Bacs, Zeitsch. f. Phys. chem

ie employé. C'est évidemment un milieu peptoné (37) à la condition que la peptone dérive d’un protéique tryptophanique.

Les matières tryptophaniques doivent être offertes au microbe sous une forme convenable; il est en effet nécessaire, pour que la production de l'indol soit rapide et forte, que l’aliment azoté soit déjà simplifié. Avec de la viande très finement hachée, le B. coli donnera de l’indol, mais beaucoup moins vite qu'avec les peptones trypsiques provenant de cette viande même.

C'est ainsi, qu'avec une simple bouillie de viande dans laquelle avait été cultivé un colibacille I, nous avons obtenu une réaction d'Ehrlich positive relativement faible. Or, cette culture datait de cinq mois.

Avec un l'œcalis I, cultivé et traité dans les mêmes conditions, on n'obtenait qu'une réaction négative.

Il en était de même, avec un échantillon d’Enteritidis.

L'extrait éthéré non concentré d'une culture de

37. N. d.l'A., Un milieu chimiquement défini, à base de tryptophane, remplacerait vraisemblablement, d'une façon avantageuse, le milieu peptoné. Notre maître, M. le professeur Porcuer, avec l’aide de M. Hervisux, prépare à son laboratoire une assez grande quantité de tryptophane d'après la méthode d'Horxins et Corr, avec lequel il se propose de faire des essais dont il publiera les résultats. Mais comme le bactériologiste ne peut pas aisément se procurer du tryptophane, le même auteur conseille de remplacer le milieu idéal par une digestion trypsique de caséine faite dans des conditions déterminées. Elle permettrait aux différents observateurs d'avoir un milieu à peu près constant, par conséquent d'opérer toujours dans les mêmes conditions et d'obtenir des résultats comparables entre eux.

LENS Proteus donnait une réaction très nette, alors que Feltz (38) n'avait pas trouvé d'indol avec le Proteus cultivé dans les mêmes conditions. Il a constaté également son absence dans une culture faite en bouillon simple. Pour ces recherches, cet auteur employait les procédés de Salkowski et de Legal. Péré (36) de même a avancé qu'il ne trouvait pas d’indol dans les milieux à la bouillie de viande avec le B. coli. Nos essais démontrent péremptoirement le contraire. Rien n’est plus logique d’ailleurs que de trouver de l’indol dans un milieu où l’on n’a pas introduit, au préalable, de peptone, si les microbes qu'on y ensemence sécrètent des diastases protéolytiques. La production d'indol est en quelque sorte proportionnée à l’activité de ces dernières. 2° BOUILLON DE VIANDE. — Les résultats obtenus avec le bouillon de viande ne sont guère meilleurs. Du reste, sa préparation appartient un peu au domaine de la cuisine et là, plus que partout ailleurs, les divergences sont très grandes.

La préparation d’un bouillon de culture varie d'un laboratoire à l’autre. Le milieu n’est donc jamais constant et ne peut pas l'être, quelle que soit la technique employée.

Les peptones sont d’ailleurs en quantité variable et toujours très petite.

3° BOUILLON DE VIANDE PEPTONÉ. — C'est avec le bouillon peptoné que furent faites les premières

38. Feurz, Contribution à l'étude du « Proteus vulgaris » (thèse Paris, 1900).

39. PÉRÉ, Contribution à la biologie du hacterium coli et du bacille typhique (Annales de l'Inst. Pasteur. ,t. 6, p.512, 1892).

Et

recherches de Kitasato. La production d’indol est certaine dans ces conditions; mais, étant donné la complexité du milieu (40), son apparition sera parfois assez retardée. En outre, la quantité produite sera quelquefois très petite. En effet, le microbe, parmi tous les produits constitutifs du bouillon, peut parfaitement faire un choix et ne pas attaquer la substance mère de l’indol (41). En réalité, elles le sont, mais seulement après d’autres matières azotées. C’est pour cette raison que Feltz (39) ne trouve qu'irrégulièrement de l'indol en bouillon peptoné avec le Proteus vulgaris.

4 Bouizcon pe Marin. — Le bouillon de Marün présenterait l'avantage d’être mieux défini que le bouillon de viande peptoné, mais 1l ne peut être employé. M. le professeur Porcher a démontré qu'il renfermait des quantités notables d’indol. C'est donc à tort que Feltz l'a employé dans ses recherches.

40. N. d. l'A. D'après Lresic, à côté de sels minéraux constitués surtout par du chlorure et du phosphate de potasse, du phosphate de magnésie, on trouve la créatinine, la créatine, l'acide sarcolactique ; Wiszicenus y trouve de l'acide éthylidénolactique; Srrecker, de la sarcine ; Sezerer, de la xanthine et de l’inosite ; Guarescui et Mosso, de la méthylhydantoïne.. Puis il y à une série de ptomaïnes décrites par A. Gaurier, la xanthocréatinine, la chrysocréatinine, l'amphicréatinine, la pseudoxanthine et d'autres non dénommés. Et à cette longue liste il faut ajouter le glucose, les dextrines, l’urée, l'acide urique et les peptones.

41. N. d. l'A. Nous entendons par substance mère de l'indol non seulement le tryptophane, mais aussi les produits voisins susceptibles de se dédoubler facilement sous une influence diastasique ou autre pour arriver rapidement au terme tryptophane.

M 9° EAU PEPTONÉE, — L'eau peptonée simple ou contenant des sels en dissolution, a été préconisée par tous les auteurs qui se sont occupés de la question. Elle donne d’ailleurs d'excellents résultats (42). Action des sels dissous dans l'eau peptonée. — Selter (43) recommande une solution de peptone à 1 pour 100 additionnée de 50 centigrammes de phosphate de sodium et 10 centigrammes de sulfate de magnésie. Escallon et Sicre (14) préconisent une solution de peptone pancréatique 410 pour 100 contenant 1 gramme de chlorure de sodium; Tobey (44), une solution de peptone à 1 pour 100 contenant 5o centigrammes de chlorure de sodium (c’est la solution de Dunham) Nonotte et Demanche (45), une solution neutralisée contenant 2 pour 100 de peptone et 5 pour 1.000 de chlorure de sodium. D’après Gèzes (46) la présence d'un sel ammoniacal entrave complètement la production de l’indol.

Péré (39) recommande l’addition d’un peu de phosphate de potassium à la solution de peptone. Feltz (38) démontre que, trois jours après l'ensemencement, une

42. N. d. l'A. Nous démontrerons plus loin que les peptones ne sont pas toutes susceptibles d'être employées pour ces essais.

43. Secrer, Ueber Indolbildung durch Bakterien (Cent. für Bakt. Orig., t. 51, 1909).

44. Tosgy. The method for testing the indol reaction, The cholera-red reaction and the indol-reaction (Journal of med. Research, t. 15, fasc. 3, pp. 301-304 et 305-307).

45. Noxorre et Druaxcue, Dosage de l’indol dans les cultures microbiennes (C. 2. Soc. Biol., p. 658, 1908).

46. Gëzes, De la recherche du bacille d'Eberth dans les eaux de boissons (thèse de médecine, Lyon, 1902).

ER solution contenant 3 gr. 5o pour 100 de peptone, 5o centigrammes pour 100 de chlorure de sodium et 5o centigrammes de nitrate de potasse, donne une réaction de l’indol moins nette qu’une solution simple de peptone ensemencée en même temps.

D'après Grimbert (47) le meilleur milieu est une solution de peptone à 3 pour 100 dans l’eau distllée. On neutralise à l’ébullition et filtre, puis stérilise après avoir réparti la solution dans des tubes à essais.

S'il y a des divergences sur la question des sels, tous les auteurs, et en particulier Péré (33), Feltz (38), Grimbert (47), W. de Graaf (48) s'accordent à dire que l'addition de glucose au milieu de culture s'oppose à la production de l’indol. Il en est de même pour le lactose, d’après Baginski (36).

La fermentation des sucres et celle des protéiques commencent bien en même temps, mais, d'après Tissier et Martelly, Simnitzki, la deuxième (probablement sous l'influence de l'acide lactique formé) s'arrête, et les termes indol, scatol, etc. ne sont pas atteints.

Nous avons essayé tous les milieux préconisés, en les employant tels que les auteurs les ont donnés, ou en les modifiant légèrement.

Notre premier milieu A, contenait pour 100 grammes d’eau, 5o centigrammes de phosphate de soude,

47. GrimserT, Diagnostic des bactéries par leurs fonctions biochimiques {Archives de Parasitologie, 7, n° », p. 237, 1903).

48. W-C. pe Graar, Untersuchungen über Indolbildung des Bacterium Coli commune (Centralb, f. Bakt., Original, t. 49, février 1909).

1 gramme de sulfate de magnésie et 3 grammes de

peptone M.

Notre deuxième milieu B, contenait pour 100 grammes d’eau, 3 grammes de peptone M, et 5o centigrammes de chlorure de sodium.

Le troisième milieu C, pour 100 grammes d’eau, 50 centigrammes de nitrate de potasse et 3 grammes de peptone M.

Le quatrième milieu D, 1 gramme de phosphate d’ammonium et 3 grammes de peptone pour 100 grammes d’eau.

Ces différents milieux étaient ensemencés dans les mêmes conditions avec un coli H, Quatre heures après, un extrait éthéré donnait avec la p.-diméthylaminobenzaldéhyde :

Pour le milieu À, une réaction intense ;

Pour le milieu B, une réaction légère ;

Pour le milieu C, une réaction négative;

Pour le milieu D, une réaction intense.

Le premier milieu et le dernier apparaissent comme les plus favorables pour la production de l’indol. Ce sont ceux qui contiennent des phosphales. Ils ont favorisé indirectement l'attaque du tryptophane en facilitant le développement des microbes. Effectivement, les cultures dans les milieux phosphatés sont plus abondantes que les autres. On arrive du reste à un résultat analogue avec l’aérobiose ou l'anaérobiose, suivant la facilité avec laquelle les microbes s'adaptent à l’un ou à l’autre mode de culture.

Le troisième milieu, qui contient du nitrate de potasse, ne donne pas d'indol quand on arrête l'expé-

= ha rience: mais il n'en est plus de même, si on laisse les tubes à l’étuve vingt heures de plus; ce qui confirme les expériences de Feltz(38).

La réaction positive donnée par le quatrième milieu infirme la conclusion de Gèzes (46), relative aux sels d’ammonium. |

La peptone que nous avons employée précipitait par les phosphates ; même après filtration et stérilisation, le milieu restait louche.

C’est à cause de ce léger inconvénient, que nous avons préféré employer une solution de peptone pure. Les résultats ne sont en rien changés, l’apparition de la réaction caractéristique de l’indol est seulement un peu retardée.

Choix d'une peptone. — La solution qui nous a servi pour toutes nos expériences, est une solution à 3 pour 0/0 de peptone M dans de l’eau distillée. Mais qu'est-ce qu’une solution de peptone ?

La peptone est une substance albuminoïde de caractères physiques et chimiques et d’origine variables non seulement avec les matières premières misesen œuvre, mais aussi et surtout avec le mode de transformation que l'on fait intervenir. Ces matières premières employées parfois dans un état de putréfaction assez avancé, sont tantôt de la gélatine ou de l’ovalbumine, tantôt de la caséine ou de la fibrine. Les peptones de viande étant d’un prix de revient élevé, souvent on part d'un mélange des diverses substances indiquées, en proportions variables, et c’est précisément à cause de ce mélange que les réactions colorées

oi

pour différencier les peptones n’ont pas grande valeur. Dans le commerce, les préparations élant tenues secrètes, 1l est bien difficile de connaître l’origine du produit que l’on emploie. En outre, il arrive parfois que des peptones d’origine ou de préparations différentes portent le même nom. Il se produit alors des confusions fâcheuses. En effet, si l’on veut reproduire les expériences de certains auteurs en employant les produits qu'ils ont recommandé, on est surpris de ne pas obtenir les résultats attendus (49). La plupart des peptones connues ont été préconisées (50) de telle sorte qu’il est bien difficile de faire un choix. Nos recherches ont porté principalement sur les peptones Cx, P, D, W, M, Ct.

Les extraits éthérés des peptones W et Ct donnaient une réaction colorée avec la p.-diméthylaminobenzal-

49. N. d. l’A. Certains auteurs ont recommandé la marque d’une grande maison que nous ne désignerons point. Lorsque nous avons voulu nous procurer cette marque, la maison elle-même nous à répondu qu’elle ne fabriquait pas de peptone et que pour ce produit elle ne servait que d'intermédiaire. Elle livre au commerce une peptone qui porte sa firme, mais ce produit est évidemment sujet à caution quand on l'emploie pour un milieu de culture dont les plus petites variations peuvent avoir de grandes répercussions.

Nos recherches ont été faites avec une peptone fournie dans les mêmes conditions.

5o. N. d. l'A. Ilest rare de rencontrer de telles divergences. NoxorrTe et DEMANCHE recommandent la peptone ByLa, alors que Sicre et Fecrz n’en veulent pas. Ferrz recommande la peptone Cozzas, la peptone CaassaixG ou le bouillon de Marrix, dont le professeur Porcxer a signalé le grave inconvénient. Sicre préconise la peptone de Wrrre et celle de Pourexc; Buarp les peptones Wrrre et DEFRESNE ; STEENSMA la peptone Wirre, etc.

ENBMES déhyde en milieu chlorhydrique. Il était donc impossible d'employer ces marques.

Les quatre autres étaient ensemencées avec un coli provenant du laboratoire. La culture en peptone P ne contenait que des traces d’indol, trois semaines après l’ensemencement.

Parmi les trois autres, la peptone D contenait des traces d’indol trois heures et demie après l’ensemencement ; les peptones Cx et M en contenaient à peu près la même quantité : la première, deux heures après l’ensemencement ; la deuxième, une heure et demie seulement après.

Nous avons choisi la peptone M. C'est elle que nous emploierons pour toutes les recherches qui vont suivre. Nous ne la recommandons pas, parce que nous savons qu'elle porte la firme d’un intermédiaire et que, d'un jour à l’autre, le produit, d’excellent qu'il était, peut devenir moins bon. Du reste, toute peptone peut être employée à condition qu’elle réponde aux deux essais suivants :

Caractères que doit présenter une peptone pour pouvoir être employée. — 1° On en fait une solution aqueuse à 3 pour 100 dont on prélève environ 20 grammes. On les agite vivement dans un entonnoir à décantation avec 10 centimètres cubes d’éther ordinaire ; on obtient une émulsion qui surnage au bout de très peu de temps. On la sépare de la partie inférieure. Si, à ce moment, elle n’est pas entièrement disloquée, on ajoute quelques gouttes d'alcool à 90 degrés qui modifie la tension superf-

On

cielle. On fait tourner l’entonnoir entre les mains en le prenant par la partie inférieure ; puis on laisse au repos et on voit bientôt l’éther limpide surnager. Il est facile de le recueillir. Très souvent, des particules d’émulsion s’attachent aux parois de l'appareil et sont entraînées ensuite par l’éther qu'il est difficile d’obtenir seul. En conséquence, il vaut mieux, après dislocation de l’'émulsion, recevoir le tout dans un petit tube d’une dizaine de centimètres cubes et décanter l'éther qui surnage dans un autre tube de même calibre, On ajoute alors un peu d’acide chlorhydrique et environ une goutte de p.-diméthylaminobenzaldéhyde par centimètre cube d’éther. Au bout d’un instant, si la peptone contient de l'indol{5r) on aperçoit à la surface de séparation un léger anneau rouge violet.

2° Une peptone qui ne donnera pas cette réaction pourra être utilisée pour le deuxième essai ; elle sera

51. N. d. l'A. Sicre (24) d’abord, puis le professeur PorcHER ont démontré qu'il existe de l’indol dans presque toutes les peptones commerciales, ordinairement en très petite quantité. « La quantité d'indol trouvée, toujours extrêmement faible, varie beaucoup avec la peptone examinée. Elle correspond à une fraction de dixième de milligramme pour 50 grammes de peptone sèche; aussi peut-elle échapper à l'observateur s'il ne prend pas la précaution de concentrer l'extrait éthéré obtenu. » (Porcuer.) Le professeur Porcaer recommande de faire bouillir la solution de peptone pour chasser ces traces d’indol {voir C. À. Soc. Biol., 16 avril r910). Nous avons suivi son conseil; mais les résultats trouvés n'ont pas été ceux que nous attendions. Il est nécessaire de faire bouillir longtemps la solution de peptone pour la purifier. C'est une complication dont nous n'avons pas tenu compte parce que les recherches peuvent très bien s’effectuer sans avoir à redouter une erreur même avec une peptone contenant des traces infinitésimales d’indol.

alors ensemencéeavec du colibacille. Au bout de cinq à six heures on la soumettra à l’essai précédent qui devra cette fois être positif (généralement la réaction se produit avant le temps indiqué, elle est positive même avant qu'apparaisse un lécher louche).

. Si la peptone satisfait aux deux essais, elle peut être employée.

D'après les travaux de Péré (39), il faut préférer une peptone pancréatique à une peptone pepsique. Dans la première, la dislocation de la matière protéique a été poussée plus loin. La pepsine a enlevé le toit de l’édifice moléculaire ; la trypsine enlève les cloisons internes, ne laissant subsister que les murs externes, les plus solides : le tryptophane, complètement libéré ou presque de ses combinaisons, est attaqué directement par les microbes d’où production plus rapide et plus intense d'indol.

Dès lors il paraît rationnel d'employer les peptones trypsiques. Doncaux deux essais précédents on pourrait en ajouter un troisième. On additionnera d’eau de brome la solution de peptone. Si elle donne une coloration rouge violacé intense passant au brun par un excès de réactif, on se trouvera en présence d’une peptone pancréatique.

Les résultats différents que nous avons trouvés en opérant toujours dansles mêmes conditions, mais avec diverses peptones, ont déjà été signalés. Ils sont une preuve irréfutable du rôle joué par le milieu de culture. Des essais faits avec le produit de la peptonification de la gélatine nous ont montré, conformément aux déductions à priori, que dans ces conditions il n’y avait

pas apparition d’indol: la gélatine en effet n’est pas un protéique tryptophanique. « Depuis longtemps, divers auteurs, en se plaçant à des points de vue différents, avaient montré que la gélatine ne donne pas d'indol, que son dédoublement soit effectué par des moyens chimiques, acides ou alcalis (E. FiscHer, LEVENE et Apers, Ueber die Hydrolyse des Leims, Z. f. Physiol. ch., 35,70 1902) ou par les microbes de la putréfaction » (Porcher.)

LS Ge