LE GLYCOGÈNE ET SES VARIATIONS

TECHNIQUES. — C'est de la méthode chimique presque exclusivement que nous nous sommes servi pour la recherche du glycogène et l’étude de ses variations. Nous avons cependant coloré directement ee corps par l'iodo-iodure de potassium dans le manteau, l’hépatopancréas et dans différents muscles de la moule. Il suffit de faire un frottis dans le cas de l’hépato-pancréas, qui est un organe mou, de dissocier dans le cas du muscle, et de monter directement dans la solution iodée. On peut constater alors au microscope que le glycogène se présente sous forme de granulations plus ou moins volumineuses dont les plus petites sont à la limite de la visibilité. Ces oranulations sont d'ailleurs beaucoup plus nombreuses dans l’hépato-pancréas que dans les muscles.

Quant à nos dosages, ils ont été effectués suivant deux techniques : 1° méthode Bierry-Gruzewska; 2° méthode Fraenkel-Garnier. La méthode de Brücke aurait été sans contredit la plus précise, mais outre qu’elle est très délicate

RER à manier, elle exige une série d’opérations fort longues. La précision fournie par les deux méthodes auxquelles nous nous sommes arrêté nous a paru bien suffisante, d’autant plus que seules les variations un peu considérables du olycogène sont intéressantes pour nous qui avons voulu faire œuvre pratique.

Méraope BIERRY- GRUZEWSKA. — Son principe est le suivant : détruire dans les tissus, tout en respectant le elycogène, les matières réductrices et celles susceptibles de le devenir après hydrolyse acide, hydrolyser le glycogène par un acide minéral qui le transformera en glucose, enfin conclure de la quantité de glucose trouvée à la quantité de glycogène. La destruction des matières réductrices ou susceptibles de le devenir, est réalisée par le chauffage à 120 degrés des tissus broyés. en présence de potasse à 35-50 pour 100. « Le traitement par la potasse, écrivent Bierry et M'® Gruzewska", répond à un double but : solubiliser parfaitement les tissus employés, puis détruire, tout en respectant le glycogène, les matières réductrices ou celles susceptibles de le devenir après hydrolyse acide. On se débarrasse ainsi des dextrines, du glucose, du maltose, des jécorines, des composés glycuroniques. Le sucre combiné susceptible d’être apporté par le sang est également détruit dans ces conditions. » Nous nous sommes assurés pournotre part que la mucine de la moule, corps susceptible de donner naissance par hydrolyse à de la glucosamine

‘ Nouvelle méthode de dosage du glycogène dans le foie {C, R. Ac, Sc, du 23 décembre 1912).

réductrice, et par conséquent d’être dosé comme glycogène, était détruite par le traitement potassique.

« On peut objecter, écrivent plus loin Bierry et Gruzewska, qu'on obtient non seulement les corps réducteurs qui proviennent de l’hydrolyse du glycogène, mais aussi de l’hydrolyse des matières albuminoïdes et, en particulier, des nucléoprotéides. Les travaux de Wolgemuth et de Neuberg ont en effet montré que les protéides hépatiques étaient susceptibles de donner du l.-xylose. Dans des expériences faites avec des nucléo-protéides extraits du foie de chien, nous avons trouvé des chiffres voisins de ceux indiqués par ces deux auteurs, mais dans les conditions où nous opérons, les nucléo-protéides se détruisent en partie, et la quantité de 1.-xylose cerrespondant à 25 grammes de foie, quantité bien suffisante pour un dosage, est inférieure à O er. 006, chiffre qui ne peut pas apporter de changement sensible au dosage. Dans d’autres expériences, nous avons débarrassé le foie de son glycogène #7 vitro, et nous l’avons soumis à l’hydrolyse. Ici encore, l’étude des produits de l’hydrolyse complétée par l'étude des combinaisons hydraziniques nous a montré que ces substances n’apportent pas de perturbation au procédé de dosage que nous proposons. »

Ceci posé, les différents temps de l'opération sont les suivants : a) le tissu où l’on veut doser le glycogène est pesé, broyé, solubilisé dans la potasse, puis porté à l’autoclave à 120 degrés; b) après refroidissement, la liqueur potassique est neutralisée, puis additionnée d’un acide minéral, et portée une deuxième fois à l’autoclave à 120 degrés; c) on neutralisé de nouveau la liqueur, puis

on y précipite les protéiques en vue du dosage du glucose (défécation); d) on procède au dosage du glucose qui s’est formé par action de l'acide.

Voici maintenant des détails sur la façon dont nous avons appliqué cette méthode à la moule et les différentes manipulations nécessaires.

1° Préparation de la moule. — Le mollusque doit toujours être ouvert par la face ventrale de façon à ne léser aucun organe. On se sert pour cela d’un couteau à huîtres. S'il s’agit d'effectuer un dosage sur la pulpe de moule entière, on la détache alors en introduisant, au-dessous du manteau, un scalpel qui sectionnera la surface d'insertion du manteau et celles des différents muscles. S'il ne s’agit que de détacher un organe, on s’adressera au scalpel et aux CISEAUX.

2° Pesée. — Tels qu'on les retire de la coquille, la pulpe ou les organes de la moule ne peuvent être pesés directement. Ils sont encore imprégnés en effet d’une quantité d’eau de mer relativement considérable qui introduirait une cause d'erreurs. Le meilleur moyen pour s’en débarrasser consiste à disposer au-dessus d’un entonnoir un grillage quelconque et à y étaler les moules : il ne s’écoule plus aucun liquide au bout de quelques minutes ; on peut alors effectuer la pesée et inscrire le poids que l’on veut employer au dosage : 25 grammes suffisent largement. Pour plus de précautions, l’animal peut être plongé dans l’eau bouillante de façon à tuer la glycogénase qui, au cours du broyage, pourrait transformer en sucre une petite quantité de glycogène.

3 Broyage. — Les tissus sont broyés dans un mortier

avec la plus petite quantité possible de sable de grès de Fontainebleau bien pur (15 grammes environ pour 25 grammes de moule). Le tout est ensuite introduit dans un matras. Le mortier et le pilon qui ont servi au broyage sont soigneusement nettoyés avec la solution potassique à 39-90 pour 100 qui est alors versée dans le matras. Nous prenions autant de centimètres cubes de cette solution que nous employions de grammes de tissu : ainsi pour 25 grammes de tissu nous prenions 25 centimètres cubes de solution potassique. À l’ensemble pulpe broyée + solution potassique nous avons toujours ajouté le liquide riche en glycogène qui s’écoule des tissus après ébouillantage.

4 Traitement par la potasse. — Il comprend deux temps : a@) Solubilisation des tissus; d) Chauffage à 120 degrés. La solubilisation s’effectue très facilement en chauffant le matras au baim-marie bowullant. Vingt à trente minutes de chauffage suffisent si le broyage a été bien fait. Quant au chauffage à 120 degrés, qui doit durer trente minutes également, il se fait dans une autoclave et demande les précautions usuelles en pareil cas.

5° Neutralisation. — Après refroidissement, la liqueur potassique contenue dans le matras est versée dans un verre à pied et doit être neutralisée par un acide minéral. C’est à l'acide chlorhydrique que nous nous sommes adressés. La neutralisation effectuée, on verse sur un filtre gris lé contenu du verre. Matras et verre sont soigneusement lavés avec de l’eau, et l’on verse les eaux de lavage successives sur le filtre. Le filtre est finalement pressé avec son contenu au moyen d’une petite presse de Claude Bernard ; le liquide résultant, filtré, est réuni au liquide

= Gà.— égoutté du premier filtre, qui, complété si besom en est à 100 centimètres cubes, se trouve ainsi prêt pour l’hydrolyse.

6° Hydrolyse. — T] suffit d'ajouter 5 centimètres cubes d'acide chlorhydrique au liquide en question et de porter le tout une deuxième fois à l’autoclave à 120 degrés pendant trente minutes environ, dans un matras.

T° Noeutralisation. — Après refroidissement, la liqueur acide est versée, ainsi que l’eau qui a servi au lavage du matras (60 centimètres cubes environ) dans un verre à pied. On neutralise avec une solution de soude et l’on filtre si besoin en est. C'est ce liquide filtré qu’il faut maintenant déféquer.

8° Défécation. — Nous nous sommes toujours adressé pour la défécation de nos liqueurs au réactif de Patein, qui est actuellement regardé comme le meilleur des déféquants. Le nitrate mercurique (réactif de Patein) se prépare de la façon suivante : on additionne 220 grammes d’oxyde jaune de mercure fraichement préparé de 300 centimètres cubes d’eau uistillée, et l’on verse, en agitant, de l’acide azotique pur en quantité exactement suffisante pour dissoudre tout l’oxyde. On ajoute ensuite quelques gouttes d’une solution de soude jusqu’à apparition d’un léger précipité, et l’on complète à un litre avec de Peau distillée ; puis l’on filtre. Le réactif amsi préparé ne renferme pas d'acide azotique libre, et la quantité de sels mercureuxqu'il renferme est négligeable. |

On verse dans le liquide à déféquer, avec précaution et goutte à goutte, le nitrate mercurique ainsi préparé jusqu’à ce que la précipitation des albuminoïdes soit complète,

pui puis on décante par filtration. Le filtre est lavé pour plus de sûreté avec un peu d’eau distillée.

Pour éliminer l’excès du déféquant, on verse goutte à goutte dans le liquide séparé du précipité, en agitant vivement, de la soude à 10 pour 100, en ayant soin de s’arrêter toutes les cinq ou six gouttes pour laisser le précipité se déposer. On cesse l’addition sodique lorsqu'une goutte de liquide éclairci ne rougit plus du tout le papier bleu de tournesol, mais il ne faut pas alcaliniser'. » Le liquido filtré est alors complété, si besoin en est, à 300 centimètres cubes et additionné de 12 grammes de zinc pulvérulent. On laisse au contact un minimum de trois heures, mais un contact plus longuement prolongé (toute la nuit, par exemple) n’est pas nuisible. Au bout de ce temps, il ne reste plus qu’à filtrer, et le liquide obtenu est prêt pour le dosage du sucre. On en prendra 20 centimètres cubes et l’on rapportera au liquide total et à 25 grammes de pulpe.

99 Dosage du sucre. — Nous avons employé la méthode très précise de Mohr-Bertrand, que l’on trouve ainsi décrite dans le traité de chimie biologique de Bertrand et Thomas *.

On commence pour préparer les quatre liqueurs suivantes :

Liqueur cuivrique.

Sulfale de cuivre pur . 4o gr.

Eau distillée Te S=pelitre.

Liqueur sodique.

Sel de Seignette. . . . 200 gr.

Soude caustique. 150 — Eau distillée Geis AD litre:

Liqueur ferrique.

Sulfate ferrique . 50 gr.

Acide sulfurique 200 — Eau distillée ges pnlitte:

Liqueur permanganique.

Permanganate de potasse.

Eau distillée

5 gr.

g..s. p.1 litre.

1 Mlle Bellion, Contribution à l'étude de l’hibernation(thèse de Lyon, 1909). ? Guide pour les manipulations de chimie biologique.

La liqueur ferrique ne doit pas réduire le permanganate. On s’en assure en y ajoutant avec précaution de la liqueur oxydante. Un faible changement de coloration doit apparaitre déjà après quelques gouttes. Sinon, on verserait du permanganate jusqu'à ce que ce résultat soit atteint. La liqueur ferrique serait alors prête pour l’usage.

Ceci posé, quand on veut doser la quantité de sucre contenue dans une solution, on prend une fiole conique de 125 à 450 mètres cubes de capacité, et l’on y verse 20 cen— timètres cubes de la liqueur sucrée, Ces 20 centimètres cubes peuvent contenir jusqu’à 100 milligrammes de sucre réducteur, mais 1l est préférable qu’ils en renferment un peu moins. C’est entre 70 et 90 milligrammes que les résultats sont les plus précis.

On ajoute à la solution sucrée 20 centimètres cubes de liqueur, 20 centimètres cubes de liqueur sodique et l’on chauffe jusqu’à l’ébullition qu’on maintient exactement trois minutes. On évite une ébullition trop vive qui concentrerait trop le liquide,

Après les trois minutes d’ébullition, on retire la fiole du feu, on laisse déposer un instant l’oxydule rouge de cuivre, et on passe le liquide surnageant à travers un filtre d'amiante. La couleur de ce liquide doit indiquer nettement la présence d’un excès de cuivre. S’il en était autrement, c'est que la quantité de sucre contenue dans les 20 centimètres cubes serait trop grande, et il faudrait recommencer le dosage en diluant la liqueur sucrée.

I est recommandé d’entrainer le moins possible l’oxydule de cuivre sur le filtre. Il y formerait un dépôt compact qui ne se dissoudrait plus avec toute la rapidité

désirable dans la liqueur ferrique que l’on emploie ensuite. Lorsque la liqueur surnageant le précipité d’oxydule de cuivre à été séparée, on délaie le précipité dans un peu d'eau; on laisse déposer encore une fois et on décante le liquide de lavage sur le filtre. La fiole à filtration est alors vidée et rincée ; elle est prête à servir à la deuxième partie de l’opération, c’est-à-dire au dosage du cuivre réduit.

Ce dosage s'effectue comme suit : on dissout l’oxydule de cuivre dans la liqueur ferrique ajoutée peu à peu en remuant, en quantités suffisantes : 5, 10, 20 centimètres cubes. Le précipité passe instantanément du rouge vif au bleu noir, puis donne une solution limpide d’un beau vert d’eau. On verse cette solution sur le filtre pour dissoudre au passage la petite quantité d’oxydule qui y est retenue. Si celle-ci tarde trop à disparaitre, on délaie un peu avec un “agitateur la couche superficielle du filtre, pour augmenter les points de contact avec la liqueur ferrique, et on modère la vitesse de filration en cessant de faire le vide. Fil est nécessaire, on ajoute encore quelques centimètres cubes de liqueur ferrique. Enfin quand tout l’oxydule est dissous, on lave la fiole à filtration et le filtre avec de l’eau distillée, puis on titre le liquide rassemblé dans la fiole à filtration avec du permanganate, Il faut opérer au voisinage de l’ébullition. Le virage est extrêmement net et se distingue aussi bien à la lumière artificielle qu’en plein jour ; la couleur passe du vert au rose avec une seule goutte de permanganate en excès. Souvent une partie notable de la dernière goutte oxydante est utilisée pour terminer la . transformation du sel ferreux en sel ferrique, et 1l ne reste plus que juste assez de permanganate pour compenser la

Re EE tente verte du liquide. Celui-ci semble alors se décolorer brusquement; si on ajoute une goutte de plus, on obtient une coloration rose intense.

Pour le titrage du permanganate on utilise de préférence l’oxalate d’ammonium. C’est an sel qui n’est ni efflorescent ni hygroscopique. On en pèse 250 milligrammes (ou une quantité voisine) qu’on met dans une capsule de porcelaine avec 50 à 100 centimètres cubes d’eau et 1 à 2 centimètres cubes d’acide sulfurique pur. On chauffe vers 60 à 80 degrés, et l’on verse la solution de permanganate jusqu’à coloration rose (environ 22 centimètres cubes). En multipliant le poids d’oxalate employé par 0,8951, on a la quantité de cuivre qui correspond au volume de solution de permanganate employée et on en déduit la quantité de cuivre qui correspond à 1 centimètre cube de cette même solution. Connaissant la quantité de cuivre qui correspond aux X centimètres cubes de permanganate employé, 1l suffit de se reporter à des tables établies par MM. Bertrand et Thomas pour trouver la quantité de sucre contenue dans 20 centimètres cubes.

100 Passage du sucre au glycogène. — Si p est le poids de sucre correspondant à un kilogramme de tissu de moules, le poids x de glycogène est égal à p><0,927.

Méraone FR4NKEL-GARNIER. — La méthode de Frænkel, modifiée par Garnier, exige une série d'opérations beaucoup moins longue que la précédente et elle est suffisamment précise néanmoins. C’est à cette dernière méthode que nous avons eu recours pour la plus grande partie de nos dosages, après avoir vérifié que les résultats obtenus

étaient à très peu de chose près les mêmes que ceux obtenus par la méthode Bierry-Gruzewska.

Ce sont les propriétés de lacide trichloracétique, qui est à la fois solvant du glycogène et précipitant des albuminoïdes qui se trouve à la base de la méthode Frænkel. Il suffit en principe de mettre en contact intime avec l'acide en question les tissus où l’on veut doser le glycogène, puis de filtrer pour avoir un liquide ne renfermant que du glycogène et plus du tout de matières albuminoïdes. On précipite le glycogène de sa solution par l’alcool, et on purifie. Le détail des opérations, légèrement modifié par nous, est le sulvant :

Préparation, ébouillantage et pesée des tissus comme précédemment. 20 à 25 grammes sont suffisants pour un dosage.

On broie à froid dans un mortier avec la plus petite quantité possible de sable de grès de Fontainebleau humecté par une solution d'acide trichloracétique à 4 0/0. Petit à petit l’on ajoute 40 à 50 centimètres cubes de la même solution, en même temps que l’on achève de broyer. Le broyage terminé, on laisse macérer pendant une heure au plus, tout en prenant la précaution de remuer de temps à autre. On filtre.

Le mortier et le pilon sont soigneusement lavés avec une vingtaine de centimètres cubes d’une seconde solution d'acide trichloracétique à 2 pour 100. La moitié environ, soit 10 centimètres cubes, est versée sur le filtre et contribue à l’épuisement parfait du tissu en glycogène; l’autre moitié sert, lorsque plus rien ne s’égoutte du filtre, pour une deuxième macération de ce filtre et de son contenu qu’il

= est inutile de prolonger au delà d’une demi-heure. Finalement on décante cette deuxième macération, on presse le résidu à la presse de Claude Bernard et filtre le liquide exprimé. Les différents filtrats sont enfin réunis et le glycogène y est précipité par deux volumes d'alcool à 95 degrés.

Un petit filtre, desséché pendant une heure à 70 degrés, a été préparé d’avance et son poids p noté. Lorsque la précipitation du glycogène est terminée, on l’y recueille, lave ce glycogène avec de l'alcool à 60 degrés, jusqu’à disparition complète d’acidité, puis avec de l’éther pour le purifier. Après un nouveau séjour d’une heure à Pétuve à 70 degrés le filtre est pesé de nouveau. Si P est son poids à ce moment, P-p est le poids du glycogène contenu dans le poids de tissu employé pour le dosage. On rapporte à 1 kilogramme de tissu. e

Le produit extrait de Mytilus yalloprovincialis de la Méditerranée, par la méthode Frænkel-Garnier, présente toutes les réactions du glycogène : opalescence des solutions, coloration rouge-brun avec l’iodo-iodure disparaissant sous l'influence de la chaleur et reparaissant par refroidissement, transformation facile en glucose par action des solutions d'acides minéraux à chaud. Il ne s’agit done pas d’un corps voisin du glycogène, mais de glycogène

bien typique.

VARIATIONS DU GLYCOGÈNE Avec le sexe. — Les moules ne sont pas hermaphro-

dites, comme nous l’avons vu au précédent chapitre, et, sans avoir besoin de recourir au microscope, on reconnait

. = 69 2, facilement à la couleur de leur glandé génitale les mâles et les femelles. Le manteau des moules mâles est rouge 6ù brique, celui des femelles est blane ou blane légèrement jaunâtre.

Nous avons dosé respectivement le glycogène sur des moules des deux sexes, à trois époques dé l’année diftérentes : en hiver (saison qui correspond, comme nous le verrons plus loin, au minimum dé la charge glycogénique), au printemps (saison de transition) et eñ été (saison qui correspond au maximum de la charge glycogéniqué). Ces moules ont toujours été recueillies au môrne endroit, soit à la partie moyenne d’une corde du pare de thalassiculture afin d'éviter l'influence possible des facteurs autres que le sexe, et voici les chiffres obtenus :

TENEURS EN GLYCOGÈNE

I — , re Moules Moules Différence en faveur DATES RCE ® des moules © gr. 0/00 gr. 0/00 gr. 0/00 Décembre 1913 . . . 12,000 34,807 + 22,857 MAO RE Len. 41,800 55,560 + 13,760 MÉNENNTE RERE 69,080 79,280 + 10,200

Un coup d'œil jeté sur ce tableau permet immédiatément de conclure que les moules femellés sont, à toute époque de l’année, plus riches en glycogène que les moules mäles. La différence devient pourtant de moins en moins importante à mésure que la charge glycogénique générale de l’animal augmente. De 23 pour 1000 environ én hiver, elle passe en effet à 10 pour 1000 seulement en été, soit plus dé moitié moins.

Un dosagé de glycogène effectué le 5 août 4914 sur des

== 70 —— ° manteaux détachés de moules mâles et de moules femelles nous à donné enfin :

Manteau Re CE EC RCE 99 gr. 000 0/00 — DÉS RTS NEC AT R ARTIO TR GORE

Ceci fait une différence de 13 gr. 600 pour 1000 en faveur des manteaux femelles. Cette différence n’est pas énorme et prouve, puisque les organes génitaux de la moule sont localisés presque exclusivement dans le manteau de l’animal, que, d’autre part, les produits sexuels arrivent précisément à maturité vers le mois d'août, que les produits sexuels mâles sont à quelque chose près aussi riches en glycogène que les produits femelles. Comme nous le verrons plus lom, le manteau est d’ailleurs Porgane de la moule qui, en toute saison, est le plus riche en glycogène. Il y a done une relation directe entre la teneur en glycogène de la moule et l’abondance des produits sexuels.

Disons enfin que dans l'étude de l’influence sur la charge glycogénique de tous les autres facteurs biologiques, nous avons pris soin de toujours éliminer, en prenant poids égal de moules mâles et de moules femelles, l’influence de la sexualité. C’est une chose dite une fois pour toutes, une règle à laquelle nous nous sommes réculièrement conformé, et nous n'y reviendrons pas.

Avec l’âge. — Nous avons dosé le glycogène, à la même époque de l’année, sur des moules ayant toujours vécu au même endroit du pare de thalassiculture du professeur R. Dubois dans les mêmes conditions biologiques, et res pectivement agées de 6, 10, 15, 20 mois et 3 ans. Ces

æ dosages ont été faits fin Juillet, au voisinage du maximum de la charge glycogénique, et voici nos résultats :

AGES DES MOULES TENEURS EN GLYCOGÈNE DA RON MA US des LE 62 gr. 750 0/00 ROSE Re A GR ne Wide mens 85 gr. 050 — Re EE CR PT Re ET 100 gr. 550 — 20 — RU M ete Po 88 gr. 400 — RU CR D IT de Rte ren 82 gr. 200 —

Comme on le voit, le maximum dela teneur en glycogène est donc atteint, pour une même époque de l’année, par les moules de 15 à 20 mois. Au-delà de cet âge la teneur diminue lentement. Elle s’accroit au contraire, et plus vite, de 6 à 15 mois. Entre les moules de 6 mois et celles de 15 (minimum et maximum) la différence atteint 38 grammes 0/00 environ.

Sans préjudice des conclusions d’ordre pratique que nous tirerons de ces faits associés à d’autres, disons immédiatement que, comme l'influence de la sexualité, l'influence de l’âge devra être éliminée dans l’étude de l'influence d’un autre facteur, quel qu'il soit, sur la charge glycogénique. On y arrivera facilement en opérant toujours sur des moules de même âge.

Avec la saison.— On désigne sous le nom de saison un ensemble complexe de facteurs météorologiques dont le plus important est sans contredit la température. Nous donnons un tableau des variations de la température de l’eau de mer au parc de thalassiculture — lieu où nous avons fait nos prélèvements de moules, pour le courant de Pannée 1914. Nous avons toujours fait deux mesures : l’une en surface, l’autre par 4 mètres environ de profondeur (fond du pare).