CHAPITRE III

Le dosage de l'indol ne peut pas être fait directement dansle milieu qui le contient. — Les résultats suffisamment exacts qui sont donnés par le procédé de dosage que nous indiquons, sont obtenus avec une solution pure d’indol. D'après tout ce que nous avons écrit précédemment au sujet de la caractérisation de ce composé, il serait téméraire de vouloir le doser directement dans un liquide indolique de composition assez complexe, tel un milieu liquide de culture. Avant de procéder à son dosage, il est indispensable de commencer par l’isoler. L’extraire et l'obtenir seul en solution, est un idéal que nous nous sommes efforcé d'atteindre.

Nos premières expériences ont porté sur une solution aqueuse d’indol, de laquelle nous avons cherché à le retirer. Nous avons essayé la plus grande partie de ses dissolvants non miscibles ou peu miscibles à l’eau.

Extraction de l’indol d’un milieu complexe.

— 1° Par LE BENZÈNE. — Nous ne pouvions employer le benzène : celui du commerce n’est jamais pur et se purifie difficilement. Or, les impuretés du benzène ont une importance considérable comme l’a indiqué Denigès (12). La réaction qu’elles donnent avec l’in-

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dol en présence d'acide chlorhydrique est à peu près identique à celle de la p.-diméthylaminobenzaldéhyde et d’une remarquable sensibilité. Avec le toluène et le xylol, nous avons obtenu des réactions analogues bien que Denigès n'indique avec les homologues du benzène qu'une coloration jaune. D'après le même auteur le thiophène ne doit pas être incriminé, la réaction étant due probablement à des substances aminées(31). Effectivement la réaction de l’indophénine était positive avec le benzène et négative avec les deux autres corps.

Quelle que soit la cause de la réaction, on ne peut donc songer à utiliser le benzène commercial.

2° PAR LA LIGROÏNE. — La ligroïne présentant l’avantage de ne pas se dissoudre dans l’eau, nous l’avons essayée en premier lieu. Nous avons fait les extraits en agitant vigoureusement le mélange de solution indolique et de ligroïne dans un entonnoir à décantation. L'indol a été enlevé complètement de la solution aqueuse après quatre lavages. Nous avons employé 125 centimètres cubes de solution d'indol et nous avons fait les deux premiers épuisements avec chaque fois 50 centimètres cubes de ligroïne ; les deux autres, avec chaque fois 25 centimètres cubes du même solvant. Le dernier liquide d’épuisement ne donnait pas de réaction positive avec le réactif d'Ehrlich, mais cependant, il contenait encore de l’indol car 1 centimètre cube évaporé, à quelques gouttes donnait avec le p.-diméthylaminobenzaldéhyde une coloration rosée.

31. Denicès, Sur la présence de produits actifs sur l'indol dans le benzène du commerce et ses homologues (C. R. Soc. Biol., p. 296, 1908).

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Les quatre lavages vigoureux sont donc absolument nécessaires. La ligroïne et l’eau forment une espèce d'émulsion qui se disloque assez difficilement, la séparation est très longue et c’est là un grave inconvénient.

3° Par LE cHLOROFORME. — Le chloroforme permet une extraction complète par quatre lavages faits dans les conditions indiquées pour la ligroïne. Le chloroforme se sépare moins difficilement que celle-c1 et présente l'avantage, étant plus dense que l’eau, de se rassembler à la partie inférieure de l’entonnoir, mais il offre l'inconvénient de se fragmenter en de nombreuses petites gouttes qui s'attachent aux parois et qu’il est presque impossible de rassembler en totalité.

4° PAR L'ÉTHER ORDINAIRE. — M. le professeur Porcher (28) recommande l'extraction éthérée. Elle est, en effet, préférable à toute autre.

Au premier abord, on pourrait objecter que la solubilité de l’éther dans l’eau est un inconvénient qui ne permettra pas l'enlèvement complet de l'indol par suite du coefficient de partage. Dès le premier traitement, la solution aqueuse est saturée d’éther et nous avons pu constater que un ou plusieurs autres lavages enlevaient entièrement l’indol. Il nous restait à examiner si des extractions larges, peu nombreuses, étaient préférables à des extractions répétées faites avec de petites quantités d’éther.

Nous avons pris 29 centimètres cubes d’une solution aqueuse d'indol ; nous y avons ajouté 100 centimètres cubes d'éther et après avoir bien agité, nous avons laissé se séparer le liquide éthéré. Il est impossible, après

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cette première opération, de déceler l’indol dans la liqueur aqueuse. Elle en contient cependant. Une deuxième extraction faite avec 25 centimètres cubes d’éther, donne, en effet, une réaction positive, avec la p.-diméthylaminobenzaldéhyde. Nous faisons un troisième lavage avec 25 centimètres cubes d'éther. Celui-ci ne contient pas d’indol. En effet, 10 centimètres cubes évaporés à quelques gouttes ne donnent plus la réaction d'Ehrhch.

Des lavages plus nombreux avec de petites quantités d’éther nous ont amené au même résultat. Lorsque l’on voudra extraire l'indol d'une solution aqueuse, on agitera vigoureusement celle-ci avec environ la moitié de son volume d’éther, puis, une deuxième fois avec le dixième environ du volume primitif.

C'est ici qu'apparaît nettement la supériorité de ce dissolvant sur les autres.

Nous avons insisté dans le chapitre premier sur la nécessité de lavages acides, puis alcalins, de l’éther qui doit servir à l'extraction indolique.

M. le professeur Porcher (29) recommandait de faire subir le traitement à la solution éthérée. Mais nous avons remarqué qu’en agissant ainsi, on faisait disparaître, à chaque opération, une quantité relativement importante du corps que l’on veut recueillir. Cette quantité est proportionnelle au volume du liquide aqueux employé pour le lavage, mais beaucoup plus grande avec la solution alcaline qu'avec l’eau distillée ou la solution acide.

Il est donc nécessaire de purifier l’éther avant de

l’'employer.

Application du procédé aux bouillons de culture. — Dans le cas particulier d'un bouillon de culture le procédé pourra et devra même être employé. Quelques inconvénients se présenteront : le mélange, au bout d’un certain temps, laissera surnager une gelée qu'il faudra disloquer avec un peu d'alcool éthylique ; en outre, les lavages devront être répétés proportionnellement à la consistance de la culture (parfois cinq, six ou plus).

Les premières extractions sont faites avec un volume d'éther correspondant à la moitié du volume de bouillon, les autres au quart.

Sur ce sujet, notre Maître a présenté une intéressante publication à la Société de Biologie à la séance du 11 mars 1911. Pour ne pas y renvoyer le lecteur, nous la citerons presque en entier :

« Si l’indol appartient à une culture microbienne, deux extractions ne suffisent généralement pas ; on doit en multiplier le nombre et cela d’autant plus que la culture est plus abondante.

« Le contact entre la culture, liqueur aqueuse, riche en corps microbiens que l’on peut considérer comme des colloïdes à très gros grains, et l’éther est plus difficile à s'établir et, malgré l'application que l’on apporte à agiter très vigoureusement le mélangeaquosoéthéré, 1l faut quelquefois jusqu’à cinq à six larges extractions. C’est ainsi que 5 litres d’une culture de cinq semaines de coli ont réclamé l’emploi de 6 litres d’éther. Le grand nombre des extractions demande, à notre avis, une autre explication. L’indol fabriqué par le microbe est bien rejeté dans le milieu aqueux où

note celui-ei se développe, mais une partie est encore retenue par le protoplasma bactérien ; elle ne l’abandonne que lentement, lorsque l’éther venant à pénétrer peu à peu le corps cellulaire la fait diffuser dans le milieu extérieur.

« La présence de l’indol dans les corps microbiens n'est pas douteuse ; on la constate aussi bien dans le culot de centrifugation des cultures liquides plusieurs fois lavé avec du sérum physiologique que dans le produit pâteux provenant du raclage soigneux des cultures sur milieu solide {gélose-peptone).

« L’extraction de l’indol des cultures à l’aide de l'éther aboutit toujours, surtout lorsque la culture est très développée, à l'obtention d’une sorte de gelée qu’il est difficile de disloquer même par une centrifugation prolongée. Les extraits successifs ont toujours la même consistance. La stabilité de l’émulsion ainsi obtenue est due à la présence des corps microbiens ; on ne l'observe pas, en effet, lorsque la culture est peu abondante. S'il s’agit d’une culture anaérobie sous l'huile ordinaire, malgré le soin que l’on apporte à séparer la culture de l'huile qui surnage, on laisse toujours, en effet, quelques gouttelettes graisseuses que léther dissoudra en même temps que l'indol ; toutefois, dans ces conditions et du moment que la culture est peu développée, l'extrait éthéré n’aura pas de consistance pâteuse. Les gelées que donnent les cultures riches, que celles-ci produisent ou non de l'indol (coli, bacille typhique, fecalis, enteritidis), se disloquent rapidement par l'addition de quelques gouttes d'alcool en donnant deux couches, l’une supérieure éthérée, ren-

fermant s’il y a lieu l'indol, et l’autre inférieure aqueuse tenant en suspension les corps microbiens entraînés tout à l'heure dans la gelée. »

Lorsqu'on a réuni les différentes solutions éthérées obtenues, on ajoute une petite quantité de soude destinée à retenir les corps phénoliques qui auraient pu être entraînés et on introduit le mélange dans un ballon fermé par un bouchon à deux ouvertures. Dans l’une passe un tube recourbé relié à un réfrigérant descendant qui communique avec un récipient ; à l’autre est adapté un entonnoir à brome, plein d’eau. On distille l'éther au bain-marie sans s'inquiéter de l’indol quiest entraîné. Quand il ne reste plus dans le ballon qu'un liquide aqueux, on ouvre le robinet de l’entonnoir et on laisse écouler une certaine quantité d’eau. On continue à chauffer. La vapeur d’eau finit par entraîner tout l'indol (32). Finalement, le distillat se trouve constitué par un éther pur saturé d’eau, surnageant une légère couche aqueuse. On l'agite ; la majeure partie de l’indol passe dans l’éther. On décante et on enlève complètement l'indol du liquide aqueux par un deuxième lavage éthéré.

Impossibilité d'employer l'éther impur pour l'extraction indolique. — Formation d'indoxyle. — Nous nous sommes demandé s’il ne serait

32. N.d.l'A., On pourrait nous objecter que l'extraction éthérée peut-être supprimée et qu'il est beaucoup plus facile d’entraîner directement l’indol par la vapeur d'eau. Ce procédé présenterait un {très grave inconvénient, comme nous l'indiquerons au chapitre 11 de la deuxième partie, auquel nous renvoyons le lecteur.

hr pas possible de traiter le milieu primitif qui contient l’indol par un éther impur, non lavé, de distiller celui-ci et de reprendre le résidu par de l’éther pur pour obtenir la solution destinée au dosage.

Les essais que nous avons faits avec de l’éther insolé nous ont prouvé que le procédé était illusoire et en même temps nous ont donné des résultats intéressants.

Nous distillâmes lentement, avec de grandes précautions, sans jamais dépasser la température de 40 degrés (a); or, l'orsque l’éther fut presque entièrement distillé, le résidu prit une coloration bleutée, puis bleu verdàtre, augmentant d'intensité avec la concentration. La solution était légèrement dichroïque. Il s’était formé de l'indoxyle sous l’action oxydante des impuretés de l’éther, le peroxyde d’éthyle que plus vraisemblablement.

Un peu de cette liqueur prélevée, additionnée d’une goutte de soude, devenait bleue; si l’on acidifiait, la coloration passait au rouge. Dans le premier cas, on avait de l'indigotine, dans le second, de l’indirubine.

(a). Car, si l’ébulition de l’éther est rapide, on peut constater qu'une certaine partie de l’indol est entraînée.

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