INFLUENCE DE LA DILUTION
L’adsorption se manifeste surtout lorsque les préparations diastasiques sont diluées. Des adsorptions difficiles à réaliser dans certains cas deviennent possibles lorsqu’on dilue au 1/100 ou au 1/1.000 les préparations diastasiques, mais on rencontre alors des difficultés matérielles qui, limitent l’emploi de cet artifice.
Cest ainsi que WILLSTÂTTER et KRAUT [114] ont constaté que le rendement de certaines adsorptions est influencé par la concentration initiale du corps adsorbé :
Une quantité déterminée d’hydrate d’alumine est mise en adsorption avec 0,046 unités de saccharase dans 50 cm® d’eau on obtient une adsorption de 50 p. 100. Si on porte la dilution à 100 cm l’adsorption est de 82 p. 100, si on la porte à 200 cm3 on obtient une adsorption de 95 p. 100. Les deux auteurs ont fait les mêmes observations pour l’invertine, pour la lipase du foie, la lipase de l’estomac, la péroxydase, la papaïne, mais ce phénomène ne s’observe pas pour tous les enzymes, ni à tous les degrés de pureté. |
WILLSTÂTTER et WASSERMAN [121] ont étudié l’adsorption de l’invertine en solution diluée. En partant d’un autolysat vieilli de levure, purifié par adsorption sur kaolin. Is ont obtenu après adsorption par l’alumine et
élution à l’aide du phosphate d’ammonium une préparation diastasique dont la valeur en saccharase était de 0,036 unités ; mais en partant d’un autolysat dix fois plus dilué, ils ont obtenu par la même technique une préparation d’invertine 30 fois plus active et correspondant à une valeur en saccharase, égale à 1.
d) INFLUENCE DE CERTAINES SUBSTANCES.
A côté de la réaction du milieu et de la dilution, certaines substances ajoutées à la préparation diastasique préalablement purifiée favorisent l’adsorption.
Ainsi la présence de l’alcool ou de l’acétone dans les préparations de peroxydase, rendent cette diastase plus facilement adsorbable. L’amylase qui est indifférente aux adsorbants électropositifs et électronégatifs devient adsorbable par la terre à foulon lorsqu'elle est additionnée d’alcool ou d’acétone.
La glycérine facilite l’adsorption de la lipase, mais elle la diminue pour l’amylase. Il semble que l’addition d'alcool, de glycérine, d’acétone, développe le caractère soit acide soit basique des substances amphotères qui accompagnent les diastases, comme lont constaté WiL- LSTÂTTER et WALDSCHMIDT-LEIZT [120] dans le cas des acides aminés et des polypeptides.
E. Marche à suivre pour réaliser une adsorption.
Connaissant les divers facteurs qui influencent l’adsorption, on peut résumer dans leur grandes lignes les techniques opératoires qui permettent de la réaliser.
1° Obtention d’une préparation diastasique adsorbable
a) purification des préparations diastasiques
b) si besoin est, utilisation de véritables adjuvants favorisant l’adsorption (alcool-glycérine).
2° Détermination du pH, optimum d'adsorption, par l'étude de l’adsorption à divers ph, sur des parties aliquotes de la préparation diastasique.
3° L'adsorption s'effectue en mélangeant la suspension de l’adsorbant et la préparation diastasique, et en agitant mécaniquement. La durée de l’adsorption devra être déterminée au préalable.
4° La séparation de l'adsorbat s'effectuera à la centrifugeuse.
9° L'adsorbat étant obtenu, réaliser l’élution en faisant varier la réaction du milieu dans les plus grandes limites possibles, au moyen des solutions tampons.
Préparation des adsorbants.
Les adsorbants les plus utilisés sont des gels trouvés dans la nature ou préparés au laboratoire (hydroxydes de métaux). Leur pouvoir d’adsorption est généralement fonction du développement de leur surface, les substancès qui ont le plus grand pouvoir d'adsorption sont surtout les combinaisons polyvalentes, c'est-à-dire celles qui ont le plus de tendances à former des composés multiples. Seuls les gels d’alumine, (hydrates de tonerde) ont fait l’objet d’études très poussées. WILLSTÂTTER et KRAUT [114] éludièrent leurs constitutions chimiques et montrèrent qu'il en existe différentes sortes.
Une propriété importante des gels d'alumine est leur vieillissement, qui joue un grand rôle dans leur pouvoir adsorbant, La grosseur des particules augmente avec le temps avec une vitesse variable d'un gel à un autre, et leur surface d’adsorption diminue parallèlement. Il y a souvent un changement dans la composition chimique, par perte d'eau inter et intramoléculaire, et formation d'anhydrides à partir d'hydroxydes. Le pouvoir sélectif de tel hydroxyde vis-à-vis de plusieurs diastases peut ainsi varier avec le temps. :
Aussi étant donné ces diverses propriétés des adsor-
bats utilisés surtout sous forme de gel, il ne faut en aucune façon s’écarter de la technique opératoire exacte donnée par WILLSTÂTTER pour leur préparation.
Les lavages destinés à éliminer les électrolytes des gels sont très importants, et il faut les prolonger le plus possible, on reconnaît que les électrolytes sont complètement éliminés au fait que les gels se déposeront plus difficilement et qu'ils ont tendance à se peptiser, Quoique n'ayant pas utilisé tous les adsorbants décrits ci-après nous croyons faire œuvre utile en donnant leur mode de préparation.
I. Gels d’alumine. — WizcsrÂTTEr et KRAUT [114] ont déterminé trois groupes de composés colloïdaux de gels d’alumine selon les combinaisons qui existent entre AI (OH), et H,.0. Selon le mode de Pré paration, ils aboutissent à des corps différents.
Ces auteurs préparèrent.
1° Alumine C obtenue par précipitation par Pammoniaque étendue sans chauffage prolongé.
2° Alumine A obtenue par précipitation au moyen d’un excès d’ammoniaque concentrée, suivie d’un chauffage prolongé.
3° Alumine B. obtenue par précipitation au moyen d’un excès d’ammoniaque concentrée, non suivie d’un chauffage prolongé.
Ces diverses espèces d’alumine se distinguent entre elles par leur simple aspect physique. À et B sont plastiques, C est pulvérulente. L’alumine C correspond au moment de la précipitation, à l’orthohydroxyde Cz, qui instable se transforme assez vite à une forme laquelle à son tour devient mais plus lentement une forme C#. Voici les diverses propriétés et le mode de préparation de ces orthohydroxydes (Cx, CB, Cy) et des alumines A et B. que nous avons trouvés dans la littérature Allemande (Oppenheimer-Pincussen-Die Methodik der Fermente).
a) Orthohydroxydes. — Obtenus en précipitant le sulfate d'aluminium dans les conditions les plus douces, avec un très léger excès d’ammoniaque, et en ajoutant comme tampon du sulfate d’ammonium. On obtient un gel AI (OH), qui est l’hydroxyde C+ très soluble dans les acides et les bases. Cette forme se transforme en quelques heures en une forme CB moins soluble dans les acides et les bases, et qui se distingue par un adsorption plus sélective sur un mélange de maltase et de saccharase.
L’orthohydroxyde C8 se transforme peu à peu (en quelques semaines) en un hydroxyde C dont la formule est encore AI (OH).
Voici la différence qui existe entre ces trois formes d'ortho” hydroxydes, quant à leur solubilité dans l'acide chlorhydrique dilué, et la soude diluée.
L'orthohydroxyde Ca se dissout à froid dans HCI à 0,1 p 100 et se dissout dans Na OH à 0,4 p. 100 à froid.
L'orthohydroxyde C$ se dissout à froid seulement dans HCI à 10 p. 100 et se dissout dans Na OH à 0,4 p. 100 à froid.
L'orthohydroxyde Cy se dissout à froid seulement dans HCI à 37 p. 100 et ne dissout pas dans Na OH à 4 p. 100 à froid.
PRÉPARATION DE L'ORTHOHYDROXYDE. — 100 cm3 d’ammoniaque à 10 p. 100 sont versés dans 600 cm d’eau à 63°, contenant 22 g. de sulfate d’ammonium ; on refraidit à 58° et on ajoute en une seule fois et en agitant fortement 150 cm d’une solution renfermant 76 g.,7 d’alun ammoniacal et portée à 58° ; la température s’élève à 61°. On maintient 10 minutes en agitant à 58°. Le mélange est ensuite soumis à une centrifugation rapide. On lave 5 fois le précipité obtenu avec 1 litre et demi d’eau chaque fois, en se servant de la centrifugation pour séparer le précipité du liquide surnageant. A la première eau de lavage on ajoute 12,5 d’ammoniaque à 10°, à la 2° le double, et ainsi de suite, à la 6° centrifugation le liquide surnageant est trouble. Le précipité
dm. vd dd
ne renferme que des traces de sulfates. Toute l'opération dure 2 heures 1/4.
La transformation de Cx en CB commence quelques heures après la précipitation quelquefois au bout de 5 heures 1/2 la transformation est complète, dans certains cas elle est à peine commencée. L'aspect change, la suspension floconneuse devient une masse compacte de couleur tirant sur le jaune. ï
PRÉPARATION DE L'HYDROXYDE C. — Les lavages n’ont aucune influence dans la transformation de CB en C+, celui-ci ne s'obtient que quelques semaines après la préparation du Cf.
WiILLSTÂTTER et KRAUT, appellent cet hydroxyde C+, le tonerde C. Voici comment ces auteurs le préparent.
Une solution chaude de 340 g. d’alun ammoniacal dans 500 cm? d’eau est versée en une seule fois dans 3 1. 250 d’eau ammoniacale, renfermant du sulfate d’ammonium et portée à 60° (100 g. SO, (NH; 215 cm ammoniaque à 20 p. 100, c’est-à-dire 39 g.,2 d’ammoniaque au lieu de 36 g.,3 trouvé par le calcul). On agite vivement pendant 15 minutes sans laisser descendre la température au dessous de 60° ; le précipité volumineux au début, devient ensuite floconneux. On dilue à 20 litres on lave par décantation, on ajoute 40 cm? d’ammoniaque à 20 p. 100 à l’eau de lavage de la 4 décantation pour décomposer le sulfate aluminium basique formé à partir du sulfate d’ammonium. On lave jusqu’à ce que le liquide ne reste plus clair. Décanter encore deux fois au moins pendant quelques jours. Au bout de quelques semaines, vérifier la transformation complète des orthohydroxydes. Avec l’ammoniaque à 10 p. 100 à chaud z et donnent en 48 heures une poudre grossièrement blanche, B ne change pas d’aspect.
b) Polyhydroxydes. — On les obtient en utilisant un excès d’ammoniaque, mais une solution ammoniacale trop forte ou trop faible, donne comme impureté de l’or-
