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tement, j'ai pu le constater. Celui-ci ne produit que des remous, et pas d’homogénéisation véritable ; 3° Enfin l'ouverture des portes de l’étuve, nécessairement fréquente, provoque des chutes de température considérable qui ne sont rattrapées qu'avec un retard notable.

Pour toutes ces raisons il a paru indispensable d'adopter un thermostat à eau. Toutes les expériences rapportées dans le présent travail ont été faites dans un thermostat du type Warburg. Cet appareil est trop connu pour qu’il soit utile de le décrire. Il suffira de préciser que le thermostat, calorifugé à l’aide d’une épaisseur de molleton, était chauffé électriquement et réglé par un thermomètre à contact sensible au 4/20 de degré. Les résistances étaient réparties en deux groupes. L’un, indépendant du régulateur, fonctionnait de façon continue. Le courant était réglé de façon que ce groupe, à lui seul, ait une puissance suffisante pour maintenir le thermostat à une température inférieure de deux degrés environ à la température voulue. Le second groupe, commandé par le régulateur, était réglé de façon que les deux groupes ensemble, en fonctionnement continu donnent une température supérieure de deux degrés à la température voulue. On arrive ainsi à réduire au minimum la puissance mise en jeu par le régulateur, et à éviter à peu près complètement les écarts de température qui pourraient provenir de l’inertie du système chauffant. La précision du réglage est alors égale à celle du régulateur lui-même : 4/20 de degré.

Sauf indication gpéciale, toutes les expériences rappor ées dans ce travail ont été faites à 370.

Choix des fioles de culture et renouvellement de l’atmosphére.

Les méthodes de mesures adoptées, et les différents dosages effectués au cours de la croissance, exigent de nombreux prélèvements ét entraînent la nécessité d’opérer avec des quantités relativement importantes de milieu : 200 cc. au minimum, lorsque l’expérience ne comporte que des mesures de densité optique, et jusqu’à 500 cc. ou 1 litre, quand ces mesures sont accompagnées de dosages. Les fioles adoptées sont des Erlenmeyer de 1 litre ou 2 litres suivant les quantités de milieu employées.

Le renouvellement suffisamment rapide de l’atmosphère au sein

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de la culture est la condition essentielle de la détermination de la croissance.

L’aération et le brassage ont été assurés de deux façons suivant les cas :

19 Soit par l’usage d’un dispositif qui agitait continuellement les fioles au sein du thermostat. (Dispositif identique à celui qui est employé pour les manomètres de Warburg).

20 Soit en faisant barbotter de l’air dans le milieu. L'air, issu d’une bombe d’air comprimé, passait à travers une grosse boule en verre remplie de coton stérile et pénétrait dans le flacon par une tubulure terminée par un barbotteur en verre poreux d’Iéna, fournissant des bulles extrêmement fines.

Dans la plupart des cas on a employé le premier dispositif, beaucoup plus facile à mettre en œuvre. Le second s’impose cependant quand les quantités de liquide sont importantes. En effet l'agitation mécanique n’est suffisante que lorsque l’épaisseur de la couche liquide dans les flacons ne dépasse pas 8 ou 10 centimètres. Lorsque le flacon est à demi ou aux trois quarts plein il faut recourir à l’aération par barbottage.

Ces précautions ont été souvent négligées. Dans la plupart des cas les recherches sur la croissance ont été faites avec les méthodes courantes de la bactériologie : cultures en tubes à essai, ou en fioles coniques placées à l’étuve et non agitées. Beaucoup d’auteurs paraissent admettre que des cultures en fioles coniques sont suffisamment aérées si l’épaisseur de la couche liquide ne dépasse pas 1 ou 2 centimètres. Or 1l n’en est rien, comme on pourra s’en convaincre par l'inspection de la figure 20. Il s’agit de deux cultures de B. coli, faites toutes deux dans des fioles coniques de 1 litre contenant 200 cc. de milieu. L’épaisseur de la couche liquide dans ces conditions est d’environ 2 centimètres. L’une des cultures était agitée, l’autre immobile, toutes deux au sein du thermostat à 370, Comme on le voit les deux cultures poussent d’abord de façon identique, après quoi la culture non agitée pousse beaucoup plus lentement, et surtout beaucoup plus irrégulièrement.

Ces irrégularités de croissance doivent être attribuées aux apports irréguliers d'oxygène qui se produisent à la faveur de l’agitation précédant chaque prélèvement. Un simple coup d'œil jeté aux figures publiées par un certain nombre d’auteurs permet de se

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rendre compte que beaucoup d’entre eux ont expérimenté dans des conditions d'aération insuffisantes, et explique beaucoup de résultats contradictoires quant à la durée ou même à l’existence de la phase exponentielle (1).

Méthodes d’ensemencement et de prélèvement.

Les mesures et les dosages en cours de croissance exigent des prélèvements fréquents et importants. Il est impossible dans ces conditions d'employer les méthodes classiques de prélèvements stériles (2). Il faudrait pour chaque mesure retirer les fioles du thermostat, ce qui provoquerait des baisses de température, les déboucher, opération aléatoire au point de vue asepsie avec des fioles à gros goulot, flamber de nombreuses fois les mêmes bouchons de coton dont il ne resterait à peu près rien à la fin de l’expérience. Enfin les contaminations ne pourraient manquer d’être fréquentes.

On a donc adopté un modèle de flacon qui permet d’opérer les prélèvements sûrement et rapidement sans avoir à retirer les cultures du thermostat. La fiole de culture est bouchée par un bouchon de caoutchouc à deux trous. Dans l’un d’entre eux plonge un tube court coudé, muni d’une grosse boule remplie de coton. Dans l’autre plonge un tube recourbé à sa partie supérieure. La branche descendante, longue de 20 centimètres environ, est étirée à la flamme. Il est commode de munir le tube à boule d’un tube en caoutchouc à embouchure en verre.

Lorsqu'il s’agit d’une culture aérée par barbottage, le flacon (3) est muni d’une troisième tubulure terminée à l’une de ses extrémités par un barbotteur en verre d’Iéna poreux, à l’autre par une boule de verre remplie de coton reliée à l’amenée d’air.

40 Stérilisation. — Pour stériliser ces appareils lorsqu'ils sont

(1) Certains auteurs sont allés jusqu’à nier l’existence de cette phase !

(2) Il a été nécessaire, pour mener à bien ce travail de déterminer les courbes de croissance de près de mille cultures. La croissance de chacune d’entre elles durait de 5 à 12 heures. L’appareillage permettait de suivre simultanément la croissance de trois cultures. Pour obtenir une interpolation précise, les mesures devaient être pratiquées toutes les vingt minutes environ. La construction de chaque courbe de croissance comportait donc la détermination de 10 à 20 points expérimentaux ou plus.

(3) Dans ce cas un ballon à fond rond et à gros goulot.

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pleins de liquide, on doit observer quelques précautions car la boule de coton offre une certaine résistance au passage de l’air, et il importe qu’à l’autoclave les différences de pression soient rapidement compensées. On stérilisera donc le tube recourbé ouvert et ne plongeant pas dans le liquide, sans quoi on retrouverait les flacons vides. Aussitôt après la stérilisation le tube est enfoncé à fond après avoir été flambé, l'embouchure est scellée à la flamme pour éviter les rentrées d’air pendant le refroidissement.

20 Ensemencement. — Après avoir brisé l’extrémité de la pipette, l'avoir séchée et stérilisée à la flamme, or aspire le contenu du tube à ensemencer. Lorsqu'il est nécessaire de pratiquer des ensemencements quantitatifs, on utilise des tubes à essai gradués « ad hoc » que l’on vide jusqu’au repère fixé.

39 Prélèvement. — Avant chaque prélèvement le tube étiré est longuement flambé. On recueille le liquide directement dans la cuve à faces parallèles servant au dosage, et celle-ci une fois pleine, on laisse le liquide redescendre dans le tube après avoir placé son embouchure dans la flamme d’un bec Bunsen. Après quoi on flambe et on sèche à nouveau la branche descendante.

Cette méthode offre des garanties de stérilité que l’on peut considérer comme absolues. Elle a été d’ailleurs éprouvée par des essais préalables avec des fioles de culture pleines de bouillon stérile. En aucun cas on n’a observé de contamination.

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