TROISIÈME PARTIE

Purification de la laccase par des méthodes associées.

Variation du fer et du manganèse au cours de cette purification.

Dans les chapitres précédents, nous avons montré les résultats que pouvaient donner les diverses méthodes quand on appliquait chacune d’elles en particulier, à la purification des préparations diastasiques de suc d’arbre à laque.

Dans cette troisième partie, nous rapportons les résultats obtenus en appliquant successivement à un même échantillon de suc plusieurs de ces techniques.

En réalité, nous nous étions déjà inspirés de cette idée sous la pression même des circonstances dans les chapitres précédents, puisque nous avons montré que la défécation au carbonate de sodium était une opération préliminaire indispensable pour l’application de toutes les autres techniques étudiées (action de sulfate d’ammonium, dialyse, ultrafiltration, adsorption et élution). En ce qui concerne l’adsorption elle même, nous avons constaté que notre suc pour être adsorbé devait, après action du carbonate de sodium, être soumis à la dialyse. Ce qui nous amenait en somme, à purifier notre préparation à l’aide de quatre opérations successives : précipitation

LENGUES

par le carbonate de sodium, dialyse, adsorption, élution. Nous allons donner dans cette dernière partie, quelques résultats obtenus en associant quelques méthodes entre elles.

Après avoir ainsi obtenu des préparations diastasiques aussi pures que possible dans lesquelles le fer et le manganèse ne peuvent plus (ou presque plus) être mis en évidence par nos réactifs nous ajouterons ces deux métaux en quantité déterminée et nous examinerons leur influence sur l’activité de la diastase. Cette façon de procéder n’est pas, il est vrai, à l’abri de certaines critiques. Si le fer et le manganèse ajoutés dans ce cas se montrent inactifs, on peut toujours objecter que ce résultat négatif est dû à ce que-ces deux métaux surajoutés ne se trouvent pas sous la forme nécessaire à l’activité de la laccase. Cette méthode synthétique, aura tout au moins pour résultat de délimiter le problème comme nous le verrons plus loin.

Comme dans les chapitres précédents, à chaque étape de la purification de nos préparations, nous aurons soin de mesurer le rendement en activité de la nouvelle préparation diastasique obtenue, ainsi que sa teneur en fer et en manganèse, Comme critère de purification d’une diastase, nous utilisons la notion d'activité déjà

défini pages 65 et 66 qui est le rapport (sa)

Extrait sec,

Ce rapport nous paraît être le témoin le plus fidèle pour suivre la purification d’une diastase. Pratiquement on se heurte à des difficultés dues à la fragilité de la diastase qui augmente au cours des manipulations de purification.

En même temps nous établirons le titre en manganèse c’est à dire le rapport es défini pages 65 et 66, et doserons le fer, quand la quantité de préparation diastasique le permettra.

Si à chaque étape de la purification on élimine du fer et du manganèse, sans perte d’activité, le rôle de ces

MRC Te

deux métaux dans l’activité diastasique devient ainsi moins probable.

Cependant il ne nous sera jamais possible d’établir leur élimination complète, nous serons toujours arrêtés par la limite de sensibilité de leurs réactions qui sont en valeur absolue avec les méthodes que nous avons utilisées, de 0 mg.,001 pour le manganèse et 0 mg.,01 pour le fer (1), les prises d’essai se trouvent d’autre part limitées par des nécessités d’ordre expérimental.

FE — Purification de la laccase en associant à la précipitation par le carbonate de sodium la précipitation acétonique.

L'association de ces deux méthodes nous a paru utile dans la purification de nos préparations de laccase. La première, précipitation par le carbonate de sodium élimine comme nous l’avons déjà vu, une grande partie de substances étrangères et une grande quantité de manganèse ; la seconde la précipitation acétonique élimine de son côté les substances qui sont solubles dans l’acétone.

Voici les schémas de deux essais que nous avons effectués ; les techniques de ces deux précipitations sont les mêmes que celles que nous avons indiqués dans les chapitres précédents.

Nous n’avons pas étudié la répartition du fer dans les divers précipités ainsi obtenus.

Tous les résultats sont consignés dans les tableaux cidessous.

. Les deux essais identiques comme technique opératoire mais pourtant sur deux sucs différents, sont désignés par les lettres À et B.

(1) Cette différence de limite de sensibilité, d’une part, la limitation des prises d’essais d'autre part, expliquent pourquoi, dans nos purifieations nous avons tout spécialement étudié le manganèse (rapport Tee ee, et négligé bien à regret, une étude

identique pour le fer.

Aie

1° Suc dilué au demi {activité - extrait sec - cendres sulfatées - Manganèse).

20 Suc non dilué 20 cm3 + Solution normale de carbonate de soude 20 cm?

4er Pres Précipité carbonaté inactif Liquide carbonaté actif (activité-extrait seccendres sulfatées-manganèse)

20 em liquide actif carbonaté + Ÿ20 cmÿ acétone

SR dr ee - 4 Dre précipité actif, chassé acétone, ramené à 20 cm$

ES Liquide inactif (extrait sec-cendres sulfatées-manganèse) chassé acétone, ramené à 20 cm* (activité-extrait-sec-cendres-sulfatéesmanganèse)

TABLEAU I

Ci : $£ Ê Œ Les. l'as ES SA RIESNNE Se) 2°. les SNS NS var] 28 | 2e | &— | s-— |S6kR Sol ÊT |SS | sé | Fe los .| Kw | SE = à S 5 (LE SRE Era AE CS Es SR ë Sue dire aude ARTS 966 119,225) .50,3 | 1,650| 30,5 | 31,5 Suc dilué au 1/2 par addition de son volume de carbonate etcentrifugé| 863 |20,200! 42,7 | 4,225] 2,75 | 3,18 Précipité acétonique prove- .

nant de 20 cmè de suc car- A bonaté redissous ramené à TOC ee ere 840 115,540] 54,1 | 2,650| 2,6 3,09 Liquide acétonique......... 0 | 7,082) — |2,015| 0,2 — Suc-diué an Li rat A et 1.023 |18,800| 54,4 | 1,600! 35,7 | 34,9 S'UCICAPDONALE LE RM RE 892 120,325] 43,9 | 3,850] 1,32 |: -1,48 B < Précipité cétonique......... 853 |14,550| 58,8 | 2,125] 1,31 | 1,53 Liquide cétonique

PONS ES 0: ss 250 el" 41706) 0 05 |

Dans ces deux expériences, nous constatons une perte d'activité qui est comprise entre 10 et 15 p. 100 et la quantité de manganèse éliminée est très importante, elle représente 92 à 95 p. 100 de la teneur en manganèse. Le

Mn Rx :

rapport Gp * diminué considérablement.

Nous pouvons donc conclure qu'il est possible d’éliminer de grandes quantités de manganèse sans modifier l’activité de la laccase.

I n'y a pas lieu dans ces expériences, d'envisager le

CD

EF x = ET apport Extrait sec

car l'extrait sec, malgré la préci-

pitation par l’acétone renferme de grandes quantités de carbonate de sodium.

IT. — Purification de la laccase après défécation au carbonate de sodium, par ultrafiltration, adsorption et élution.

Voici les résultats obtenus dans l’un de ces essais

Un échantillon de suc (Nuoc’Son) est traité par le carbonate de sodium on obtient après centrifugation 180 cm d’un liquide surnageant, contenant 5.170 unités diastasiques. :

Ces 180 cm* de liquide sont ultrafiltrés à pH — 4,9 avec lavage prolongé à l’eau, la partie non ultrafiltrée, ramenée au volume de 50 cm renferme 5.020 unités diastasiques. .

Un essai préliminaire d’adsorption à pH — 4,8 portant sur 10 cm du suc ultrafiltré, nous a montré que l’adsorption était totale en utilisant un culot d’alumine B (correspondant à environ 0 g.,4 de ALO:;) l’élution à pH 9,2 avec 10 cm d’un mélange à volumes égaux de solution de carbonate de sodium et de solution de phosphate disodique M/15 nous a donné un rendement de 75 p. 100.

Les 40 cm“ d’ultrafiltrat, représentant 4.016 unités

diastasiques, sont alors adsorbés par un culot d’alumine B, représentant une quantité quatre fois plus forte que dans l'essai précédent, à ph — 4,8, sous un volume total de 100 cm, par une agitation mécanique qui a duré une heure. L’adsorption a été totale. L’élution a été obtenue en traitant l’adsorbat d’alumine par 40 cm° d'un mélange de solution normale d’une solution de carbonate de sodium et de solution de phosphate de sodium M/15 elle a donné un rendement de 70 p .100.

Les 40 cm élués renfermaient 2.810 unités diastasiques.