C. Purification de la laccase par dialyse

Nous avons appliqué la dialyse à la purification de la laccase.

Des raisons d’ordre technique et matériel ne nous ont pas permis, à notre grand regret, de faire des électrodialyses.

La durée de l’opération ne semble pas avoir une grande influence sur l’activité de nos préparations diastasiques, ainsi que le prouvent diverses expériences. La légère perte d’activité peut être due au passage de la diastase à travers la membrane.

TECHNIQUE UTILISÉE. — Nos essais de dialyse n’ont porté que sur les sucs ayant subi la précipitation par le carbonate de sodium. Notre principal but, dans cette opération, est d'éliminer les électrolytes, et tout spécialement le carbonate de sodium en excès.

La dialyse, complètera donc la purification de la laccase par ce réactif.

A) Préparation du suc pour la dialyse. — Précipitation par le carbonate de sodium (voir plus haut). Le Nuoc’ Son est traité par un égal volume de solution normale de carbonate de sodium ; après centrifugation, le liquide carbonaté actif est soumis à la dialyse.

B) Appareil de dialyse. — Nous avons utilisé le plus simple, le dialyseur de GRAHAM (diamètre 15 em.) et comme membrane dialysante des feuilles de cellophane du commerce (épaisseur 0 mg.,2 environ).

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C) Résultat.

Suc carbonaté soumis à la dialyse .......... 120 cm3 DAC TIAIYSE EI TOCURRLE Sn ea dieu à da ou 210 cm3 DURÉE FODET AO. RL ar 2 jours

Eau de dialyse remplacée 7 fois.

Remarque. — Les chiffres des 5 premières colonnes du tableau sont rapportés selon les cas soit à 120 cm3 de suc avant dialyse, soit à la totalité du suc après dialyse (210 cm).

Pour la définition de l’unité diastasique U. D. voir pages 65 et 66.

TABLEAU I

= ' 5 E A F . 2 E $ SA Es se | ce | É8 | .8 8 à as .| Se De bo ë Ne Mo poule he ls ire Suc dilué au demi:

1420 cmë......…... 3060 112,048) 1,152) 14,64) 2,4 | 9259 | 4,86 Suc carbonaté :

AE CIE. ne 3020 115,568] 4,128] 0,48) 1,44 193 | 0,16 Suc dialysé : 120 | FT Er 2436 | 6,825| 0,609! 0,21| 0,63 | 357 | 0,08

Notre suc dialysé renfermait encore du carbonate de sodium ; les premières portions de ce sel s’éliminent très vite, ainsi qu’il est facile de le constater dès le début de la dialyse mais les dernières traces s’éliminent plus difficilement.

Dans l’expérience précédente, le pH du suc carbonaté qui était d’environ 9,2 devient après dialyse voisin de 7, Nous avons réalisé une nouvelle expérience en changeant le pH vers la fin de l'opération. Après une dialyse simple d’une durée de deux jours le suc carbonaté dialysé est amené au pH 4,8 par addition d’une quantité déterminée de solution tampon, l’opération est terminée comme précédemment.

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Voici le schéma de cet essai

Nuo®SOn QUE Tres CE DTE RE volumes Solution normale de carbonate de sodium.... égaux

Après centrifugation 70 em* de suc carbonaté, sont soumis à une dialyse simple (Expérience A). 70 cm* de ce même sue carbonaté sont soumis d’abord à une dialyse simple, d'une durée de deux jours, puis amenés au pH 4,8 (Expérience B). La durée totale de la dialyse dans ces deux essais a été de trois jours ; l’eau a été remplacée sept à huit fois.

Les résultats sont consignés dans le tableau ci-dessous et rapportés selon les cas soit à 70 cm° de suc avant dialyse, soit à la totalité du suc après dialyse 240 cm* pour le sue À ; 245 em? pour le suc B.

TABLEAU II

Unités diastasiqués CD; Extrait sec Cendres sulf.

Manganèse en mg.

Activité diastasique À. D.

Titre en Mn y Mn

Sue dilué au demi:

JD OMS Re

Sue carbonaté

| Suo B dialysé à pH 4,8 : 245 om$

CONCLUSIONS

Si l’on prend comme terme de comparaison le suc avant l’action du carbonate de sodium, la double opération précipitation par le carbonate de sodium et dialyse, peut se faire avec une perte qui ne dépasse pas 20 p. 100 de l’activité diastasique initiale.

Dans les trois expériences, l’extrait sec est diminué de plus de moitié, de sorte que l’activité diastasique A. D. est presque doublée, les cendres subissent une diminution analogue, le fer est éliminé dans la proportion de 75 p. 100 et le manganèse par unité diastasique s’abaisse de 4,86 à 0,08 (Tableau D) et de 5,76 à 0,13 ou 0,10 (Tableau ET);

Comme nous le verrons plus loin, en combinant la dialyse avec la défécation par le carbonate de sodium, on peut obtenir des sucs assez purifiés pour se prêter à des adsorptions simples et faciles,