PL-XVE

J. Vincenr, phot.

Fic. A. — Mildiou se développant sur une culture de tissus de Vigne.

Les amas incolores que l’on distingue en surface sont les sporanges du champignon.

J. Vincenr, phot.

Fi6. B. — Crown Gall provoqué sur une racine de Hyoscyamus niger par l’inoculation de Phytomonas tumefaciens.

Page 81.

Vigne ont été stérilisées de façon parfaite. Une seule feuille mal désinfectée suffit pour contaminer toutes les cultures. C’est pourquoi nous préférons une autre méthode consistant à déposer une goutte d’eau stérile à la surface de chaque culture et à y transporter quelques sporanges prélevées directement sur une feuille de Vigne. Dans les deux cas, après avoir bouché le tube de culture avec un tampon de coton, il convient de l’obturer avec une feuille de papier d’étain afin que l’atmosphère demeure saturée de vapeur d’eau.

Les zoospores nagent pendant quelque temps dans la goutte d’eau, puis se fixent à la surface de l’explantat et émettent un tube germinatif qui pénètre aisément à l’intérieur. Comme dans le cas d'infections naturelles de feuilles, le parasite manifeste sa présence après une certaine période d'incubation par l'émission de sporanges, mais tandis que dans le cas d’inoculation de feuilles entières la durée d’incubation de la maladie paraît uniquement réglée par la température et durant tout l’été ne dure guère plus de cinq à six jours, elle est beaucoup plus lente et moins régulière lorsqu'on infecte des cals primitifs formés in vitro sur des tronçons de tige. Les premiers sporanges n’apparaissent jamais avant une dizaine de jours et il arrive que l'infection demeure latente à l’intérieur de certaines cultures pendant plus d’un mois, sans que l’on puisse déceler la cause de ce retard. Les variations de température ne peuvent être invoquées en ce cas, puisque les cultures sont maintenues à température constante.

IV. Invasron pes cuLTURES ET MODE DE pÉveLoPPEMENT Du Miznrou. — Nous avons étudié le mode de développement du Mildiou sur les tissus cultivés in vitro.

Le développement des sporangiophores débute toujours au point d’infection, c’est-àdire à l'emplacement où avait été déposée la goutte d’eau chargée de zoospores ; toutefois l'infection ne demeure pas localisée à cet endroit, mais elle s’étend peu à peu à toute la surface des tissus (pl. XV, fig. A). Cette progression est très lente et il faut environ un mois à un mois et demi pour qu’elle soit complète sur un cal primitif produit par un fragment de tige; les tissus préexistants du sarment sont également attaqués, ainsi que les racines lorsqu'il s’en est formé (pl. XV, fig. B).

Lorsqu'on inocule de cette façon des colonies anciennes ayant déjà été repiquées plusieurs fois, la période d’incubation est encore plus longue et plus irrégulière. Ces colonies sont d’ailleurs moins sensibles au Mildiou que les cals primitifs. Cette résistance se manifeste tout d’abord par une plus grande difficulté d'infection. En effet, la proportion des cultures infectées est toujours plus élevée lorsque l’on effectue cette opération sur des cals primitifs (60 à 75 p. 100) que si on inocule des cultures provenant d’une souche ancienne (30 à 40 p. 100). En outre, sur ces dernières, le feutrage des sporangiophores est moins dense (pl. XVI, fig. À) et l'examen microscopique révèle que ces organes sont moins grands et moins ramifiés. Enfin, les colonies repiquées résistent mieux au parasite que les tissus des cals primitifs qui sont entièrement tués par le parasite au bout d’un mois et demi environ; ceux de cultures ayant subi plusieurs repiquages demeurent vivants très longtemps. Les tissus ayant subi le phénomène d’accoutumance à l’hétéroauxine sont attaqués de la même manière que les tissus normaux.

Si on pratique une coupe dans un cal envahi par le Mildiou (fig. 29), on constate la présence d’un mycélium formé de filaments épais de 8 à 10 y, très réfringents et très ramifiés qui s’insinuent entre les cellules parenchymateuses en progressant à travers les méats. Ce mycélium produit de nombreux suçoirs irrégulièrement disposés qui perforent les parois cellulaires. Ces suçoirs ont la forme de renflement sphériques ou

piriformes qui font saillie au travers de la paroi de la cellule. Ils sont absolument comparables à ceux que forme le champignon à l’intérieur des organes normaux de la Vigne. La colonie n’étant pas limitée par une cuticule, le mycélium petihémense des hyphes qui se répandent à l’extérieur. Ces hyphes se développent à Par libre dans l'atmosphère saturée du tube et peuvent atteindre une longueur de 500 y», mais il ne s’en forme jamais à l'intérieur du milieu de culture. Ces formations sont spéciales aux cultures, on ne les observe jamais sur les plantes’ entières.

Les sporangiophores naissent exclusivement sur le mycélium interne et, en aucun cas,

[l / ù } ne \ l HS \ | Fie. 29. — Coupe d’une culture de tissus de Vitis vinifera attaquée par le Plasmopara viticola.

le mycélium aérien n’en produit. [ls sortent par groupe de 3 ou 4 en s’insinuant entre les cellules et viennent s'épanouir à l'air libre. Leurs formes et leurs dimensions sont assez variables. Ceux produits par des cultures réalisées sur des cals primitifs peuvent atteindre 1.000 de long et sont très ramifiés, tandis que ceux qui apparaissent sur des cultures ayant subi plusieurs repiquages ne dépassent pas 250 L et sont peu ramifés.

Nous n’avons jamais observé en culture la formation d’organes sexuels ni d’oospores.

V. Reprquace pq Mrcorou. — Nous avons vu que, après une période d’un mois et demi, : quand le parasite a gagné toute la culture, les tissus ne tardent pas à mourir. Pour maintenir le champignon vivant, il faut alors le repiquer. Pour cela, nous procédons de

la manière suivante : on dépose, à ide d’une pipette Pasteur très effilée, une goutte d’eau stérile à la surface de chacune des colonies destinées à recevoir le parasite, puis on extrait de son tube un fragment de tissu attaqué et on le place dans une boîte de Petri; en se servant d’un scalpel, on détache alors de la surface de ce dernier de minces lamelles de tissus recouverts de conidiophores. Ces lamelles sont réduites en petits fragments d’un millimètre de côté que l’on transporte avec des pinces dans la goutte d’eau déposée à ia surface de la culture vierge. Cette façon d'opérer, légèrement différente de celle que nous utilisons pour le prélèvement initial du parasite, donne des résultats plus réguliers, car le fragment découpé demeure vivant pendant un certain temps et le mycelium qu’il renferme continue à produire de nouveaux sporanges pendant plusieurs jours. Nous avons pu, de cette façon, entretenir pendant trois ans des cultures associées de Plasmopara et de tissus de Vigne.

Il est possible de repiquer directement des tissus provenant d’une souche ancienne et parasités par le Mildiou. Nous avons signalé que, dans ce cas, le parasite se développe très lentement et ne les tue pas immédiatement, si bien qu’ils continuent à proliférer.

Toutefois, leur croissance est très ralentie et ils finissent généralement par périr après deux passages.

VI. DévecopPement ou Micprov sur LES Tissus DE nirrérenres espèces pe Vienes. — Aucune espèce de Vigne n’est normalement à l’abri du Mildiou. Ce parasite peut être rencontré même sur des Vignes-vierges telles que les Parthenocissus tricuspidata et quinquefoha (62). Cependant, ces dernières, ainsi que certaines espèces de Vigne, comme Vis riparia et Vitis rupestris, ne sont que rarement atteintes et le Plasmopara ne leur cause que des dégâts minimes qui consistent en des taches foliaires rares et peu étendues. D’autres, telles que V. Berlanderi ou V. labrusca, bien que portant sur leur feuillage des altérations plus étendues subissent, elles aussi, peu de dommage. Enfin, d’autres espèces comme VW. arizonica sont aussi sensibles que V. vinifera.

Dans le but de rechercher si cette immunité relative se manifeste ên witro, nous avons réalisé des cultures de tissus de diverses espèces et variétés de Vitis et de Parthenocissus, et nous avons essayé d’obtenir leur infection par le Müdiou.

La première souche de tissus de Vitis vimifera que nous avons isolée appartient à la variété « Aramon ». C’est sur cette souche que nous avons réalisé la plupart des expériences que nous venons de décrire. Nous avons ensuite réalisé des cultures de deux cépages de la même espèce : « Chasselas de Fontainebleau » et « Carignan ». Le développement du Mildiou sur ces deux variétés a été comparable à celui observé sur l’« Aramon ».

Parmi les tissus d'espèces exotiques, ce sont ceux de Vitis arizomica qui se sont montrés les plus sensibles au Mildiou. L’infection s’y est propagée de la même manière que sur les tissus de Vitis vinifera. Nous avons également pu obtenir des cultures de Mildiou sur les tissus de Vins Dauidu, et sur ceux de la variété « Noah » que l’on suppose être un hybride de V. riparia et V. labrusca.

Lorsqu'on essaye d’inoculer le Mildiou à des cals de V. David en déposant à la surface de ceux-ci un bouquet de sporangiophores dans une goutte d’eau, on constate que la proportion de culture infectée est très faible (15 à 20 p. 100). En outre, le parasite ne paraît pas gagner l’ensemble du cal comme cela se produit chez les Vignes européennes, mais demeure limité au voisinage du point d'infection. Enfin, les coni- * diophores ne forment pas un feutrage dense et serré mais se présentent sous forme de petits groupes isolés les uns des autres. Enfn, les tissus parasités réagissent en élaborant une grande quantité d’anthocyane.

La variété « Noah » paraît plus résistante encore. I est très difficile d'obtenir le développement du Plasmopara sur ses tissus. Lorsqu'on y parvient, le champignon manifeste sa présence par quelques rares bouquets de sporangiophores localisés dans la région qui avait subi le contact direct des zoosporanges inoculés. Ces sporangiophores sont toujours beaucoup plus petits et moins ramifiés que ceux que l’on observe sur les tissus des cépages européens.

Signalons enfin qu'il nous a été impossible d’inoculer le Mildiou aux tissus des autres espèces de Vigne que nous avons étudiées : Vitis vulpina, V. rupestnis, V. riparia, V. Corgnetiae, ainsi qu'aux Parthenocissus tricuspidata et quinquefoha. Ces différentes espèces sont cependant parfois attaquées dans les conditions normales.

Ces expériences paraissent montrer qu’il y a une relation entre la sensibilité naturelle et celle des tissus cultivés èn vitro, car les tissus les plus faciles à inoculer in vitro sont ceux des espèces les plus facilement attaquées dans la nature. Toutefois elles indiquent que les tissus peu différenciés que l’on cultive in vitro constituent un milieu beaucoup moins favorable pour le Mildiou que le parenchyme des feuilles où il se développe ordinairement.

VIT. TenTaATIVES DE CULTURES SUR DES MILIEUX INERTES. — On peut se demander s’il est possible de fournir au Mildiou sous forme d’un milieu inerte les substances nutritives qu'il puise dans les cellules de la Vigne par l’intermédiaire des suçoirs. Dans le but de tenter de résoudre cette question, nous avons essayé de cultiver le champignon dans divers substrats naturels ou artificiels.

1° Milieux naturels. — Les premiers milieux que nous avons essayés étaient préparés de la manière suivante : des feuilles et des jeunes sarments d’un cépage sensible à la maladie comme l’« Aramon » étaient finement hachés et la bouillie ainsi obtenue était filtrée sur une étamine ; le jus trouble était alors clarifié par centrifugation et stérilisé au moyen de filtre du Kitasato. Ce jus stérile était soit dilué de moitié, par une solution stérile de gélose à 1,5 p. 100, refroidie vers 40°, soit mélangé aseptiquement avec le résidu de broyage des feuilles au préalable stérilisé à l’autoclave. Ces milieux se sont révélés impropres à la culture du champignon. Nous n’avons jamais observé la moindre prolifération.

Nous avons alors supposé qu'au.cours du broyage des feuilles certaines substances nécessaires à la naissance du Plasmopara pouvaient s’altérer et se détruire et nous avons cherché à tuer les tissus de Vigne d’une manière moins brutale en employant soit la chaleur modérée, soit l’asphyxie. La première méthode a été mise en œuvre en plaçant des colonies tissulaires pendant vingt-quatre heures dans une étuve réglée à 50°. Toutes les cultures ainsi traitées ont rapidement changé d'aspect. Elles ont bruni et ont produit une substance noirâtre qui a diffusé dans la gélose. Nous les avons inoculées immédiatement après le traitement, avant que leur aspect commence à se modifier, à l’aide de fragments d’une culture portant des sporanges, mais, en aucun cas, le parasite ne s’est développé.

Dans une autre série d'expériences, nous avons tué les tissus par asphyxie, en scellant au chalumeau des tubes contenant des colonies de tissus de Vigne. Celles-ci sont demeurées en atmosphère confinée pendant un an. Les tissus ne paraissaient pas sensiblement altérés. Cependant, ils étaient devenus incapables de proliférer à nouveau, car, repiqués sur un milieu neuf, ils n’ont pas tardé à brunir au contact de l'air. Nous avons inoculé

des fragments de tissus portant des conidiophores à ces cultures, mais nous n’avons observé aucun développement.

2° Milieux synthétiques. — Imaginant alors que les cellules mortes produisaient une substance toxique pour le champignon, nous avons tenté sa culture en milieu synthétique. Pour cela, nous avons utilisé les solutions nutritives employées par Scnoprer (66) et par Kôez (36) 0), au cours de leurs recherches de l’action des vitamines sur les champignons; nous avons ajouté à ces solutions diverses substances de croissance qui ont été reconnues nécessaires au développement de certains microorganismes. Nous avons ainsi incorporé à ces solutions de l’aneurine à la concentration de 10-?, de l'acide nicotinique à 10-56, de la pyridoxine à 10-7, de la biotine à 10-8, de l'acide d-pantothénique à 1076, du meso-inositol à 10-4 et de l’adénine à 107, En outre, d’autres milieux nutritifs ont reçu divers aminoacides : glycocolle, cystéine, tryptophane, G-alanine, acide glutamique, à la concentration de 105.

Ces solutions étaient solidifiées par l’adjonction de 1,2 p. 100 de gélose et stérilisées à l’autoclave à 110° pendant vingt minutes. Nous ensemencions ensuite en surface de petits fragments de cultures encore vivantes et recouvertes de sporanges de Mildiou. Mais, dans aucun cas, nous n’avons pu observer le développement du parasite sur ces milieux synthétiques.

B. Culture de l'Oïdium de la Vigne.

TL. Caracrères Généraux DE L'Oinium. — L’Oïdium de la Vigne : Uncinula necator (Scuw). Burr., appartient à la famille des Erysiphacées dont toutes les espèces sont des parasites obligatoires des végétaux supérieurs. L’Uncinula necator se développe sur toutes les espèces Witis et sur quelques Parthenocissus. Son mycélium ne pénètre pas à l’intérieur des tissus comme celui du Mildiou, mais il est en grande partie aérien et forme un léger feutrage incolore à la surface des organes. Il envoie à l’intérieur des cellules épidermiques des suçoirs globuleux ou ovoïdes à l’aide desquels il puise les substances nécessaires à son développement. IL produit également des hyphes perpendiculaires à la surface des organes; ces hyphes composées de plusieurs cellules sont en réalité des conidiophores dont les cellules extrêmes s’élargissent peu à peu et se transforment en conidies qui se détachent facilement et disséminent ainsi la maladie. Ces conidies peuvent germer sur les organes de la Vigne en atmosphère très humide et propagent le champignon par voie végétative. Le parasite hiberne sous forme mycélienne dans les bourgeons de la Vigne et peut ainsi s’y maintenir indéfiniment sans former de périthèces. Les conidies germent rapidement dans l’eau quand la température est voisine de 20°. Il suffit d’en placer quelques-unes entre lame et lamelle pour constater, en examinant la préparation après quatre ou cinq heures, que la plupart ont déjà émis un filament germinatif. Ce filament doit produire très tôt des suçoirs car, en conservant en chambre humide des préparations

Q) Solution nutritive de ScHOrFER :

OR ER RS D TR TS TN MR slorape Pain seat te fe eee À de nn De 0 1.000 cm° CRAILO SO RE Te NN dt Re SES ste mers ta ee ren ee ES a lere date eee ne ere 1er: Asparagine enclos eee de ee eue useee eee. Pers SOMSNO PR ce mere ere Ti COCO Ne A nc) 0,5 gr. DR a PR PR SE RER ER CE I a 1,5 gr.

@) Solution de Kocz

TD) ue acte D SR A 00 AC OO TN Oro en IE AE AE SOS M I IC 1.000 cm° Partrate dAMMONION PA Er ee TA Ne ie tele rate ie os eo aire ia ne Ua sert a etait ie 5 gr NON NT Re A nina UT tn ame ie see Pomme ee craie ue ne D eyarere 28 are ego s 1 gi D'OR HAN PR PEN AR ERA LR AR QAR e EL CS RE Re dass que Scoue vhage 1 g SOPMPATRE O E NT n C RER E E RER ENT CE ROMe enre eanee nee rselie 0,5 gr NA CR ee ie lai less e helats lala ie duo Mie. je rotes fau SGqnreiete vue Or

. L L h 0 U 9 «| l À de conidies dans l'eau, on constate qu'après vingt-quatre heures il s'est déjà formé sur le tube germinatif des appressoria analogues à ceux d’où naissent les suçoirs.

2. ISOLEMENT ASEPTIQUE ET INOCULATION DU CHAMPIGNON AUX CULTURES DE TISSUS. — Étant donné que le mycélium de l’Oïdium se développe à l'extérieur des tissus, on doit donc se contenter de prélever directement les conidies sur de jeunes taches venant d’apparaître sur des feuilles sans les stériliser au préalable. Pour cela, on opère le prélèvement d’une manière analogue à celle utilisée pour le Mildiou en se servant d’une pipette Pasteur très effilée, et cassée irrégulièrement, afin que ses bords soient tranchants; il suffit d’'humecter cette pipette en la trempant dans l’eau stérile et de la passer légèrement à la surface de la région contaminée pour détacher de nombreuses conidies qui viennent se coller contre ses parois. On passe ensuite la pipette ainsi chargée de conidies sur une goutte d’eau préalablement déposée à la surface d’une culture de tissus de Vigne. Étant

Fi. 30. — Coupe d’une culture de tissus de Vitis vinifera attaquée par Uncinula necator.

donné que les conidies de l’Oidium germent aisément dans l'air humide, il n’est pas nécessaire, en principe, que les conidies flottent dans l’eau comme c’est le cas pour les sporanges de Mildiou. Néanmoins, nous avons obtenu de meilleurs résultats en mouillant au préalable la surface des tissus. Cette méthode qui consiste à prélever directement des spores sur des feuilles non désinfectées introduit fréquemment des germes de champienons et de bactéries banales qui pullulent à la surface de la feuille. I faut done faire un très grand nombre d’inoculations pour en obtenir qui ne soient pas contaminées.

3. DéveLopPEMENT pu cHamprexon. — Bien que les conidies germent en quelques heures dans l’eau à 20°, le mycélium n'apparaît pas sur les cultures inoculées avant une dizaine de jours ; il forme tout d’abord un feutrage très discret qui s’épaissit peu à peu et gagne en quelques semaines tout le cal. Les tissus s’altèrent rapidement et l’on observe une nécrose d’abord superficielle, puis, au bout de quarante-cinq à soixante Jours, cette altération s’étend à toute la masse de la colonie.

Si on examine une coupe pratiquée dans des tissus attaqués (fig. 30) ‘on constate que le parenchyme est recouvert d’un lacis formé d’hyphes qui s’entrecroisent; sur ce mycélium, naissent de nombreux conidiophores courts et composés de 3 à 4 cellules,

dont l'extrémité s "élargit pour former les conidies ; le mycélium émet enfin des suçoirs qui s’enfoncent uniquement dans la rangée la plus externe des cellules de la colonie.

4. Repiquaces. — Lorsque les tissus commencent à se nécroser sous l'influence du parasite, c’est-à-dire deux mois après l’inoculation, 1l convient de procéder au repiquage des cultures. Pour cela, nous utilisons la même Note que pour le Midiou de la Vigne, c’est-à-dire qu'après avoir placé les tissus infectés dans une boîte de Petri stérile, nous isolons de sa surface de minces fragments d'environ 1 millimètre de côté. Ces fragments sont ensuite déposés à la surface de tissus fraîchement repiqués et préalablement humectés d’eau stérile : la face recouverte par le mycélium doit être en contact avec la colonie. Le résultat de ces repiquages est assez irrégulier. Parfois, les inoculations sont presque toutes réussies, mais d’autres fois, au contraire, l'infection n’est obtenue que dans une faible proportion, sans que l’on puisse déterminer la raison des échecs. En suivant le développement du champignon, nous avons remarqué qu’une humidité excessive nuit à sa prolifération. Ceci nous a conduit à nous abstenir de capuchonner les tubes avec du papier d’étain, qui entretient un état hygrométrique trop élevé. Mais cette absence de capuchonnage présente un inconvénient, car les tissus de Vigne s’accroissent assez peu, en raison du faible état hygrométrique de l’atmosphère, tandis que le parasite se développe plus rapidement, ce qui réduit la durée de la vie des cultures et oblige à des repiquages plus fréquents.

GC. Tentatives de cultures d'Urédinées.

Les Urédinées forment un immense groupe de champignons étroitement adaptés à la vie parasitaire; aucun d’eux n’est susceptible de mener une vie saprophytique. Ils présentent en outre une spécificité très étroite; chacun d’eux n’infecte, en effet, qu'un petit nombre d’hôtes appartenant à un seul genre ou même à une seule espèce. Quelquesunes cependant peuvent infecter les plantes d’une famille entière. De nombreuses Urédinées sont hétéroïques, c’est-à-dire que leur gamétophyte et leur sporophyte évoluent sur deux espèces distinctes dont la position systématique peut être très éloignée. On conçoit donc que leur culture présente un très grand intérêt, c'est pourquoi nous nous sommes efforcé d'obtenir leur développement in vitro. Nous avons pensé que ce problème serait facilité en s'adressant à des espèces d’Urédinées susceptibles d’envahir très largement leurs hôtes et pouvant se développer non seulement sur des feuilles, mais encore sur d’autres organes tels que les tiges, les pétioles ou les pédoncules floraux; ces réflexions nous ont conduit à choisir le Kuehneola albida qui se développe surtout sur les tiges des Ronces, le Puccinia antirrhini qui attaque non seulement les feuilles, mais aussi les tiges, les pédoncules floraux, les sépales et même les carpelles du Muflier, le Gymnosporangium clavariaeforme et qui, sur l’Aubépine, apparaît à la fois sur les feuilles, les tiges, le calice et même le fruit et le Gymnosporangium Sabinae qui parasite ces mêmes organes chez le Poirier.

Enfin, nous avons également réalisé quelques tentatives avec le Puccinia Malvacearum qui possède une faible spécificité et peut infecter la plupart des Malvacées.

I. Essais pe cucrure De Kuehneola albida (Kuux) Mac. — 1. Caractères du développement. — Kuehneola albida estune Phragmidiée répandue dans le monde entier et qui parasite diverses espèces de Ronces. Dans notre pays, les premières taches d’urédospores apparaissent en automne à la face supérieure des feuilles ou sur les rameaux. Pendant l'hiver, l'infection demeure latente; au printemps, de nouvelles taches d’ urédospores

provenant d'infections anciennes se montrent sur les tiges de l’année précédente et les téleutospores commencent alors à se former. Les stromas d’urédospores de printemps s'étendent longuement sur les rameaux; d’abord sous-épidermiques, ils font peu à peu craquer l'écorce, qui se fend longitudinalement sur une longueur de plusieurs centimètres.

2. Prélivement du champignon et inoculation des cultures. — Nous avons réalisé une première tentative au printemps en nous adressant à des tiges qui présentaient de jeunes sores d’urédospores encore recouvertes par l’épiderme. Nous les désinfections soigneusement, en les trempant quelques secondes dans l'alcool, puis en les immergeant pendant une demi-heure dans une solution d’hypochlorite de calcium à 70 grammes par litre. Nous fendions alors l’épiderme longitudinalement ét les urédospores sortaient spontanément; puis avec une pipette Pasteur très effilée et humectée, nous prélevions quelques-unes de ces urédospores que nous transportions enfin dans une goutte d’eau stérile déposée à la surface de cultures de tissus de Ronce.

Cette méthode ne nous a pas fourni de résultats satisfaisants, car le champignon ne s’est pas développé.

Nous avons alors effectué un nouvel essai en nous servant d’urédospores provenant de sores qui s'étaient développés sur des feuilles en automne. Ces stromas ne sont pas étendus comme ceux qui se forment sur les tiges au printemps, mais limités à de très petites pustules ; d'autre part, l’épiderme des feuilles est très mince et recouvert de poils, si bien qu'il est impossible de stériiiser la feuille avant leur déhiscence. Nous avons donc été obligé de faire le prélèvement en passant une pipette Pasteur mouillée sur des Jeunes taches venant de s’ouvrir. Dans ces conditions, nous prélevions en même temps les spores d’autres champignons ainsi que des bactéries contaminant l’épiderme, ce qui nous obligea à multiplier des prélèvements pour en obtenir un certain nombre qui soient aseptiques. Ces essais d'automne n’ont pas fourni de résultats meilleurs que ceux du printemps.

Nous avons alors tenté de préciser les causes de cet échec en étudiant les conditions de la germination des urédospores de Kuehneola albida. Pour cela des spores ont été placées dans une goutte d’eau distillée en cellule de Van Tieghem. Nous n’avons constaté aucune germination. L’adjonction de glucose aux concentrations de 1, 2 et 5 p. 100 n’a pas amélioré ce résultat. Cette tentative infructueuse nous a amené à penser que la germination des urédospores ne doit se produire que sous l’action de substances de croissance spéciales. Wiccoxo (82) a montré, en effet, que les spores de nombreux champignons germent très mal dans l’eau pure, mais que leur développement se produit normalement dès qu’on l’additionne de traces d'extraits végétaux très variés, tels que des jus de tubercules de pomme de terre, de Dahlia, de Glaïeul ou d'Orange. Le jus d'Orange paraît être particulièrement actif et il a été incorporé par Me Cazan (45) aux suspensions de spores utilisées pour l'étude des produits anticryptogamiques. Cet auteur conseille d'utiliser le jus d'orange filtré à la concentration de 1/100°. Ces résultats nous ont suggéré de réaliser de nouveaux essais en nous servant de milieux analogues à ceux imaginés par Mc Cazzaw. Pour cela nous avons stérilisé du jus d'orange par filtration sur bougie et nous l'avons ajouté dans la proportion de 1 p. 100 à de l’eau stérile que nous déposions sur les tissus avant d’y mettre les spores.

Les résultats furent également négatifs; d’ailleurs des essais de germination réalisés en cellule de Van Tieghem au moyen de cette solution ne nous ont pas non plus donné

de résultats. Nous pensons donc qu’il est vain d'essayer d'obtenir des cultures de Kuehneola par ce procédé tant qu’on sera incapable d’en faire germer régulièrement les spores.

Nous avons également essayé d’inoculer de la même manière une autre urédinée, le Phragmidium Rubi à des cultures de tissus de ronce en prélevant des urédospores sur de jeunes taches et en les déposant dans une goutte d’eau déposée à la surface des tissus. Nous ne sommes pas non plus parvenus à obtenir d'infection.

IL. Essais pe cuzrure ne Puccinia Antirrhini (Dier.) Hozw.— 1. Caractères généraux du développement. — La Rouille du Muflier est un parasite qui, en raison de son intérêt horticole, a été beaucoup mieux étudié que Kuehneola albida. Ses urédospores forment de petites pustules qui apparaissent durant tout l’été sur les feuilles. Elles sont localisées surtout à leur face inférieure; il s’en forme également sur les pétioles, les tiges et même sur le calice et la capsule du fruit, ce qui montre que presque tous les organes aériens peuvent être atteints par le champignon. Durant toute la belle saison, la maladie se transmet par les urédospores avec la plus grande facilité. Leur germination peut être obtenue facilement. Mc Cazran (44) et Aronescu-Savuzescu (1) ont montré qu’elle se produit en deux ou trois heures entre 5 et 20°. Ces auteurs ont pu réaliser très aisément des inoculations artificielles en pulvérisant une suspension d’urédospores sur des plantes entières, les premiers symptômes de la maladie apparaissaient sept à huit jours après la contamination. Îls consistaient en un léger gonflement et une décoloration de l’endroit infecté et deux jours plus tard, l’épiderme se déchirait et les urédospores apparaissaient alors.

À la fin de l'été se forment des téleutospores localisées dans les mêmes régions que les urédospores. D’après Aronsseu-Savuzeseu ces téleutospores germent avec la plus grande difficulté. On ne connaît pas de forme œcidienne et on ignore si cette urédinée est autoïque ou héteroïque.

2. Prélèvement des spores et inoculation des tissus. — La rapidité d'évolution du parasite rend facile le prélèvement aseptique des urédospores. Nous réalisons cette opération de la manière suivante : on choisit des feuilles présentant un certain nombre de taches blanches. Elles sont désinfectées en les plongeant rapidement dans de l’alcool-puis en les trempant pendant dix minutes dans une solution d’hypochlorite de calcium à 70 grammes par litre. On les rince alors à l’eau stérile et on les abandonne enfin pendant deux jours à l’air dans des boîtes de Petri humides maintenues à 20°. Dans la plupart des cas, la moitié environ des pustules s’ouvrent et laissent apparaître leurs spores.

On prélève ces spores avec une pipette Pasteur très effilée et légèrement humide et on les transporte sur des cultures de tissus préalablement humectées avec un peu d’eau stérile. Ces cultures consistent soit en fragments de tiges ayant produit des cals, soit en colonies provenant d’une souche ayant subi plusieurs repiquages. Dans aucun cas, malheureusement, nous n’avons pu réaliser l'infection de ces cultures. Cet échec ne peut être attribué à une mauvaise germination des spores, car en les plaçant pendant quelques heures dans une goutte d’eau en cellule de Van Tieghem nous avons pu constater que plus de la moitié émettaient un tube germinatif. Nous pensons donc que les variétés de Muflier sur lesquelles nous avons travaillé possédaient une immunité accentuée vis-à-vis du Puccimia. Il existe en effet divers degrés dans la résistance à la rouille des variétés cultivées. Les auteurs américains citent un certain nombre de races très résistantes et qui, pour cette raison, sont propagées par les horticulteurs de préférence aux autres. Peut être avons nous mis en culture par hasard, des tiges appartenant

à des variétés résistantes. En France, le Muflier est beaucoup moins cultivé qu'aux États- Unis et on ne peut se procurer des variétés bien définies dont la résistance est connue. On ne peut non plus choisir pour les cultures de tissus des plantes très aftaquées par la rouille, caril est nécessaire d'effectuer les prélèvements au printemps sur des plantes jeunes à une époque où la maladie, qui évolue au cours de l'été, ne s’est pas encore déclarée. |

IL. Essais p cucrure pe Puccinia Malvacearum Mowr. — 1. Caractères du développement. — La rouille des Mauves est une des espèces d’urédinées les moins spécialisées que l’on connaisse, car elle peut se développer sur la plupart des Malvacées herbacées. Elle possède un cycle de développement particulièrement simple.

Les basidiospores germent en donnant naissance à un mycélium haploïde qui se développe à l’intérieur de la plante. Ce mycélium forme sous l’épiderme un faux tissu composé d'éléments cellulaires uninuclées serrés et rangés parallèlement les uns aux autres. Ces éléments se conjuguent soit deux à deux, soit avec des hyphes indifférenciées et les cellules résultant de cette plasmogamie produisent des hyphes binuclées très courtes sur lesquelles naissent directement les téleutospores.

Ces téleutospores apparaissent à la face inférieure des feuilles sur les pétioles ou sur les tiges où elles forment des pustules brunes et globuleuses. Elles germent dans l’atmosphère en produisant quatre basidiospores qui peuvent infecter directement les tissus des Malvacées.

2. Prélèvement aseptique des spores et inoculation des cultures. — Nous avons songé à utiliser pour le prélèvement des spores de Puccinia Malvacearum la méthode que nous avions utiisée pour le Pucca Antirrhini. Les jeunes spores de la rouille des Malvacées se forment en eflet sous l’épiderme et sont pendant longtemps entièrement recouvertes par celui-ci. Si bien que dans ce cas également nous avons essayé de stériliser l'organe infecté avant que l’épiderme ne se déchire sous la poussée des spores. Mais nous avons remarqué à ce moment-là que les téleutospores ne sont pas encore mûres et ne peuvent germer.

Pour effectuer ces prélèvements nous avons opéré d’une autre manière. Nous avons placé dés fragments de tige de Mauve et de Rose-trémière couvertes de jeunes pustules sous une cloche tendue intérieurement de papier filtre humide afin d’y maintenir une atmosphère saturée; la base des tiges plongeait dans un récipient plein d’eau. Au bout de quelques jours, la plupart des téleutospores avaient germé pour donner des basidiospores. Ces basidiospores ont été prélevées en promenant à la surface des régions infectées une pipette effilée en tube capillaire et légèrement humectée, puis transportées dans une goutte d’eau stérile préalablement déposée à la surface de cultures de tissus d’Abutilon, de Malva et d’Althea. Malheureusement les résultats ont été entièrement négatifs; nous n'avons pu réaliser aucune contamination des tissus par le Puccinia.

À la suite de ce nouvel insuccès nous avons tenté de cultiver directement des tissus parasités. Nous avons choisi à cet eflet des jeunes tiges présentant des pustules encore recouvertes par l’épiderme. Ces tiges ont été désinfectées à l’hypochlorite suivant la technique ordinaire, puis soigneusement épluchées en prenant soin de ne pas éliminer

‘les jeunes sores. Malgré toutes les précautions prises, toutes nos cultures ont été infectées par des saprophytes variés et ont péri avant d’avoir pu se développer.

IV. Essais DE CULTURE DE Gymnosporanptum clavariaeforme (Jaco.) Res. — 1. Caractères généraux du développement. — Les Gymnosporangium sont des Urédinées hétéroïques.

Le mycélium primaire de G. clavariaeforme se développe à l’intérieur de divers organes de l’Aubépine (feuilles, tiges, ovaires). Les organes infectés s’épaississent et se tuméfient ; sur ces {tumeurs apparaissent les fructifications, c’est-à-dire les pycnides, puis les écidies.

Le mycélium secondaire se développe à l’intérieur des tissus de Juniperus communis en provoquant le renflement des jeunes tiges. Au printemps ce mycélium produit d'énormes stromas qui font éclater l'écorce et répandent au dehors des masses gélatineuses Jaune clair formées de téleutospores agglomérées. Ces masses épaisses de 4 à 5 centimètres et longues de 3 à. A centimètres se gélifient sous l'effet de la pluie et les téleutospores germent sur place en émettant un promycélium donnant naissance à quatre basidiospores qui infectent à nouveau les Aubépines.

2. Prélèvement aseptique du champignon et inoculation des cultures. — T1 est relativement facile de prélever aseptiquement des téleutospores de G. clavariaeforme, car elles forment des masses très volumineuses faciles à désinfecter. I suffit pour cela de faire tremper ces fructifications pendant quelques instants dans une solution d’hypochlorite de calcium à 70 grammes par litre, puis d'éliminer avec un scalpel les parties attaquées : par l’antiseptique. Si on laisse ensuite pendant vingt-quatre heures les téleutospores dans une boîte de Pétri stérile garnie de papier filtre mouillé, elles germent en formant leur promycélium qui produit aussitôt des basidiospores. C’est avec des téleutospores développées de cette manière que nous avons tenté d’infecter des cultures de tissus d’Aubépine; pour cela nous avons prélevé avec une aiguille flambée de minuscules fragments de la masse gélatineuse des téleutospores que nous avons portés dans une goutte d’eau déposée à la surface des cultures. La souche de cultures de tissus d’Aubépine dont nous disposions à celte époque était encore jeune et se développait irrégulièrement. Pour ne pas la perdre nous n’avons pas voulu sacrifier pour cette expérience les plus belles colonies et nous n’avons utilisé que quelques cultures âgées ayant cessé de se développer, si bien qu’elle a échoué. En raison de la rareté du champignon et de la courte période durant laquelle on peut recueillir des téleutospores, il ne nous a pas été possible de renouveler cette expérience dans de meilleures conditions. Nous pensons que ces cultures associées présenteraient un grand intérêt en raison des tumeurs que provoque le champignon sur les organes qu'il infecte et nous espérons pouvoir recommencer ces essais ultérieurement. Il doit d’ailleurs être possible dans ce cas également de mettre en culture de jeunes tiges déjà infectées et portant des débuts de tumeur, ce qui éviterait l'opération toujours délicate et très aléatoire de l’inoculation.

Une espèce voisine Gymnosporangium Sabinae (Drcxs.) Winr se développe dans les ‘mêmes conditions sur le Genévrier Sabine et le Poirier, mais nous n’avons pas eu encore l’occasion d’en tenter la culture.

V. Cowezusions. — Nous ne pensons pas que ces essais infructueux de culture d'Urédinées indiquent que le parasite ne puisse se développer sur des tissus cultivés an vitro. Mais nous croyons que cet insuccès est plutôt dû à une mauvaise méthode d’inoculation. Nous avons en effet cherché à contaminer par cette méthode non plus des tissus cultivés in vitro, mais des fragments de Muflier ou de Mauve isolés aseptiquement et dans ce cas également le résultat a été négatif. Or, l'expérience nous montre dans les conditions naturelles ces organes sont fortement attaqués, ils peuvent donc servir de support au Puccimia. H semble donc bien que c’est la méthode que nous avons employée pour les contaminer qui est défectueuse.

Nous pensons qu'une autre voie donnerait plus facilement des résultats. C’est celle qui consiste à mettre en culture des organes déjà contaminés et contenant le mycélium du parasite.

Le mycélium des Urédinées que nous avons étudiées est très superficiel et ne pénètre pas profondément dans les tissus. Chez d’autres espèces, au contraire, l'infection se généralise dans un organe entier ou même dans toute la plante. En s'adressant à de telles espèces et en isolant aseptiquement des fragments de tiges infectées, 11 doit être possible de réaliser d'emblée la culture associée des tissus et du parasite.

D. Cultures de virus.

L. Généraurrés. — On sait depuis longtemps que les plantes peuvent contracter des maladies infectieuses dont l'agent pathogène est indécelable par l'observation microscopique. Dès la fin du siècle dernier, Iwaxowsxy (32), puis Beweriex (5) constatèrent que le facteur de la Mosaïque du Tabac traverse les filtres qui arrêtent toutes les bactéries visibles, et qu’il est impossible de l’observer au microscope. À ces agents invisibles on a donné le nom de Virus.

Depuis cette époque, on a découvert de nombreux virus susceptibles de s’attaquer aux plantes. Cependant leur nature n’a été définitivement établie qu'au cours de ces dernières années, après que Srancey (69), en 1935, eût isolé un nucléoprotéide cristallisé possédant toutes les propriétés du virus de la Mosaïque du Tabac. En 1936, Bawoen et Pie (4), en utilisant des méthodes analogues, ont obtenu sous forme pure et cristallisable le virus du Bushy-Stunt de la Tomate et montré que dans ce cas, comme dans celui du virus de la Mosaïque du Tabac, il s’agissait d’un nucléoprotéide.

Il n’est pas surprenant que ces agents pathogènes ne puissent être cultivés dans des milieux inertes puisque leur multiplication résulte vraisemblablement d’une déviation du métabolisme des cellules de la plante attaquée.

Le problème de la conservation des virus est difficile à résoudre. En effet, leur activité in vitro ne se maintient que rarement au delà de quelques semaines et, pour les conserver, on est obligé de les inoculer périodiquement à des plantes saines cultivées en serre et isolées de tout contact infectieux. Cette méthode n’est pas sans présenter des inconvéments; même dans ces conditions, il est bien malaisé de se mettre à l’abri de toute contamination, soit par les insectes, soit au cours des opérations culturales ; si bien que l’entretien d’une collection de virus nécessite un travail matériel considérable et beaucoup d'espace. Pour éviter ces inconvénients nous avons songé à utiliser, pour conserver des virus, non plus des plantes entières, mais des cultures de tissus qui se manipulent presque aussi facilement que des cultures de Bactéries ou de Champignons. Ces cultures peuvent, en outre, permettre de rechercher l'influence de diverses conditions sur la multiplication du virus, alors que cette étude est presque impossible sur la plante entière. La réalisation des premières cultures de ce genre est due à Ware (75); dès 1934, cet auteur eut en effet l’idée de cultiver, sur des racines isolées de Tomates, différents virus tels que le virus de la Mosaïque du Tabac, sa variété « Aucuba» et le virus de la Mosaïque du Concombre. Pour réaliser ses cultures, il isolait des fragments de tige de Tomates atteintes de Mosaïque et les plaçait dans une atmosphère humide afin de leur faire produire des racines adventives. Ces racines étaient alors ensemencées dans un milieu approprié et le virus qu’elles contenaient se multipliait au cours de leur croissance. Toutefois, il ne parvint pas à inoculer la maladie à des cultures de racines saines et fut constamment obligé de partir de plantes entières contaminées par les virus. Plus récemment, Seergran (67-68) est parvenu à son tour à cultiver le virus de la Mosaïque du Tabac en se servant comme support de fragments de tige de cette plante et

il a pu inoculer la maladie à des tissus sains cultivés in vitro, mais il ne put maintenir

ses cultures en survie indéfinie par des repiquages et celles-ci ne subsistèrent que quelques mois.

IT. Essus Prézrminaines. — Nous avons entrepris des travaux analogues dans le but d'obtenir des cultures plus durables, et pour cela nous avons isolé des tissus de plantes malades et nous les avons cultivés suivant notre technique habituelle. Nos premières tentatives ont porté sur des tissus de Tabac atteint d’une maladie causée par un complexe composé du virus de la Mosaïque du Tabac et du Virus I du Concombre. Ce complexe détermine chez le Tabac et la Tomate une affection sévère étudiée par Lowasser et M'° Avcrer pe Monrenemer (42), et dont le caractère essentiel est une déformation des feuilles qui, dans certains cas, peuvent. prendre l'aspect de simples vrilles. Des fragments de tige de plantes atteintes de cette maladie ont été mis en culture sur un mileu renfermant de l'acide naphtyle acétique à la concentration de 5.107. Ils ont produit des cals volumineux qui ont été repiqués deux mois plus tard sur un milieu ne contenant plus que 0,1 mg. par litre d’hétéroauxine (107). Ces cultures ont continué à se développer assez lentement et nous avons entretenu leur activité par des repiquages réguliers effectués tous les deux mois. À ce moment-là, nous avons alors essayé de déceler la présence des deux virus dans les tissus de cette souche en inoculant six pieds de Tabac au stade quatre feuilles à l’aide du jus obtenu en broyant trois cultures. Nous avons constaté que vingt-deux jours plus tard la Mosaïque du Tabac se manifestait de façon distincte sur toutes les plantes inoculées et quelques jours après des déformations foliaires caractéristiques attestant la présence du Virus I du Concombre atteignaient deux des Tabacs inoculés. Cette expérience préliminaire avait montré qu'il est possible de cultiver tn witro certains virus qui atteignent les Solanées et nous a encouragés à entreprendre de nouvelles recherches plus approfondies. Ces nouvelles recherches avaient pour but de réaliser des cultures associées de tissus de Tabac et de virus de la Mosaïque du Tabac, de virus X et de virus Ÿ de la Pomme de terre.