Variations du pH avec l'acide acétique
P obtenu
Suc carbonaté 10 cm3 + H,0 : 2 cm3,5 + acide acétique au 1/10e : 0 cm$ 94
Suc carbonaté 10 cm3 + H,0 : 2 cm? + acide acétique au 1/10e: 0 cm3,5 8,0
Suc carbonaté 10 cm3 + H,0 : 1 cm3,5 + acide acétique au 1/10e : 1 cm3 6,8
Suc carbonaté 10 cm + H,0 : 14 cm? + acide acétique au 1/10: 1 cmÿ,5 6,0
Suc carbonaté 10 cm8 + ue 0 cm,5 + acide acétiqué-auw1/10%: 2 cmÿ..........
Suc carbonaté 10 cm3 + H,0 : 0 cm$ + acide acetique an-1/109 209,50... eee a oo ee
DS
2, — Variations du pH avec l’acide phosphorique.
pH obtenu
Suc carbonaté 5 cm° + H,0, XII gouttes 953
Suc carbonaté 5 cm? + acide ile au 1/10, XII gouttes
Suc carbonaté 5 cm3 + H,0, XV gouttes
Suc carbonaté 5 cm# + acide phosphorique, XV gouttes
Suc cabornaté 5 cm3 + HO, V gouttes
Suc carbonaté 5 cm? + acide phosphorique au 1/40 Ngouttes KITS RAM
D’après ces résultats les variations de pH auxquelles on soumet au préalable la laccase n’ont pratiquement aucune action sur l’activité de cette diastase ce qui confirme les résultats obtenus par P. FLEURY.
CONCLUSIONS
La précipitation de nos préparations diastasiques par le carbonate de sodium nous permet une purification très importante de la laccase. Elle élimine une grande quantité de substances étrangères. Naturellement le taux d’extrait sec et celui des cendres sulfatées n’est cependant pas diminué cela tient à ce que les sucs ainsi traités renferment un excès de carbonate de sodium, qu’il sera d’ailleurs facile d'éliminer par dialyse ou ultrafiltration.
L'activité de la laccase ne semble pas se ressentir de ce traitement brutal.
Mais le fait le plus important est l’élimination de grandes quantités de fer, d’azote et surtout de très notables
Er QU =
quantités de manganèse, environ 85 à 95 p. 100 du manganèse primitif.
Le liquide obtenu se prête facilement aux variations de pH par addition de quantités convenables d’acide phosphorique ou acétique, et sans dommage pour l’activité de la laccase. Comme nous le verrons plus loin, le suc carbonaté dialysé nous permettra de réaliser des adsorptions complètes de la laccase.
0 re
IT. — Précipitation par un sel neutre :
sulfate d'ammonium.
La purification de nos préparations diastasiques par un sel neutre est le dernier essai de la méthode de précipitation, que nous avons utilisé dans notre travail.
La précipitation des diastases par les sels neutres est directement calquée sur la précipitation des protéines dans les milieux biologiques.
Cependant, en ce qui concerne les diastases, le choix du sel neutre à utiliser, pour réaliser la précipitation doit être fait d’une façon judicieuse, car les électrolytes ont sur l’activité des diastases une action considérable et complexe, qui se traduit soit par une exaltation de l’activité ce qui est rare, soit le plus souvent par une diminution.
Cest ainsi que le chlorure de sodium ne peut être utilisé car ce sel se montre fortement nuisible pour la laccase comme l’a montré P. FLEURY [46].
Les sulfates alcalins, n’ont aucune action sur l’activité ; il en est de même du sulfate d’ammonium.
Parmi tous ces sels neutres, nous avons choisi le sulfate d’ammonium, car celui-ci présente sur tous les autres, l’avantage d’être volatil ; il est donc facile à éliminer par calcination, ce qui est précieux lorsqu'on ne veut pas introduire d’éléments étrangers dans les cendres des préparations examinées.
Au moment où ces recherches ont débutées, le sulfate d’ammonium venait d’être utilisé par NoRTHROP et KuniTrz [84] et l'emploi de ce sel leur avait permis d’obtenir la trypsine cristallisée. Depuis cette époque, ces mêmes auteurs et d’autres chercheurs ont généralisé leur technique. P. FLEURY [44 bis].
Etude et technique de la précipitation par le sulfate d’ammonium.
Nous effectuons la précipitation par le sulfate d’ammonium à saturation, sans chercher à opérer un fractionnement comme nous l’avons fait pour nos préparations alcooliques et acétoniques, et comme on le fait habituellement pour les protéines dans les milieux biologiques.
Pour faire cette précipitation, au lieu de saturer nos préparations de laccase de sulfate d’ammonium cristallisé, nous avons préféré, préparer à part une solution saturée de sulfate d’ammonium (70 g. de sulfate d’ammonium cristallisé et 100 cm3 d’eau) à la température ordinaire et utiliser de grandes proportions de cette solution saturée, pour de petites quantités de préparations de laccase. La précipitation est faite à basse température, 0° environ.
La technique choisie pour la précipitation est la suivante :
PTE a HOn de MA TAC CASE NT En à esse une partie 2° Solution saturée à 16° de sulfate d’ammonium. dix parties
On verse la préparation de laccase, préalablement maintenue dans la glacière pendant 1 heure, dans la solution saturée de sulfate d’ammoniaque également refroidie (2 à 3 heures à 0°).
On laisse la précipitation se faire à la glacière.
On obtient ainsi un précipité brunâtre, se déposant difficilement à cause de la densité du liquide, mais facile à recueillir sur un filtre sans plis. Une propriété intéressante de ce précipité est sa grande solubilité dans l'eau. Cette propriété sera utilisée plus tard, pour réaliser la concentration de la laccase, en dissolvant le précipité dans la plus petite quantité d’eau possible.
Précipitation. — Nos premiers essais de précipitation ont porté sur le suc (Nuoc’ Son) plus ou moins dilué. La précipitation effectuée d’après la technique indiquée ci-
dessus, ne nous a pas donné de bons résultats ; elle est incomplète et de longue durée, de sorte que nous avons abandonné l’action directe du sulfate d’ammonium sur le suc lui-même.
Nos investigations ont porté sur le suc purifié par précipitation au carbonate de sodium avec lequel nous avons obtenu des résultats satisfaisants.
Notre première intention était d'obtenir une précipitation intégrale de la laccase, par le sulfate d’ammonium.
Nous avons alors effectué diverses expériences pour étudier la précipitation en fonction du temps et en fonction de la réaction du milieu, de façon à fixer les conditions les plus avantageuses au point de vue pratique.
Expérience A. — Dans une première expérience nous avons simplement étudié la précipitation de la laccase par le sulfate d’ammonium en fonction du temps.
Voici la technique utilisée.
Expérience A.
Un volume de suc carbonaté (Nuoc’ Son traité par son volume de solution normale de carbonate de sodium) on ajoute 10 volumes d’une solution saturée de sulfate d’ammonium. La précipitation est effectuée à la glacière pendant une journée, le précipité obtenu est recueilli sur un filtre sans plis, et ramené par dissolution dans l’eau, au même volume que le suc carbonaté primitif.
Nos mesures d’activité et le dosage de manganèse n’ont porté que sur le suc carbonaté, et sur le liquide obtenu ‘par dissolution du précipité, comme on vient de l'indiquer.
mnt Pet
Voici les résultats obtenus ramenés à 100 cm.
Extrait soc en g. p. 100 Cendres sulfatées en g. p. 100 Manganése en mg. p. 100 Activité C. D.
Extrait sec Titre en Mn
Suc carbonaté
= oo ot
Précipité formé par SO;(NH;)}? ramené au volume primitif de la solution qui lui a donné naissance . 1:50 2,35(1) |<0,0001
(1) Renferme du sulfate d'ammonium.
On constate en même temps qu’une purification totale, une perte d’activité de la laccase d’environ 50 p.
Deux hypothèses peuvent expliquer cette perte d’activité :
1° L'action nocive du sulfate d’ammonium, 2° une précipitation incomplète de la laccase. Nous avons vérifié la première, en éliminant la totalité ou la majeure partie du sulfate d’ammonium par dialyse: Voici la technique utilisée
AUTEUR TS A OI nl DOCS 50 cm
Solution saturée de sulfate d’ammonium........ 500 cm?
La précipitation est effectuée à la glacière pendant une journée.
Le précipité est ensuite recueilli sur un filtre sans pli, et dissous dans la plus petite quantité possible d’eau distillée. La solution obtenue est soumise à la dialyse pendant 3 jours. Dans le dialysat ramené à 100 cmÿ et correspondant par conséquent à une dilution au demi du suc carbonaté, nous avons mesuré l’activité diastasique, ainsi que le taux en extrait sec et en cendres sulfatées, et nous avons dosé le manganèse.
MO
Voici les résultats obtenus ramenés à 100 cm.
SEA £ e $ à : £ 2 DD; | a ea RE A a 5 5 SUCICATDONALC rer eee 3.300 [13,650 | 4,150 | 3,05 Suc carbonaté précipité par le le sulfate d'ammonium puis CN RÉ ee. 1.160 | 0,340 | 0,02 | 0,001
Nous constatons encore une perte importante dans l’activité : supérieure à 50 p. 190 par conséquent la présence du sulfate d’ammonium ne gêne pas l’activité de la laccase, et si dans cet essai avec dialyse, nous constatons une perte d’activité beaucoup plus grande que dans l'expérience précédente, on peut admettre que cette perte est due à une purification très poussée et que la laccase devient alors beaucoup plus altérable.
Expérience B.
La technique utilisée est la même que dans l’expérience A, mais le temps de précipitation à la glacière est de deux jours.
À cette expérience nous avons ajouté une étude de la précipitation en fonction du pH. Nous avons étudié simplement ce que devenait l’activité lorsqu'on précipitait à divers pH le suc carbonaté.
Voici les résultats :
Solution acide Solution Suc carbonaté | phosphatique saturée de
en cms à 12 p. 100 d' sulfate ET ammonium
en cm#
PReEh (7 NES
Cette expérience nous montre que, si l’on veut réduire la perte d’activité il est nécessaire d'amener le milieu à un pH convenable, qui est aux environs de 7.
Il est indispensable d'autre part, pour que la floculation du précipité s’effectue convenablement, d’opérer avec un suc préalablement traité au carbonate de sodium, et de prolonger la précipitation pendant deux jours à la température de 0° environ.
Voici un essai fait dans ces conditions avec les résultats des mesures d’activité et des dosages d’extrait sec, cendres sulfatées, fer et manganèse :
Suc carbonaté 50 cm3
On amène séparément le suc carbonaté et la solution saturée de sulfate d’ammonium aux pH 7 et 6,1 par addition d’acide acétique.
La précipitation faite à la glacière dure 2 jours. Le précipité obtenu est recueilli sur un filtre sans plis et redissous dans 50 cm d’eau, c’est-à-dire ramené au volume initial du suc carbonaté. Voici les résultats obtenus.
Extrait sec en g. p. 100 cmÿ Manganèse en mg. p. 100 cm Fer Mn y UD;
Titre en Mn
Cendres sulfatées en g. p. 100 cm8 en mg. p. 100 cmÿ
Concentration diastasique C. D.
Suc carbonaté ,.,....| 3.275] 12,26] 1,580]1,40 2,0010,42
Suc carbonaté précipité par le Le ee ‘ammonium à LE PRINT de Le .1 2.335| 2,96] 0,020/0,0020/< 0,02/0,0085
Suc carbonaté précipité par le sulfate D d'ammonium à pH
On voit que la perte d’activité de la laccase est de l’ordre de 30 p. 100, mais que l’extrait sec (1), les cendres sulfatées, le fer et le manganèse, ont considérablement diminué. Nous éliminons par cette méthode une grande quantité de manganèse, en partant d’un suc carbonaté, qui ne renferme, déjà plus que 10 à 15 p. 100 du manganèse existant dans la préparation primitive.
CONCLUSIONS
La précipitation par le sulfate d’ammonium est une méthode intéressante, pour la purification de la laccase.
Si elle aboutit à une perte relativement considérable de l’activité, elle permet par contre, une purification importante de cette diastase. D’autre part la grande solubilité du précipité permet d’obtenir des solutions concentrées de laccase dont la purification peut être encore poussée plus loin. Comme nous verrons par la suite, grâce à l’élimination du sulfate d’ammonium, par ultrafiltration.
(1) L’extrait sec est certainement très inférieur aux chiffres
trouvés, car notre produit contient fatalement des quantités importantes de sulfate d’ammonium.
