II. Les fibres élastiques

1° TecaNIQUuE

Nous avons à l’heure actuelle plusieurs procédés de mise en évidence des fibres élastiques sur des coupes. Les uns sont vieillis comme la méthode à la potasse. Les autres tout à fait excellents ont rendu de grands services pour la démonstration de la substance élastique dans les tumeurs, pour la recherché des fibres élastiques au niveau des lésions syphilitiques ou tuberculeuses, dans les foyers scléreux, etc. Ces méthodes ont pu donner d'excellents résultats. Comme elles ne sont pas toutes également répandues en France nous allons exposer celles dont nous nous sommes servi.

A. Méthode à la potasse. — Elle utilisait la résistance spéciale des fibres élastiques à la potasse concentrée. Elle a servi à faire toutes les premières recherches sur le poumon emphysémateux (Ernivcer, Kzassi, etc.). Elle est loin de mettre en évidence toutes les fibres et manque complètement de précision. On ne l'utilise plus aujourd'hui.

B. Méthodes à l'orcéine. — L'orcéine est le colorant des fibres élastiques le plus utilisé en France. On lappelle généralement méthode d'Unxa-Tzxnzer (2) ; Uxna l’a modifiée à l’infini pour tous les besoins des recherches anatomiques, Récemment

1. O0. Josué, Les corps dits amylacés du poumon. Pr. méd., 1897, 6. p.21.

2. Uxna. Ueber Elastin und Elacin, Monatschrift für prakt. Dermalol., &. XIX. — Tzænzer. Farbung der elastischen Fasern. Monatshefte f. prakt. Dermatologie, t. XI.

Leruzze et Normann (1) ont indiqué leurs procédés spéciaux de colorations combinées à l'orcéine.

a) Le matériel est fixé dans Le formol ou le sublimé (liquide de Dominici par exemple). Pas de fixateurs osmiques. |

b) On colore à froid pendant une nuit dans la solution suivante :

Orcéine. . . LIMATR EE { gr. ou mieux 0 gr. 75 cter. Acide One AMC NS EME 1 cent. cube.

Alcool à 96° 0 er 55 - 100 cent: Fübes!

On dissout l’orcéine dans l’alcool et l’on n’ajoute l'acide chlorhydrique qu'après dissolution complète.

On peut, sans aucun inconvénient remplacer l’alcool à 96° par de l'alcool à 90° et l’acide chlorhydrique par de l'acide nitrique.

c) Lavage à l’eau, lavage à l'alcool. Laisser aussi longtemps qu'on voudra dans l’un et dans l’autre.

d) Différenciation dans l'alcool chlorhydrique d’après He

Acide chlorhydrique + . . . . 0eme".

AICOGT a JO Re Es LOU ES Haut SUlée MEN AE NT AE Se" 20 "CME.

La différenciation doit être surveillée sous le microscope et s'arrêter lorsque les fibres élastiques se détachent en brun noir sur fond incolore. Laver alors à l’eau et monter au baum.

On emploie souvent, par dessus cette coloration des fibres élastiques, des coloralions combinées au liquide de Van Gieson et à l’hématéine, ete. Nous estimons que dans ces cas le trajet des fibres élastiques en arrive à manquer de nettelé, sauf cependant pour le procédé indiqué dans l'excellent traité de technique de SCHMORL (2).

a) Coloration préalable au carmin lithiné (nous employons le

4. M. Leruice et E. Norman». Coloration différentielle des fibres élastiques par une méthode de Vercéiné modifiée, Soc. Anal., 1907,

pi470.;:1:- 2. G. Scumorr. (de Dresde). Die pathologisch histologischen Untersu-

chungsmethoden, 1907, p. 136. Cette méthode est due à E. FraNkeL (de Hambourg) (communication écrite).

carmin boracique à l'alcool, en colorant au moins 24 heures et en plongeant dans l'alcool chlorhydrique juste le temps d'effectuer le virage).

b) Coloration à l’orcéine nitrique :

Orcéine D (de Grübler) . . : . 4 gr. 5.

AlcookAt06 in EM Car As Ta0Cémne; du distillée Ru etes sem GONE Acidenitrique ut (fie- eh Pen (ESS

Cette solution servant de solution mère, on en verse dans une solution d'acide nitrique à 3 0/0 ce qui est nécessaire pour obteair une teinte brun noir. Laisser les coupes 24 heures.

c) Différencier dans l'alcool à 802.

d) Colorer pendant 10 à 15 minutes dans :

Acide picrique en solution aqueuse concentrée . . 200 Carmins ditdiens 2 M LR RCE NÉE ee 0,5

e) Laver rapidement dans :

Eau distillée. . . A RAR SR RON Acide acétique nstellisable ANT ET dun 3,9

/) Laver dans l’alcool à 96°, monter au baume.

Les noyaux sont rouges (rose pâle, mais avec de bons détails nucléaires), les fibres élastiques noires, le tissu conjonctif vert (bleu pâle si l’on a bien lavé à l’eau), les muscles et le sang jaunes.

La méthode à l'orcéine donne d'excellentes colorations ; néanmoins pour la finesse et la sécurité des résultats, nous lui préférons la méthode de Wricerr.

C. Méthode de Weigert. — Parmi les nombreuses méthodes inventées par ce remarquable technicien, la méthode de coloration des fibres élastiques est l’une des plus remarquables, eu nous a-t-il semblé, la plus facile à appliquer. Elle s'accommode de n'importe quelle fixation, elle est facile, n’a pas besoin d’être

surveillée de très près. Seule la préparation du colorant présente quelques difficultés (1).

Nous disons que la fixation est ad libitum. Nous croyons néanmoins que pour avoir des résultats absolument certains il est bon d'utiliser du matériel fixé au sublimé (liquide de Dominici ou sublimé acétique). Fiscer (2) a fait remarquer en effet que les pièces fixées au formol, au liquide de Mülier, aux fixateurs osmiques laissaient colorer d’autres éléments que les fibres élastiques.

Pour les pièces de poumon il est impossible de couper à la congélation, en raison du manque de fixité et de continuité des éléments.

On doit rejeter l'inclusion à la celloïdine, car pour avoir une bonne différenciation il faut un séjour prolongé dans l'alcool absolu que ne supporteraient pas des coupes enrobées à la celloïdine sans que celle-ci vienne à se dissoudre.

L'inclusion de choix est la paraffine que nous faisons d'après la méthode indiquée au début de ce chapitre.

Mode de préparation de la solution de Weigert

On commence par faire une solution de résorcine à 2 0/0; on peut remplacer la résorcine par l'acide phénique neigeux. Dans cette solution on verse lentement 1 0/0 de fuchsine basique cristallisée, préalablement réduite à l’état de poudre très fine dans un mortier ; on peut remplacer la fuschine par le rouge Magenta.

On prend 200 centimètres cubes de la solution, qu’on porte à l'ébullition dans une capsule de porcelaine. Il faut que la capsule de porcelaine ait une contenance bien supérieure à 200 cen-

1. WeicerT. Färbung der elastischen Fasern. Zentralbl f. path.anat., t. IX.

2. Frscaër. Ueber chemismus und Technik der Weigert'schen Elastinfärbung. Virchow's Archiv., t. ULXX. Du MÊME. Weïteres zur Technik der Elastinfärbung. /bid., t. CLXXIT.

Ameuille 3

timètres cubes. On y ajoute, au bout de 2 ou 3 minutes d’ébullition 50 centimètres cubes de perchlorure de fer officinal (4), et on laisse bouillir 5 À 6 minutes en agitant sans cesse. [l se forme un précipité ; de ce précipité il ne faut rien perdre car c'est la partie utile. Laisser refroidir et filtrer sur un filtré sans plis et mouiilé.

Laisser égouter et sécher filtre et précipité, pendant tout le temps nécessaire. Laisser égouter et sécher également la capsule qui a servi (sans la laver), car elle contient encore une partie du précipité et doit reservir.

Quand le tout est à peu près see (au bout de 24 ou 36 heures) remettre le filtre dans la capsule, avec son précipité, verser dessus 200 centimètres cubes d’aleool à 96° et chauffer jusqu’à ébullition sur une flamme bien enveloppée de toile métallique pour éviter l'inflammation des vapeurs. Quand l’ébullition a commencé, déplier le filtre avec soin, le débarrasser peu à peu du précipité qui y adhère et lorsqu'il en est complètement débarrassé le retirer avec une pince, le laisser égoutter au-dessus de la capsule puis le jeter (2). On laisse encore bouillir quelques

1. Le mémoire de Weigert indique, pour 200 de solution de fuchsinerésorcine, 25 parties de Liquor ferri sesquichlorati de la PRARMaAcoPŒA GErManica. En nous reportant à ce dernier recueil (1872, p. 212), nous trouvons: « Liquor ferri sesquichlorati : iquor limpidus, coloris e croceo « fusci, etc., ponderis specifici 1,480 ad 1,484, contineat ferri partes « quindecim, vel ferri sesquichlorati ab aqua liberi partes quadraginta «tres et dimidiam (43,5) in centum partibus, ete. ». Or le perchlorure de fer officinal a pour densité 1,26 et contient 26 0,0 de perchlorure de fer anhydre. C'est pour cette raison que dans notre formule nous indiquons 30 centimètres cubes de perchlorure français au lieu de 25 centimètres cubes de /quor ferri sesquichlorati. On compensera la différence de concentration en laissant bouillir un peu plus longtemps.

2. Pendant toute la durée de cette manœuvre il faut prendre de grandes précautions pour éviter que ne s’enflamment les vapeurs d’alcool. C'est pour cette raison qu'il faut prendre une grande capsule, et se servir d'une flamme enveloppée de toile métallique. Si malgré toutes ces précautions l'alcool prenait feu il faudrait retirer le bec Bunsen, recouvrir immédiatement la capsule d’une autre capsule de même dimen-

minutes, jusqu'à dissolution complète (1), puis on laisse refroidir et l’on filtre. Pour compenser la perte d'alcool par lévaporation, on complète à 200 centimètres cubes avec de l'alcgol à 960 et la solution est prête à servir. Elle ne peut du reste servir que pendant six semaines, car au bout de ce temps elle colore non seulement les fibres élastiques, mais aussi le collagène, le mucus, etc. Pour cette raison nous croyons prudent de ne pas utiliser la solution toute préparée de Grübler; au moins en France, nous ne sommes Jamais sûrs de l'avoir suffisamment fraiche. Il est désagréable d’avoir à fabriquer aussi fréquemment un colorant dont la préparation est un peu compliquée, mais on en est amplement récompensé par les beaux résultats que l'on obtient.

FiscHer à montré qu'on pouvait, pour préparer par ce procédé des colorants de fibres élastiques, employer un très grand nombre de couleurs d’aniline. Il a signalé notamment l’emploi possible de la safranine, de la vésuvine. J1 dénomme ces colorants en faisant précéder la terminaison ne de la syllabe e/, la première syllabe d’élastine. Il a ainsi créé les mots de fuchséline, safranéline, vésuvéline. Quant aux colorants qu'ils désignent, ils ont leur valeur particulière pour les colorations combinées, la thionéline que l’on fabrique en partant de la thionine a une valeur toute spéciale : elle ne colore pas l’élastine, lorsqu’on différencie par l’alcool absolu, mais seulement la chondrine, tandis que la fuchséline colore également les deux.

Ce procédé presque sans utilisation dans notre cas particulier sert beaucoup en histologie des tumeurs.

sion (bec contre bec), et attendre quelques instants avant de poursuivre l'opération.

1. Quelquefois, pour des raisons que nous n'avons pu pénétrer, le précipité ne se dissout pas complètement, malgré 10 et 15 minutes d’ébullition. Il n'y a pas lieu de s'en inquiéter ; on peut poursuivre l'opération comme si la dissolution était complète.

Colorations simples par la méthode de Weigert

On met les coupes dans la fuchséline (ou dans tout autre colorant de même nature) pendant 25 à 30 minutes; on peut les y laisser davantage; on peut même, pour avoir une coloration plus lente, additionner le colorant primitif d'une quantité d’alcool convenable. Puis on retire les coupes et on les rince à l'alcool ordinaire d’abord, pour les plonger ensuite dans l'alcool absolu où on les laisse de 2 à 24 heures et plus. Si malgré un long séjour dans l’alcool absolu on n'obtenait pas une décoloration suffisante du fond, on pourrait se servir d'alcool chlorhydrique, à condition de très bien laver à l’eau la coupe retirée de la solution acide. Même par ce procédé on a de la peine à décolorer certaines coupes, surtout celles qui sont restées trop longtemps en contact avec le colorant, c’est pourquoi si l’on n’a pas le temps de leur faire subir le traitement convenable une fois retirées du colorant après un séjour suffisant, il faut les conserver dans l’eau. En effet le colorant de Weiïgert facilement soluble dans l'alcool est à peu près insoluble dans l'eau (1).

On obtient ainsi des fibres d’un bleu noir, très foncées, sur fond plus ou moins clair suivant l’activité de la décoloration. Il faut même se garder de prendre pour des éléments élastiques les fibrilles de diverses natures qui ne sont pas complètement effacées après une décoloration incomplète.

Colorations combinées

L'une des méthodes les plus récentes est celle de Jones (2) où les noyaux sont colorés à la pyronine : a) Fixation au sublimé ;

1. Quand on s’est taché les doigts avec le colorant de Weigert il faut se laver non à l’eau mais à l'alcool et le faire le plus tôt possible, car ce réactif a une certaine affinité pour la substance cornée.

2. L. Jores, Ueber die feineren Vorgänge bei der Bildung und Wieder-

bildung des elastischen Bindegewebes. Ziegler's Pris) XLI, 1907, P- 167.

Durcissement dans des alcools de titre croissant :

Coupes minces à la paraffine.

b). Coloration pendant une demi-heure à une heure dans la fuchséline de Weicerr.

c) Lavage à l’eau ;

d) Alcool à 96°. Dix minutes à plusieurs heures, jusqu’à décoloration complète du fond ;

e) Lavage à l’eau ;

/) Résorcine à 4 0/0. Laisser en contact dix minutes :

g) Lavage à l'eau ;

h) Coloration dans la pyronine. Préparer à chaque fois une solution à 1,5 0/0 (doit être employée fraiche). Laisser plusieurs heures si c’est nécessaire dans l’étuve à 37°.

i) Acétate de potasse à 1 0/0. Laisser en contact jusqu’à ce que le fond soit incolore (une à trois minutes), en contrôlant les progrès de la décoloration sous le microscope ;

j) Laver à l'eau et monter au baume.

Cette méthode donne des résultats excellents ; elle a le défaut d'être un peu complexe et surtout d'utiliser beaucoup de pyronine, laquelle est un réactif assez coûteux.

Fiscer préconise la double coloration safranéline + hématoxyline. I! opère comme suit :

a) Coloration à la safranéline, 25 à 30 minutes ;

b) Lavage à l'alcool et, différenciation dans l’alcool absolu pendant une demi-heure à trois heures ;

c) Eau à dix minutes ;

d) Coloration dans l’hématoxyline pendant le temps nécessaire ;

e) Lavage à l’eau;

f) Passage dans l'alcool chlorhydrique pour décolorer le fond;

g) Lavage plus long dans l'eau de conduite fréquemment renouvelée, au besoin dans l’eau chaude ou le bleuissement de

l’hématoxyline est plus rapide ;

h) Alcool, xylol, baume.

Nous avons peu employé la safranéline parce que les fibres élastiques les plus fines sont colorées en rose pâle ce qui les rend très difficile à suivre. Elles sont d'une étude plus commode lorsqu'on les a colorées en une teinte foncée, et qu’elles se détachent sur un fond pâle ou incolore.

Nous utilisons le plus souvent la coloration combinée carminfuchséline de la façon suivante :

a) Coloration dans le carmin boracique alcoolique (conformément à la formule indiquée dans Borzrs Lee et Hennrquy) (1). Laisser les coupes le plus longtemps possible : 18 à 24 heures et plus ;

b) Ne jamais laver à l’eau qui détruit la coloration à tous Les carmins, tant quelle n’a pas été fixée par l’alcool acide, mais,

c) Laver très rapidement à l'alcool à 90° et plonger dans le liquide de Weigert (qui contient suffisamment d'acide chlorhydrique pour fixer le carmin) ;

d) Laisser dans le colorant de Weigert 25 à 30 minutes ;

e) Différencier à l'alcool absolu 2 à 18 heures. Il faut pousser la différenciation aussi loin que possible, sinon les noyaux au lieu d’être rose prendront une teinte violette du plus mauvais aspect, et les détails nucléaires manqueront complètement ;

7) Eclaircir au xylol, monter au baume ;

Enfin pour les nombreux cas où il faut colorer en même temps le tissu conjonctif, nous employons une coloration de fond ou

1. On fait une solution aqueuse contenant 3 0/0 de carmin n° 40 et 4 0/0 de borax pulvérisé. On fait bouillir pour dissoudre pendant environ dix minutes. Après refroidissement, on ajoute un volume égal d’alcool à 900. On laisse reposer pendant 24 heures puis on filtre. Ce carmin donne des colorations nucléaires un peu pâles mais assez fines.

liquide de Van Giesox associé à l’hématéine au fer 1e la façon suivante :

a) Coloration à la fuchseline pendant 10 à 30 minutes ;

b) Différenciation à l'alcool absolu ;

c) Lavage à l'eau ;

d) Coloration à l’hématoxyline au fer (1) ;

e) Lavage à l’eau ;

f) Coloration dans le liquide de Van Gieson ;

g) Déshydratation et séjour prolongé dans le xylol (de dix minutes à plusieurs heures) qui a l'avantage de différencier tout à fait nettement la coloration au Van Gieson ;

h) Montage au baume.

1. Nous nous sommes servi, au lieu de l’hématéine au fer suivant HerpENHaIN, de l’hématéine au fer suivant HANSEN qui nous a été signalée par notre maitre M. le professeur Pierre Marie. En voici la technique de préparation d'après Hansen (Zeuschrift f. Wissenschaftltiche Mikroskopie, 1905, t. XXIT, p- 55).

a) 10 grammes d’alun de fer sont dissous à chaud dans 150 grammes d’eau distillée (il faut prendre de l’alun de fer pur : sulfate double de fer et d'ammoniaque).

b) On dissout à chaud dans 75 grammes d’eau distillée, 1 gr. 60 d'hématozyline cristallisée.

On laisse refroidir, on filtre, et, quand les deux solutions sont bien froides, on verse la solution d’alun de fer dans la solution d'hématoxyline en agitant constamment. Puis on chauffe progressivement, et on laisse bouillir à petit bouillon, pendant environ une minute en agitant constamment, mais doucement de crainte qu'en agitant trop fort on ne produise une oxydation excessive qui donnerait à la liqueur une teinte vert olive.

Dans le cas où cette teinte vert olive se produirait, à la place de la teinte brun foncé à laquelle on doit se tenir, il faudrait à la liqueur chauffée. ajouter goutte à goutte de l’acide oxalique à 10 0/0 jusqu’à ce que la teinte brune soit revenue. Laisser reposer 24 heures.

On à ainsi une liqueur brune, trouble, qu'il faut filtrer avant chaque usage, d’une très grande activité colorante (environ une minute de contact suffit). à

On colore pendant environ une minute, ou lave à l'eau de conduite on différencie au besoin avec de l’eau acidulée. Les noyaux sont colorés au bleu noir.

On a ainsi des fibres élastiques d’un bleu noir, des fibres conjonctives roses et des noyaux noirs, sur fond jaune.

En règle générale, on fera mieux d'utiliser la coloration simple chaque fois qu'il ne sera pas indispensable de colorer les noyaux ou le collagène : en effet toutes les méthodes combinées donnent des résultats variables et rendent les fibrilles très fines plus difficiles à suivre.

Nous sommes entré dans quelques détails à propos de la méthode de Weigert parce qu’elle n’est pas très répandue en France. Nous l’avons peu trouvée mentionnée en dehors du mémoire de Carxor et Auer (1) où l’on trouvera de bonnes indications techniques. En général les histologistes rebutés par les difficultés de préparation du liquide de Weigert se servent de la solution toute préparée de Grübler, ce qui à notre avis ne peut pas toujours donner de bons résultats. C’est probablement la raison pour laquelle ce procédé n’est pas très répandu.

2° HisTORIQUE

Il est très facilement démontrable que le poumon emphysémateux a notablement perdu de sonélasticité. Dès que l'on eut idée de l’existence du réseau élastique du poumon, on s’efforça d'en trouver les lésions que l’on espérait devoir être spécifiques de l’'emphysème.

Herrz, dans son article du Manuel de Ziemssen (t. V), semble être le premier à y avoir fait allusion. Il parle vaguement de troubles nutritifs, de relâchement du tissu élastique, qu’il estime indémontrables macroscopiquement.

Epriéer (2) est le premier à parler nettement d’un réseau de fibres élastiques. Etant donné qu'il se servait de la potasse pour les mettre en évidence, sa description est tout à fait remarquable. Il admet l'existence de fibres fortes et de fibres fines, ces dernières dépendances des premières, et prenant part à la for-

1. P. Carwor et P. Amer. Sur les fibres élastiques des cirrhoses du foie, Arch. de méd. expér. et d'anat. pathol., 1906, p. 752.

2, EPPiNGER, Loc. cit.

mation du soutèncment de la paroi alvéolaire. Il croit avoir trouvé une altération de ces fibres dans l’emphysème : « Les fibres les plus grosses, dit-il, sont, au niveau de la paroi alvéolaire, très écartées Les unes des autres et absolument réduites. Les fibrilles plus fines ont complètement disparu, et tout le réseau élastique est extrêmement simplifié. » |

Il explique très simplement la série des faits histologiques de l’'emphysème pulmonaire. Sous l'influence de la distension, de la distension continue surtout, les fibrilles élastiques s’écartent les unes des autres. Dans leurs intervalles la paroï alvéolaire qui n’est plus soutenue s’atrophie (sans qu'il soit bien facile d’en donner la raison et le mécanisme), et c’est à ce niveau que se produit la déhiscence primaire (nous avons vu que pour Isaaxsoax elle est préexistante). Les déhiscences se produisent toujours au niveau des espaces intercapillaires ; les fibres élastiques qui les limitent se retirent vers le point le plus fort, vers le capillaire. Nous avons vu aussi par quel mécanisme disparait le capillaire laissant place à la confluence des orifices, d’où déhiscence secondaire.

Kizæsr (1) a vu, comme ErriNcer, une déhiscence de la paroi alvéolaire. Il attribue ce phénomène à la séparation des éléments épithéliaux au niveau de leur substance cémentaire : par suite de la tension des parois alvéolaires se produisent des disjonctions de cellules épithéliales au niveau de leur ciment intercellulaire et leur détachement de la paroïi. « Les bords de ces déhiscences sont tantôt dentelés ou même déchiquetés (zerfetzt), tantôt ovales ou arrondis; dans les derniers cas ils semblent même encadrés de fibres élastiques ». Fréquemment ia lumière des orifices est remplie par un petit amas granuleux ayant encore souvent conservé la forme d’une ou plusieurs cellules épithéliales, et dans lesquelles étaient inclues aussi quelques granules pigmentaires.

Kzæsr le premier mentionne un réseau de fibres élastiques très fin, qu’on peut voir même sans adjonction de potasse. Il