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C'est d’ailleurs une règle générale en biologie ; chaque espèce animale possède une odeur particulière qui se retrouve dans les sécrétions, les tissus, mais qui se localise plus particulièrement dans les graisses.

Le résidu éthéré est additionné d'eau alcaline qui dissout les acides gras et les savons ; un épuisement à l’éther enlève les graisses restées insolubles.

On acidifie alors pour libérer les acides gras de la bile, et les acides des savons alcalins, puis on traité à nouveau par l'éther qui dissout les acides gras et les cholestérines.

Cette solution éthérée est soumise à une distillation incomplète; les dernières portions d'éther, par évaporation lente, abandonnent à l’état cristallisé les cholestérines et une partie des acides gras cristallisables. Le résidu est alors versé sur filtre à succion et arrosé lentement avec de l'alcool méthylique. On sépare de cette façon presque la totalité des cholestérines à l'état de belles lamelles nacrées dont le point de fusion est { == 145°, seul caractère fixe bien connu actuellement.

La solution méthylique a dissous les acides gras. On la concentre légèrement au bain-marie en présence de noir animal. Après filtration on laisse évaporer lentement au froid. Il se dépose, en plusieurs fois, des aiguilles cristallines d’acides gras.

Les acides gras à point de fusion très bas, ainsi que l'acide oléique restent en solution.

On parvient ainsi à séparer d’une façon satisfaisante l'extrait éthéré en quatre groupes ; graisses neutres, cholestérines, acides gras cristallisables et non cristallisables.

Ë graisses neutres, 9,5.

1.000 centimètres cubes de bile de porc Ÿ cholestérines, 0,85. donnent acides gras cristallisables, 3.

acides non cristallisables, 4.

\ graisses neutres, 6,5.

1.000 centimètres cubes de bile de chien } cholestérines, 0,07. donnent acides gras crist., 2,30. acides non crist., 0,90.

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IT. Extrait sec. — La bile débarrassée d'une partie des matières grasses est recueillie dans de larges plats en porcelaine puis exposée à l'air pour permettre le départ de l'excès d'éther. On porte alors au bain-marie bouillant. Il faut environ 50 à 60 heures pour amener un litre de bile dégraissée à consistance sirupeuse. À partir de ce moment il est nécessaire de brasser la masse de façon à renouveler les surfaces ; en effet, les parties profondes gardent l’eau avec ténacité. Bientôt même la dessication ne progresse pas, l'eau perdue par le sirop biliaire est remplacée par la vapeur d'eau provenant du bain-marie. |

On achève l'opération à l'étuve à 40°, en modifiant plusieurs fois les surfaces.

On obtient alors une masse sèche, cassante, se réduisant aisément en poudre. Blond jaunâtre chez le porc, elle est brun foncé chez le chien, verdâtre où brunâtre chez le bœuf et rappelle d'assez près la couleur de la bile liquide. Aussitôt elle doit être recueillie ét mise au sec, en flacons bien bouchés, car elle est très hygroscopique. Cette matière constitue l'extrait sec biliaire dégraissé.

Le poids varie très nettement suivant les espèces.

Extrait sec dégraissé

Volume de bile évaporée partiellement Chiens 1.000 centimètres cubes 220 POrG rente — 137 Veau — 106 BOURSE. — 107 Congre =. — 143

La bile de chien est donc la plus chargée en résidu sec, tandis que celle des bovidés est la plus pauvre.

III. Mucines ou pseudo-mucines. — En attendant que l’on connaisse d'une façon exacte la nature chimique de ces substances nous avons dû les séparer. L’extrait sec est traité par l'alcool méthylique fort qui dissous les sels biliaires, les pigments, les matières grasses qui ont échappé à l'épuisement

éthéré et abandonne les mucines, les débris cellulaires non éliminés par repos, et une grande partie des substances minérales.

L'opération se fait au bain-marie; on introduit dans un ballon d’un litre et demi un poids connu d'extrait sec environ 100 grammes réduit en poudre, ou simplement cassé en petits fragments. On ajoute 500 grammes d'alcool méthylique et on relie à un réfrigérant ascendant. En quelques minutes toutes les matières solubles ont passé dans le solvant ; il ne reste que des flocons jaunâtres ou brun verdâtre qui nagent dans la liqueur et au fond du ballon des sels minéraux.

On cesse de chauffer ; après repos on verse sur filtre à succion la partie du liquide clair encore chaud, puis le dépôt floconneux des substances insolubles. On lave la partie filtrée tant que les alcools de lavage se colorent.

L'ensemble des alcools, formant un volume de un litre à un litre et demi, est réuni pour un traitement ultérieur.

La matière insoluble est recueillie séchée et pesée. On obtient les chiffres suivants :

Poids des substances

Volume de bile insolubles Chien 7700, 1.000 centimètres cubes 6,3 Porc rte — 9,9 NEA MERS IE. — 4,66 BŒUFME MEME — LS Congre. . . — nee

C'est donc la bile des bovidés adultes qui est la plus riche en mucus, mais à ce point de vue, il existe des variations assez grandes suivant les échantillons aussi bien pour la bile de cet animal que pour celle de congre. Au contraire la viscosité est à peu près toujours la même chez le chien, le porc et le veau.

La partie insoluble dans le méthanol change très vite de couleur, par dessiccation elle devient brun foncé. Malgré de nombreux lavages elle retient loujours de petites quantités de pigments, en particulier de bilirubine, comme permet de le constater un épuisement au chloroforme,

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Les sels minéraux solubles qui accompagnent les mucines sont séparés par un traitement de celles-ci à l’eau distillée.

On constate en même temps que l’insolubilité des mucines n'est que relative. En effet, dans une expérience faite sur la bile de chien qui nous avait donné 2 gr. 3 de mucines, nous sommes parvenus à redissoudre dans l’eau 0,3 de matière. Une demi-heure de chauffe au bain-marie a suffi pour obtenir après filtration une liqueur brune qui par évaporation à sec a abandonné une mince croûte sèche, cassante et transparente. Brûlée sur lame de platine cette substance donnait un charbon foisonnant et répandait une odeur de corne brûlée comme les substances albuminoïdes. C'est donc une proportion de 13 0/0 qui est restée soluble malgré les déshydratations successives, par dessiccation et par lessivage à l’alcool fort.

IV. Pigments biliaires. — La liqueur méthylique est alors additionnée à l'ébullition de métholate de baryum pour précipiter l’ensemble des pigments ; pigments orangés ou verts.

Jusqu'à présent le méthanolate de baryum était un produit de collection, de laboratoire. MM. Erarp et A. Vica, en ant fait un réactif courant en chimie biologique. Ils ont été conduits à cela par la considération suivante; c'est que les mêmes réactions peuvent se passer d’une façon toute différente dans des milieux différents. Par exemple dans un milieu aqueux telle combinaison peut se comporter autrement que dans un milieu alcoolique, c'est-à-dire anhydre. Il faut donc des réactifs adaptés aux milieux. Le méthanolate de baryte est précisément un réactif destiné à être employé en milieu anhydre.

On le prépare d'après la technique des auteurs : de la baryte caustique est finement pulvérisée au mortier recouvert de papier ou d’un linge pour éviter les poussières très irritantes, puis mise dans un flacon contenant de l’alcool méthylique anhydre et on bouche. On emploie ro grammes de baryte pour 100 cc d'alcool. On agite fréquemment le mélange et on

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filtre après 24 heures. La liqueur barytique doit être conservée avec soin à l'abri de toute humidité.

L'alcool méthylique s'est saturé de baryte ; il contient environ 6 0/0 de baryum, sous forme de (CH*0)Ba.

L'emploi de ce réactif que nous avons utilisé pour la défécation des pigments se fait de là façon suivante :

La liqueur méthylique contenant les pigments et les sels biliaires est versée dans un ballon relié au réfrigérant ascendant; un tube à brome est adapté au col de ce ballon. On porte à l’ébullilion, au bain-marie, la liqueur à traiter et on ÿ fait tomber goutte à goutte du méthanolate de baryum. Cha: que goutte de réactif détermine la formation d'un précipité floconneux jaune brun. On continue jusqu'à ce qu’il ne se fasse plus qu'un très faible précipité et que la liqueur soit devenue à peu près incolore. Si on suit au tournesol la marche de l'expérience on constate l'apparition d'une réaction alcaline bien avant que la précipitation soit achevée.

Partant d’une liqueur légèrement acide, on arrive assez vite à neutralité puis à une réaction faiblement alcaline qui se maintient ainsi longtemps. Ce n’est que quand la précipitaion est à peu près complète que le tournesol bleuit fortement.

La liqueur est alors laissée au repos; le précipité se rassemble lentement au fond du ballon. On décante la solution claire et on retient le précipité sur filtre. Après lavage à l’alcool on le recueille et sèche sur vide sulfurique.

On obtient avec les diverses biles Les résultats suivants :

Poids du précipité pigmentaire

Volume de bile de défécalion barytique Chienmenene 1.000 centimètres cubes HET POTEAU SEE a - Veau ere ; — Do BŒUF' pr MAR — 6,2 Congre. . . — 8,5

On remarque qu'au cours de l’addition du métholate de baryum, une partie du précipité qui se forme, se redissout

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aussitôt. C’est que le réactif précipite, en même temps que les pigments, des sels biliaires, dont les sels de baryum sont solubles à chaud dans un excès d'alcool méthylique. Il ne reste donc, en gros, d'insoluble que les pigments qui sont entraînées par le baryum. Il s’agit d'une véritable défécation pigmentaire en milieu anhydre, alcoolique.

Le produit après dessiccation est traité en vue de l'isolement des pigments qu'il contient. Pour cela on le pulvérise et on lé met en contact quelques instants avec une solution à 10 0/0 environ d’acide chlorhydrique. Le baryum combiné se dissout à l’état de BaCÉ et libère les pigments qui sont filtrés, lavés et séchés. On peut alors séparer les deux pigments principaux verts et orangés.

Par un épuisement à l’alcool méthylique ou éthylique on dissout la biliverdine et ses dérivés. Quand l'alcool ne se colore plus on traite par le chloroforme où le tétrachlorure de carbone. La bilirubine passe dans ces colorants ou on peut la caractériser par le chlore, le brome ou liode et desquels l'isolement par cristallisation est aisé.

Sauf dans la bile de congre, nous avons constaté la présence des deux sortes de pigments. La bile de chien est particulièrement riche en bilirubine ainsi d’ailleurs que celle de porc quoiqu'à un moindre degré. Les biles de bœuf et de veau contiennent surtout des pigments verts.

C'est surtout à l'état de sel alcalin que la bilirubine se trouve au moment de la précipitation par le métholate de .baryum.

On sait en effet que la bilirubine libre est très peu soluble dans l’alcool; aussi pendant l'épuisement méthylique de l’extrait sec biliaire, ce pigment reste-t-il en très grande proportion dans la partie insoluble.

Le sort de la bilirubine libre est donc assez complexe dans notre technique.Une faible quantité est enlevée en même temps que les matières grasses au moment de l’épuisement par l’éther de la bile nature ; une autre portion beaucoup plus importante subi des modifications d’ailleurs encore inconnues

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pendant l'évaporation de la bile au bain-marie puis à l’étuve. Il ne passe donc en solution alcoolique que les bilirubinates alcalins. i

Le pigment vert qui ne paraît pas exister à l’état libre, accompagne le pigment orangé et se trouve déféqué en même temps que lui par le métholate de baryum.

V. Sels biliaires. — La solution méthylique biliaire privée de ses pigments est débarrassée d'alcool par distillation poussée à l’état de sirop à l’aide du vide. On reprend par un faible volume d’eau distillée ; par repos montent à la surface de la solution chauffée quelques instants au bain-marie, de fines particules graisseuses. On les sépare et on achève l'épuisement par de l’éther ; ces matières grasses doivent être jointes aux premières.

La liqueur biliaire légèrement alcaline par le baryte est carbonatée à refus puis soumise à l'ébullition pour précipiter le carbonate de baryte, filtrée et évaporée à sec au bain-marie et à l’étuve à 4o°.

On isole ainsi la totalité des sels biliaires.

Voici les chiffres obtenus pour les différentes biles.

Poids des sels

Volume de bile biliaires CERTES 1.000 centimètres cubes 197 1 MATH DES RUE — 120 Veauteemrn — 91 Bœul- 7 É — 92 COnCrereE ee = 128

Ces sels se présentent sous la forme de masse cassante, friable, facile à réduire en poudre, de couleur blonde, de saveur à la fois amère et sucrée et d’odeur légèrement fade. Sous cette forme ils peuvent être employés pour certains usages thérapeutiques et biologiques.

Au point de vue thérapeutique il y aurait grand avantage scientifique à en substituer l’usage aux nombreuses préparations de bile séchée avec toutes ses impuretés.

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Ils ne sont pas moins intéressants au point de vue biologique. Tout récemment, en effet, les bactériologistes ont montré que le bacille d'Eserrn pousse plus activement dans un milieu biliaire que le bacterium coli. Is (1) ont recommandé comme milieu de culture, un bouillon peptone-gélose additionné de bile nature et de colorants (tournesol, vert malachite). Or la présence de la bile offre deux graves inconvénients : le premier tient à la couleur naturelle de la bile qui masque le virage des réactifs colorants, le deuxième est dû à la présence des sels minéraux et peut-être d'acides gras qui se déposent sous forme d’efflorescences par suite d’une dessiccation partielle à l’étuve à 37°. On éviterait ces imperfections en utilisant les sels biliaires tels qu'ils sont préparés par notre méthode.

VI. Séparation des sels biliaires. Historique. — La séparation des sels biliaires est une question des plus difficiles et loin d’être résolue encore malgré les recherches longues, patientes des savants, chimistes ou physiologistes.

On admet avec tous les classiques qu’il existe deux grands groupes d'acides biliaires, les acides soufrés (taurocholiques) et les non soufrés (glycocholiques). Il est possible également que chacun d’eux soit complexe et qu'il y ait plusieurs acides taurocholiques et glycocholiques et même selon nous des acides mixtes. Ce n’est d’ailleurs pas là une simple hypothèse; elle est basée en particulier, pour les acides soufrés, sur de réelles différences de propriété vis-à-vis des réactifs chimiques. Formulée déjà par TenGsrrôm, cette conception tend à s’acréditer en physiologie.

Quoi qu'il en soit, la classification établie par STRECKER (2) conserve provisoirement toute sa valeur. Les divers acides glycocholiques donnent par hydrolyse du glycocolle et un noyau cholalique, les acides taurocholiques de la taurine et un noyau cholalique voisin du premier.

(1) Duxscmann, Annales Institut Pasteur, p. 48, 1909. (2) Srrecker, Liebig’s Ann. Chem. Pharm., 65, 9. Piettre

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Il faut donc avant toute recherche étudier et réaliser des méthodes de séparation de ces deux grandes familles. Alors seulement il sera possible de pénétrer plus avant dans la question et d'établir si chaque groupe est simple ou complexe.

Les premières recherchés faites dans cette voie sont dues à STRECKER.

Cet éminent chimiste employait les sels de plomb pour obtenir la séparation des acides glycocholiques et taurocholiques. Il remarqua qu’une solution de glycocholate de soude précipite lorsqu’on l’additionne d’acétate de plomb et qu'au contraire le taurocholate alcalin reste dans la solution. Pour obtenir la précipitation du sel soufré il faut faire réagir l’acétate de plomb en liqueur légèrement ammoniacale.

Il partait d’une solution de bile cristallisée obtenue par la méthode de Prarrner, et la précipitait avec l’acétate neutre de plomb. Dans la liqueur filtrée et séparée de ce précipité il déterminait une deuxième précipitation au moyen d’acétate basique de plomb. Les deux précipités plombiques étaient lavés, séchés et dissous dans l’alcool. Cette solution était débarrassée du plomb par l'hydrogène sulfuré. Après distillation de l'alcool il obtenait séparément les deux acides biliaires.

Cette méthode est restée la seule classique jusqu'aux recherches de TENGsTRôÔM, malgré sa valeur très relative. Srrecker d'ailleurs a reconnu que le précipité isolé par l’acétate basique de plomb n’avait pas une composition constante et quil était toujours mélangé de glycocholate de plomb.

Il ne put isoler de la bile de bœuf l’acide taurocholique à l’état de pureté. Il ne parvint à en établir l’existence et la formule que par une voie très indirecte.

Connaissant les produits d'hydrolyse du glycocholate alcalin il soumit à une hydrolyse barytique aqueuse les sels de plomb des deux acides et obtint avec la même résine (acide choléique) une mélange de taurine et de glycocolle. Il conclut

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donc que l’acide soufré de la bile est une combinaison d'acide choléique et de taurine.

Une seconde méthode de séparation des sels biliaires est basée sur les différences de solubilité de chacun des acides. L'acide glycocholique est relativement très peu soluble, au contraire l’acide taurocholique l’est à un très haut degré. Dans une solution aqueuse des deux sels on ajoute une solution étendue d'acide chlorhydrique ou sulfurique, l'acide glycocholique précipite en gros flocons blancs, on le lave, on le filtre et sèche. Dans la liqueur doit se trouver seul l'acide biliaire soufré.

La technique est simple mais donne des résultats très imparfaits. Il se produit en effet des phénomènes importants de dissolution et d'entraînement d’un acide par l’autre ; avec l'acide glycocholique précipité de l’acide taurocholique, et ce dernier maintient en solution une partie du premier.

Hamwarsren à proposé une dernière méthode de séparation des sels biliaires basée sur les expériences de son élève TENGSTRÔM.

TencsrrôM (1) a, en effet, effectué une longue série de travaux dans cette voie. [Il a d’abord éprouvé la méthode de STRECKER sur l’emploi des sels de plomb.

Etant donné un mélange de sels biliaires il en prend trois échantillons et les traite par l’acétate neutre de plomb, l’acétate de plomb en solution acétique, enfin par l’acétate en solution ammoniacale,

Le précipité obtenu dans les trois cas est recueilli, mis à chaud en digestion avec du carbonate de soude, On évapore, on reprend par l’alcool qui entraîne seulement [a matière organique, puis on sèche,

Le résidu sec est alors calciné en présence d'un mélange de KOH et de AzO®K pour oxyder le soufre qu’on pèse à l’état de SO‘Ba, Du poids de soufre on calcule le pourcentage en acide taurocholique.

(1) TenGsrRôm, Zeitschrif fur physiol. Chem., vol, XLI.