeuner un Chien, de façon à déterminer la consommation de la plus grande partie de ses réserves adipeuses, puis à lui faire ingérer des graisses étrangères, ayant une constitution et par suite un point de fusion très différents de ceux de ses graisses propres. C’est ainsi que des Chiens, amaigris par le jeûne, furent nourris d’une part avec de l'huile de lin qui est liquide à la température ordinaire, d’autre part avec de la graisse de mouton. Or à la fin de cette expérience due à LEBEDEFF, tandis que les Chiens normaux avaient une graisse fondant vers 20°, celle du Chien nourri avec de l'huile de lin était encore liquide à o° et celle du Chien nourri au suif ne fondait qu'au dessus de 50°. Il y avait donc bien eu absorption et fixation des graisses alimentaires.

Ces différentes recherches montrent donc indiscutablement que l'organisme animal peut, dans certaines conditions (jeûne prolongé), utiliser les graisses alimentaires et les fixer dans ses tissus, mais elles n'indiquent nullement que ce processus s’effectuât — dans les conditions normales avec cette intensité et de la même manière. En effet, bien que nourri alors au moyen d'aliments et par suite de graisses très variées, l’animal maintient constante la constitution de ses graisses et ne se contente pas de fixer passivement dans ses tissus tous les corps gras de sa ration alimentaire.

Si les graisses animales peuvent provenir, pour une part au moins, des graisses alimentaires, il est non moins certain qu'elles

peuvent être formées aux dépens des hydrates de carbone ingérés. L’engraissement des animaux par üne alimentation riche en féculents est un fait bien connu. En fournissant à des animaux des rations connues d’albumine, de graisses et d'hydrates de carbone, on a constaté que les quantités de graisses accumulées dans l’organisme étaient supérieures à celles qui auraient pu provenir des deux premières catégories d'aliments. L'origine de ce superflu ne pouvait être cherchée que dans une transformation des hydrates de carbone ingérés. La réalité de cette utilisation des hydrates de carbone a d’ailleurs été démontrée au moyen d'expériences plus compliquées, mais dans le détail desquelles je ne crois pas utile d'entrer, puisque le fait qui nous intéresse est acquis, à savoir l'élaboration, pour une part au moins, des graisses animales aux dépens des hydrates de carbone.

Une troisième hypothèse, concernant l’origine des graisses de l'organisme, consiste à faire dériver ces substances des matières protéiques. Un des principaux arguments que l’on à invoqué en faveur d’un semblable processus résulte du phénomène de dégénérescence graisseuse que l’on observe dans le cœur, le foie, les muscles, sous l’influence de certaines substances toxiques, phosphore, arsenic, chloroforme, alcool, etc. Le terme de dégénérescence vient de ce que l’on considère cette apparition de graisse comme provenant d’une transformation sur place des protéiques cellulaires. Or cette interprétation ne paraît pas conforme aux résultats de certaines expériences. C’est ainsi que RosEeNFELD a établi que la graisse déposée dans le foie, sous linfluence d’une intoxication par le phosphore, est nulle chez les animaux très amaigris et qu’elle se trouve d’autant plus importante que l’animal était primitivement plus gras. Cela veut dire que le foie ne deviendrait gras que dans la mesure où l’organisme dispose de graisses, ce qui fait penser que le phénomène pourrait bien n’être que le résultat d’un simple transport des réserves adipeuses préexistantes, correspondant à une localisation nouvelle et pathologique de ces substances. On peut se rendre compte, en effet, que la soi-disant dégénérescence graisseuse ne s'accompagne pas d’une augmentation de la quantité totale de la graisse contenue dans le corps. Si on maintient au jeûne deux animaux très semblables dont l’un reste sain et avec un foie normal, tandis que l’autre est intoxiqué par le phosphore et acquiert un foie

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gras, on trouve que la quantité totale de graisse est la même chez les deux animaux. [1 n’y a donc pas eu production de graisse nouvelle dans le foie. Une démonstration encore plus directe de ce fait a été fournie par l’expérience suivante. On fait maigrir des Chiens puis on les engraisse au suif (nous avons vu que dans ces conditions les réserves adipeuses se reconstituent aux dépens du suif, mais avec les caractères nouveaux de cette graisse étrangère). Si, à ce moment, on détermine l’engraissement hépatique, par la phloridzine, la graisse trouvée dans le foie présente elle aussi le point de fusion élevé correspondant à la graisse de mouton. Il n’en serait nullement ainsi si la graisse hépatique provenait d'une dégénérescence des protéiques cellulaires ; cette graisse résulte donc bien du transport dans le foie des réserves adipeuses du reste de l’organisme.

Une autre démonstration de l’origine des graisses aux dépens des substances protéiques, basée sur les célèbres expériences de Vorr et PeTTrENKOrER, a été longtemps regardée comme ayant une valeur indiscutable. Ces physiologistes nourrissaient des chiens exclusivement avec de la viande et dosaient soigneusement les rations ingérées et tous les excreta (fèces, urines, air expiré). Dans ces conditions, ils constatèrent que l’on retrouvait bien à la sortie tout l'azote qui était entré, mais qu'une partie du carbone contenu dans les albuminoïdes de la viande ne se retrouvait pas, ce qui ne pouvait s'expliquer que par une fixation de cet élément dans l'organisme sous forme de graisses.

Ces conclusiôns ont cependant été vivement combattues par PFLÜGER qui a nettement démontré que les résultats de Vorr et PETTENKOFER provenaient d’une fausse estimation de la quantité de carbone contenue dans la viande ingérée, et que cette teneur est inférieure à celle qu'ils avaient prise pour point de départ. Une fois ces chiffres rectifiés, la quantité de carbone soi-disant fixé devient infime et peut être restée dans l'organisme sous forme de glycogène. D'ailleurs, la viande, si choisie fut-elle, renferme toujours des graisses et du glycogène que organisme peut utiliser pour la formation de ses réserves adipeuses. En outre, la formation de graisses par un Chien amaigri par le jeûne, puis nourri exclusivement de viande, n'a Jamais été observée avec une intensité telle que l’on dût la rapporter avec certitude aux pro téiques ingérés.

Dans une expérience, M. KumaGawa utilisa deux jeunes Chiens de même portée qu'il amena par un jeûne de 24 jours à un état aussi semblable que possible de leurs réserves graisseuses. L'un des animaux fut alors tué et analysé en tant que témoin. Il contenait 120 grammes de graisse. L'autre fut nourri de viande de cheval maigre qu’il absorba en très grande quantité (49 kil. en 49 Jours). De 6 k. o8 l'animal passa à 10 kilos. Autopsié à ce moment il contenait 1.087 gr. 7 de graisse, ce qui par rapport à l'animal témoin représente un gain de 968 grammes de graisse. Or cette quantité très grande de graisse peut très bien avoir été empruntée directement à la graisse contenue dans la viande, car celle-ci en contenait 1.084 grammes. Il faut aussi songer que l'animal a pu mettre à profit les 356 grammes de glycogène contenus dans sa ration alimentaire. Cette expérience a le mérite de montrer que les recherches basées sur cette façon d’expérimenter ne peuvent conduire à aucun résultat certain.

La question reste donc pendante et l’on peut conclure avec E. LamBLixG « que la transformation des albumines en graisses chez les animaux supérieurs n’est pas démontrée ».

Les expériences effectuées sur les Invertébrés et spécialement sur les Insectes présentent pour nous un intérêt particulier. Les anciennes recherches de Fr. HuBer (1819), puis celles de Dumas et Mrixe-Epwarps (1843) ont montré que les Abeilles pouvaient fabriquer de la cire en étant nourries exclusivement de miel et de sucre. Dans un essaim, chaque Abeille, d’après l'estimation faite sur un lot de 217 individus pris au hasard, renfermait 06,0018 de graisses. Ces Abeilles furent nourries avec un poids de miel ayant pu apporter à chaque individu o gr. 00038 de matières grasses. Ces Abeilles séquestrées contenaient à la fin de l'expérience en moyenne 0 gr. 0042 de graisses, mais elles avaient construit un gâteau de cire contenant 11 gr. 515 de matière grasse, correspondant à une production individuelle de 0 gr. 0064. Normalement cependant, une bonne partie de la cire secrétée par les Abeilles paraît provenir des cires végétales qu’elles recueillent. La cire dite des Andaquies, produite par les Mélipones de la Nouvelle Grenade, contient de la cire de palmier, tandis que la cire de nos Abeilles ne renferme que des éléments semblables à ceux qui se trouvent dans la cire végétale de nos plantes indigènes.

Dans leurs recherches sur les larves gallicoles, Lacaze-

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Durniers et Ricne (1853) ont constaté que les larves se développant dans les noix de galle engraissent nettement, alors qu’elles ne se nourrissent que de la fécule contenue dans les cellules centrales de la galle. Il y aurait là un exemple très net de transformation des hydrates de carbone en graisses.

Des expériences déjà anciennes, dues à F. HOFManxN (29), tendent à montrer que les larves de Mouches peuvent fabriquer des graisses aux dépens des albuminoïdes alimentaires. Cet auteur plaça des œufs de Calliphora vomitoria sur du sang défibriné et coagulé, servant de milieu nutritif. L'analyse d'un lot d'œufs témoins montra que les œufs de Mouches renfermaient 4,9 p. 100 de graisse ; la nourriture (sang coagulé) en contenait 0 gr. 032 p. 100. À la fin de lexpérience, les larves renfermaient plus de graisses que la somme des graisses contenues dans l'œuf et dans le milieu nutritif. Voici les chiffres trouvés dans trois expériences.

Graisse du sang des œufs des larves 0,0106 0,001 0,2012 0,0188 0,0020 0,1896 0,0181 0,0025 0,1/460

A ces expériences, PrLüGER a objecté avec raison que la transformation des albumines du sang en graisses pouvait parfaitement avoir été opérée par les microorganismes de la putréfaction qui n’ont pas manqué de se développer.

On sait très bien, en effet, qu’au cours de la putréfaction des albumines, la production d’acides gras est la règle. C'est ainsi que CG. NeuserG et E. RosexserG (43) ont montré que, dans la putréfaction de la caséine, il y a production d’acide butyrique aux dépens de lacide glutamique, en même temps qu'apparaissent de l'acide propionique, de l'acide méthyl-éthyl-acétique, etc. C. NeuBerG et VW. Brasn (44) ont obtenu l'acide butyrique, caractérisé à l’état de sel d'argent, en partant d’acide glutamique abandonné à la putréfaction. De même ACKERMANN (1) a recueilli des acides gras, engendrés par le carbonate d’arginine putréfié. W, Brasu (7), qui reprit ces expériences, en faisant pourrir de l'acide glutamique sous l'influence de cultures bactériennes pures, constata que la production d'acide butyrique était la règle, mais qu'elle était plus intense avec les Microbes anaérobies, tels que le Bacillus putrificus Brexsrock, qu'avec les aérobies,.

EmmeriNG à de même observé la production d’acides gras, lors de la putréfaction de l'albumine d'œuf par le Staphylococcus pyogenes aureus. W serait facile de multiplier ces exemples.

Cette production d'acides gras au cours dé la putréfaction des albumines étant un fait tout à fait général, l'expérience d’'Hor- MANx, réalisée naturellement dans des conditions septiques, perd toute sa valeur, les graisses soi-disant fabriquées par les larves ayant pu prendre naissance sous l'influence du chimisme microbien. Cette expérience, comme d’ailleurs la plupart des anciennes recherches de cette catégorie, se trouve en outre viciée dans ses résultats par suite du procédé de dosage des graisses qui était alors employé. L’extraction des graisses par l’éther, dans l’appareil de Soxhlet, donne des chiffres très inférieurs à ceux que permet d'obtenir la méthode moderne, mise au point par Kumagawa et Suro. Ainsi, tandis qu'EGENLHaRDT attribuait au sang une teneur en graisse de o gr. 18 p. 100, BünniNGer en utilisant le procédé bien supérieur de lextraction par l'alcool, a constaté que cette teneur était de 1,4 p. 100.

Une autre expérience plus récente, due à O. FRaANGK (23), n’est guère plus démonstrative. Cet auteur dégraissa de la viande au maximum par une extraction de 14 jours dans l’éther. Sur cette viande il plaça 2 gr. 1370 de larves de Mouches, qui, d’après lestimation faite sur un lot témoin, devaient renfermer 12,64 p- 100 de graisses, la viande en renfermant 0 gr. 0933. Au bout de 7 jours, les larves atteignirent le poids de 6 gr. 6742 et avaient formé de toutes pièces o gr. 1 de graisse. Cependant FRaNCk lui-même n’ose affirmer que cette graisse ait été réellement produite par les larves; il pense plutôt que la différence observée doit être attribuée soit à une teneur, plus élevée que celle admise, de la viande en graisses, soit à une transformation des albumines en acides gras par les microbes de la putréfaction. Cette incertitude dans linterprétation ne fait que souligner la nécessité d'utiliser des élevages aseptiques si l’on veut résoudre définitivement la question.

Il me reste à parler maintenant d’une série de très intéressantes expériences effectuées par E. WaæinranD (67) sur des larves de Calliphora vomiloria, mais qui, pas plus que les précédentes, ne sont à Pabri des critiques tenant aux conditions septiques de

l'expérience.

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Cet auteur a nettement établi que les larves septiques emmagasinaient de la graisse aux dépens des substances albuminoïdes. Les jeunes larves contiennent souvent 3 p. 100 de graisses (extraites par l’éther de pétrole), c’est-à-dire une teneur inférieure à celle des œufs qui est de 4,6 p. 100. Progressivement la graisse s’accumule dans leur corps adipeux, jusqu’à un taux maximum (8 p. 100) qui n’est pas dépassé. A ce moment les larves cessent de manger et ne tardent pas à se transformer en pupes.

Cette production de graisse peut être observée non seulement sur les larves vivantes, mais aussi dans la bouillie provenant de larves broyées. La production de graisses s'accompagne d’un dégagement souvent intense d’ammoniaque, si bien que le processus de transformation paraît résider à la fois dans une désamidation et dans une séparation du groupe carboxyle.

Cette transformation se fait aussi bien et même mieux en l'absence d'oxygène qu’en présence de l'air libre. La présence de peptone la favorise. De plus, de même que cela a été observé par l'auteur pour d’autres processus réalisés dans la bouillie larvaire (production de sucre), la quantité de graisse engendrée dépendrait de la teneur primitive de la bouillie en cette substance, sans jamais dépasser un taux maximum.

Pour E. WeixLcanp, les Microbes n’interviendraient nullement dans ces transformations. On peut cependant, à ce point de vue, conserver une attitude sceptique. Le fait que la transformation est plus intense en milieu anaérobie, celui qu'elle se produit aussi bien dans la bouillie larvaire que dans la larve intacte incitent fortement à penser que les Bactéries sont intervenues au moins pour une part dans ce processus. Ici encore la question demeure donc en suspens.

L’exposé de cet ensemble de recherches montre nettement combien lPobtention d’élevages de Drosophiles aseptiques constitue une condition exceptionnellement favorable pour tenter de résoudre le problème posé. Il s'agit, en effet, d’ organismes accumulant normalement des quantités énormes de graisse, en très peu de temps, placés à l'abri de tous Microbes pouvant fausser les résultats et que, de plus, on se propose de nourrir avec des aliments arüficiels susceptibles de variations connues.

Avant d exposer la partie de mes recherches relatives à cette question — lorigine possible des graisses du corps adipeux — il

est nécessaire de rapporter certaines expériences relatives à des déterminations préliminaires, concernant la nature des sels minéraux indispensables, celle de la réaction du milieu rutritif et le taux le plus efficace de la peptone choisie comme aliment albuminoïde fondamental.

1° Influence des sels minéraux. — Les substances que j'ai utilisées pour les essais de constitution de milieux artificiels ne présentaient qu'un degré de pureté relatif, pureté que je ne recherchais pas d’ailleurs, du moins au début de mes expériences, puisqu'il s'agissait surtout de dégrossir la question, quitte à introduire plus de précision dans la suite au fur et à mesure que cela paraîtrait nécessaire. Les substances telles que la peptone, la lécithine renferment vraisemblablement certaines impuretés minérales dont je n’ai pas tenu compte volontairement.

Les éléments minéraux que j'ai introduits dans mes milieux nutritifs ont tous été choisis, en me basant sur lanalyse des cendres de Levure.Ces cendres renferment d’après BELonoUBEK :

Acide PROSPLORIQUE PE MEN TON ES 51,1 p 100 SU EU D] QUE ANR ER EE Sac 00H) RS LLC U CAN A EE At Pt ee 1300 0)