CULTURES ASSOCIÉES DE TISSUS VÉGÉTAUX ET DE PARASITES OBLIGATOIRES

L’impossibilité de cultiver #n vitro les parasites obligatoires rend difficile la tâche des pathologistes qui se consacrent à leur étude. Ils sont obligés en effet de se contenter de tirer parti des infections naturelles et, lorsqu'elles se sont manifestées, d'essayer de les propager sur des individus cultivés en serre. L’étude de ces parasites obligatoires n’est donc généralement possible que pendant la période de végétation de la plantehôte et l’on ne peut se livrer à aucune recherche vraiment rigoureuse, car il est, en outre, difficile de maintenir des plantes entières dans des conditions constantes et bien déterminées de température, d'humidité et d’éclairement. Les plantes cultivées ne sont d'autre part jamais entièrement homogènes et leurs réactions vis-à-vis de la maladie varient suivant l’âge et les individus. Enfin, il est très délicat de cultiver une plante entière dans des conditions d’aseptie rigoureuse et, si ces conditions ne peuvent être obtenues, on n’est pas assuré d’être à l’abri de contaminations accidentelles. Cet inconvénient est particulièrement grave lorsqu'on étudie les virus, car le mélange de plusieurs souches provoque souvent chez la plante des symptômes très différents de ceux obtenus pour un seul agent pathogène, De plus, si les deux virus possèdent des propriétés voisines, il devient presque impossible de les séparer et de les isoler à nouveau. Afin d’éviter les difficultés rencontrées en expérimentant sur des plantes entières, on a essayé de cultiver les parasites obligatoires sur des feuilles détachées et conservées au laboratoire sur des solutions minérales additionnées de sucre (83). Ces organes ne peuvent ni proliférer, ni se multiplier et ne peuvent donc survivre que pendant quelques mois. Cette méthode rudimentaire a toutefois permis à un grand nombre d’expérimentateurs de cultiver au laboratoire des Péronosporacées, des Urédinées et même des virus. Grâce à elle, on a étudié la résistance variétale des plantes parasitées et l’immunité acquise. On a précisé l’eflet des vitamines et de la nutrition hydrocarbonée sur l’infection ; on a également analysé l’hétérothallisme éventuel des champignons parasites, leur reproduction et leur action sur la physiologie de l’hôte.

Mais les imperfections dont nous venons de parler ont limité cependant l’utilisation de cette méthode; c’est pourquoi nous avons cherché à perfectionner la culture de ces parasites obligatoires en les faisant croître non plus sur des plantes entières, ou des organes détachés, mais sur des cultures de tissus de l'hôte qu'ils parasitent normalement. Les premières cultures associées que nous ayions réalisées sont celles du Mildiou de la Vigne (48). Nous avons ensuite étudié de la même manière l’Oïdium de la Vigne, et nous avons tenté d'utiliser cette méthode pour cultiver diverses Urédinées : Kuehneola albida (Kuux.) Macx. et Phagmidium wolaceum (Scaurz), parasites des Ronces, Gymnosporangium clavariaeforme (Jaco.) Rees., qui attaque l’Aubépine, Puccinia Malvacearum Monr. qui se développe sur les Malvacées. Nous avons enfin réalisé la culture de divers virus, virus de la Mosaïque du Tabac, virus X et virus Y de la Pomme de terre.

À. Culture du Mildiou de la Vigne.

Nous examinerons successivement les caractères généraux du Mildiou de la Vigne, puis l'isolement aseptique du champignon, l'infection des cultures, leur repiquage, leur structure anatomique et le développement du parasite sur les tissus de diverses espèces et enfin nos tentatives de cultures sur des milieux inertes.

L. CaracrÈres GÉNÉRAUX DU PLASMO PARA VITICOLA (Berk. et Curr.) Bec. et pe Ton. — Nous décrirons les caractères généraux du Mildiou en insistant sur ceux dont la connaissance est utile pour la mise au point de la culture #n vitro. Le Plasmopara viticola est un champignon oomycète de la femille des Péronosporacées. Il possède un mycélium non cloisonné, très ramifié, qui se développe entre les cellules des parenchymes. Il perfore les cloisons cellulaires à l’aide de diverticules spéciaux ou suçoirs qui pénètrent à l’intérieur des cellules où ils puisent des matières nutritives. Lorsque le mycélium a accumulé suffisamment de produits de réserve et que les conditions atmosphériques sont favorables, il émet à l'extérieur des tissus contaminés, des organes de dissémination qui se présentent sous la forme d’arbuscules ramifiés appelés sporangiophores ; ceux-ci forment à l’extrémité de leurs ramules des sporanges ovoïdes. Ces sporanges se détachent très facilement et sont susceptibles de germer au contact de l’eau en produisant chacun plusieurs zoospores. D’après Ravaz (62) cette opération demande une heure un quart à la température de 15°. Chaque zoospore est munie de deux flagelles qui lui permet de se mouvoir dans l’eau. Elles nagent quelque temps puis se fixent, perdent leurs flagelles et germent en donnant naissance à un tube germinatif. Si la gouttelette d’eau au sein de laquelle les zoospores ont été libérées est sur un organe non aoûté (feuille, Jeune sarment, grain de raisin avant la veraison) le tube germinatif pénètre dans les tissus qu’il gagne à la faveur de l’orifice d’un stomate, etle mycélium intercellulaire se développe d’abord sans manifester sa présence par des lésions visibles. On donne le nom d’incubation. à cette période de développement invisible dont la durée varie de cinq à vingt-six jours suivant la température et l’âge des organes atteints (62). La fin de l’incubation est marquée par l'apparition d’un feutrage de sporangiophores sur les organes atteints : à condition toutefois que l’état hygrométrique soit assez élevé. Lorsque l’air est trop sec, le mycelium ne produit pas de sporangiophores mais évolue entièrement à l’intérieur des tissus. Sur les feuilles, il manifeste sa présence par un jaunissement de la partie envahie qui devient en outre translucide. On donne à ces parties contaminées le nom de «taches d'huile» en raison de leur aspect graisseux.

Ce mode de propagation de la maladie par sporanges ne s’observe que pendant la belle saison. En automne, lorsque les conditions sont devenues défavorables, des organes sexués apparaissent. [l se forme des oospores qui demeurent en repos pendant tout l'hiver dans les feuilles mortes. Au printemps suivant, ces oospores germent pour donner chacune un sporange spécial beaucoup plus volumineux que les sporanges d’été auxquels on donne improprement le nom de macroconidie. Au contact de l’eau, chaque sporange libère des zoospores, qui propagent la maladie par simple voie asexuée

IT. Isozemenr aseprique pu Caamprenon. — La première condition à réaliser pour obtenir des cultures de Mildiou est l'isolement aseptique du champignon. Pour y parvenir voici comment nous opérons. On détache des feuilles de Vigne attaquées présentant les lésions caractéristiques du type «tache d’huile» et on les stérilise de la manière sui-

vante : on les plonge très rapidement dans de l’alcool à 95°, puis on les immerge durant dix minutes dans une solution à 70 gr. par litre d’hypochlorite de calcium à 200° chlorométrique ; les feuilles sont ensuite rincées à l’eau stérile’et placées dans des boîtes de Petri également stérilisées entre deux feuilles de papier filtre mouillé. Après un séjour de vingt-quatre heures à l’étuve à 20°, les «taches d'huile» se recouvrent d’un épais feutrage de sporangiophores sur lesquels on peut aisément prélever aseptiquement des sporanges.

Cette méthode n’est pas toujours applicable car le phénomène des «taches d'huile», qui permet à coup sûr de reconnaître une invasion sur le point de fournir des sporanges, n’est pas très fréquent. Nous avons donc dans certains cas dû nous servir de feuilles portant de jeunes sporangiophores. Ces feuilles sont stérilisées par la méthode précédente, puis placées à l’étuve dans les mêmes conditions. Ce traitement détruit les sporanges, mais le mycélium interne en reforme s’il n’est pas trop âgé. De telles feuilles sont plus difficiles à stériliser et fournissent moins de sporanges. C’est pourquoi il faut leur préférer des feuilles portant des «taches d'huile».

Signalons enfin que nous avons pu, à plusieurs reprises, isoler le Mildiou à partir de rameaux attaqués en les stérilisant à l’hypochlorite et en les repiquant après les avoir épluchés, sur des milieux gélosés préparés pour la culture des tissus de Vigne; huit à dix jours après l’ensemencement, ces tronçons desarments se sont couverts de sporangiophores.

IIL. Inocuzarion pes cuzrures. — Pour réaliser la contamination des cultures de tissus, nous avons tout d’abord découpé des parties de feuille couvertes de sporanges en petits fragments que nous portions sur les tissus. L'expérience nous a montré que cette technique était mauvaise, car ces fragments de feuilles, étant très sensibles au parasite, mouraient très vite si bien que l'infection réussissait rarement. D'autre part, quelles que soient les précautions que l’on prend pour stériliser ces organes, on n’est jamais certain de leur asepsie. Nous avons alors cherché à réaliser l’infection à partir des sporanges eux-mêmes ; pour cela, on pouvait opérer de deux façons : on pouvait, soit séparer les sporanges des feuilles, les laisser pendant une heure et demie dans de l’eau stérile pour qu'ils libèrent leurs zoospores, et placer ensuite une goutte de cette eau chargée de zoospores au contact des tissus, ou bien placer d’abord une goutte d’eau sur les tissus et y porter ensuite quelques sporanges. Nous avons utilisé comparativement les deux méthodes.

Pour détacher les sporanges de la feuille, nous utilisons une pipette Pasteur très effilée et cassée à son extrémité afin que ses bords soient tranchants. Nous déposons un peu d’eau stérile sur une partie de feuille garnie de sporanges, et nous promenons lentement le bord coupant de la pipette à la surface de la feuille, afin d'en détacher ces organes. I ne reste plus qu’à aspirer la goutte d’eau chargée de sporanges et à la faire couler dans un tube à essais stérile. On parvient aisément de cette façon à obtenir des suspensions qui renferment plus de 250.000 sporanges au centimètre cube. Une heure et demie plus tard, lorsque les sporanges ont libéré les zoospores, on fait tomber à l’aide d'une autre pipette très efhilée une goutte de cette suspension à la surface d’une culture de tissus de Vigne; pour éviter que cette goutte ne roule sur la surface du tissu sous l’effet de la tension superficielle et ne se détache, il est souvent utile de préparer avec un scalpel une petite encoche à la surface des tissus. On réalise ces opérations sans retirer la colonie tissulaire du tube où elle s’est développée afin d'éviter les contaminations accidentelles.

Cette méthode, très simple, ne donne de bons résultats que lorsque les feuilles de

PI EXVE

J. Vincent, phot.

Fic. A. — Aspect d’un cal de Vigne envahi par le Plasmopara viticola. Les bouquets de sporanges apparaissent comme de fines granulations blanches recouvrant tout le fragment de tissu.

J. Vincewr, phot.

Fic. B. — Mildiou se développant sur une racine de Vigne.

ni ), Annazes pes ÉPIPHYTiEs. Page 80.