SUR LA

TECHNIQUE

Au point où est parvenue la science, la technique microscopique est la condition de nouveaux progrès. Actuellement cette technique ne pèche pas par pénurie de procédés ; mais la qualité est bien loin d’être en rapport avec la quantité : un grand nombre de méthodes sont sans grande valeur, d’autres compliquées ne doivent leur mérite qu'à un de leurs composants ; il serait utile qu’une critique sévère vint déblayer le terrain ; mais c'est Ià une œuvre ingrate, exigeant un grand nombre d'expériences, dont la plupart n'auraient qu’un résultat négatif. Il ne sera peut-être pas inutile d'apporter ici, quelque incomplet qu’il soit, le résultat positif d'une somme de travail considérable dans ceite voie: à la suite de l'examen d’un grand nombre de procédés, j'ai retenu quelques-uns d’entre eux, dont certains sont à tort peu connus, ou mal jugés parce qu’ils sont mal employés ; j'ai étudié sur l'objet spécial de ce travail les conditions de leur réussite. On n'oubliera pas d’ailleurs cette restriction, que, ces conclusions ayant été établies pour certaines Annélides, je ne les prétends pas nécessairement valables pour les autres animaux et, aux divers stades du traitement, dans un autre enchaînement de conditions antérieures.

Immobilisation. — La plupart des animaux étudiés, notamment Atlolobophora fœtida, ont été simplement tués par l’action des fixateurs adoptés (sclution nitrique ou chromo-nitrique), qui immobilise assez rapidement et d'habitude dans une position symétrique par rapport au plan médian, direction de coupes la plus avantageuse. Mais deux types d'animaux ont présenté à ce point de vue des difficultés Nephthys mourait en bonne position, mais l'intensité des contractions musculaires déterminait souvent sous la pression une rupture du bourgeon avec écoulement de sang ; la dilution avec renforcement graduel du fixateur ne faisait pas disparaître cet accident ; l’eau alcoolisée et l'hydrate de chloral n’arrivaient que très lente-

ment à produire une narcotisation supprimant toute réaction à l'application du fixateur, et alors, outre l’incommodité d'un procédé si lent, la macération était à craindre pour la bonne conservation des tissus ; mais un moyen qui m'a bien réussi pour ces animaux consistait à soumettre un quart d'heure une petite quantité d’eau de mer aux vapeurs de chloroforme et à y placer les fragments aussitôt sectionnés : à peine quelques mouvements, et l’animal ne bougeait plus, même à la fixation. Chez Phyllodoce maculala les difficultés venaient de ce que l'animal, au lieu de se raïidir suivant l’axe, se contournait non seulement dans le plan médian, mais aussi dans le plan bilatéral, s’immobilisant dans la position de reptation ondulatoire, ce qui était plus grave pour l'orientation ultérieure, vu la petitesse de l'animal, dans la paraffine insuffisamment transparente ; avec l’eau de mer chloroformée, l'hydrate de chloral, la cocaïne, je n’arrivais pas à supprimer tout au moins un fort enroulement dans le plan médian et le déroulement après fixation n’était pas sans difficultés ; comme cette espèce est abondante, que l'élevage en est facile et que tous les individus sectionnés bourgeonnaient, j'en suis arrivé à en fixer directement un grand nombre, ne conservant que les meilleurs.

Fixation. — La fixation sera toujours le point le plus important et le plus grand desideratum de la technique microscopique ; on ne fixe pas les tissus dans l’état de nature, mais dans un état altéré : on doit donc tendre par un traitement moins brutal à diminuer cette altération, et chercher par des réactifs différents donnant des modifications différentes à rétablir d’une façon abstraite l’état primitif. Cependant s’il ne s’agit guère que d'organoiogie on peut se borner à ne demander qu’une conservation approximative des contours des éléments et de leur rapports ; mais il s’en faut encore de beaucoup que ce minimum soit facile à réaliser, tant notre technique est encore grossière.

J'ai essayé, surtout sur AZ//olobophora fœtida, un grand nombre de réactifs ; je me borne à citer sommairement les plus usuels ; c’est ici surtout qu'il faut se rappeler qu'il n’est pas question de conclusions générales, mais seulement spéciales aux animaux soumis aux essais. L'action coagulante delachaleur, qui m'a d’ailleurs semblé meilleure employée intense (eau bouillante) et très courte, m’a quelquefois donné d’assez bonnes fixations ; mais le procédé est très infidèle, et la composition des noyaux est aliérée ; il peut rendre des services

lorsqu'il est utile d’avoir les tissus vierges de toute substance étrangère. L'alcool aux divers titres donne ordinairement de très mauvais résultats. Le formol à 5°], de la solution d’aldéhyde est insuffisant ; la structure chromatique est également effacée. L’acide acélique pur, quelques minutes ou prolongé vlus longtemps est assez mauvais ct par gonflement donne peu de visibilité. L’acide picrique, et ses dérivés liquides picrosulfuriques (liq. de KLEINENBERG), picronitrique et picroacétique (1 °/, d'acide acétique), laissent les éléments se déformer. Le bichlorure de mercure (sublimé) et la plupart de ses dérivés, ratatinent un peu et brisent les tissus. L’acide osmique en vapeur donne de hons résultats sur des éléments libres qu’il immobilise instantanément, mais à cet état il n’est pas applicable aux pièces ; sa solution aqueuse à 1°/,, ou le mélange à parties égales de cette solution avec l'alcool absolu, sont peu pénétrants, et noircissent la périphérie ; on sait d’ailleurs qu’au point de vue cytologique, l'acide osmique employé seul a l’inconvénient de masquer la structure nucléaire. Les solutions à divers litres d'acide chromique sont insuffisantes. Il en est de même des solutions de bichromates de potasse ou d’ammoniaque, avec ou sans introduction d'acide osmique‘ou de sulfate de cuivre, qui de plus conservent mal la structure du noyau. Les combinaisons de solutions chromique, osmique et acétique (liquide de FLemmin@ et variantes), qui ont été employées ailleurs avec tant de succès surtout pour la cylologie, m'ont donné souvent et dans des conditions variées de composition et de durée, d'assez mauvais résultats chez les Annélides, ce qui avait déjà été noté par d’autres observateurs; je dois dire cependant avoir eu quelques préparations assez bonnes, en employant, comme l'avait fait BerGn dans ses études d'embryogénie des Lombrics, le liquide de FLEMMING pendant peu de temps et le faisant suivre du chlorure de platine. Quant au chlorure de platine employé d'emblée seul ou mélangé à l’acide chromique, il m'a paru insuffisant.

Un réactif qui m'a fourni de bons résultats est le liquide chromonilrique alcoolique (liquide de PERENYI), agissant pendant une ou plusieurs heures ou même plus longtemps sans inconvénient ; les éléments sont bien fixés dans leur forme et leurs rapports, la structure nucléaire est conservée et on voit les diverses phases des mitoses dans les éléments en division ; d'autres observateurs ont aussi vanté ce réactif dans des recherches sur les Annélides. J'ai

employé la formule primitive de PERENYI ou sa formule modifiée pour certains cas particuliers : je n’ai pas vu de différence. Je m'étais aussi servi d'un mélange alcoolique d’acide rtrique et de bichlorure de mercure, qui m'a donné de moins bons résultats, entachés des inconvénients atténués du sublimé. J'en suis donc arrivé à penser que dans le liquide chromo-nitrique le principe actif était l’acide nitrique ; il m'a donné les mêmes excellents résultats, d’ailleurs aux titres de concentration les plus divers; c’est ainsi qu'une de mes meilleurs préparations du bourgeon de Nephthys, même au point de vue histologique, a été obtenue avec l'acide nitrique au titre À agissant seulement quelques minutes, car à ce degré de concentration les tissus sont facilement rendus cassants. On sait d’ailleurs que l'acide nitrique surtout au —- a été très préconisé pour les structures nucléaires surtout par ALTMANN et que la valeur de ce réactif a été confirmée par FLEMMING même pour les titres élevés. La conservation de l'alcool dans ce fixateur au titre & m'a paru plutôt favorable. Ainsi tout en reconnaissant les bons effets du liquide chromo-nitrique alcoolique, je crois pouvoir simplifier, et donner (du moins pour les Annélides observées)

la solution alcoolique d'acide nitrique, au + ou à un titre un peu plus fort, comme le meilleur fixateur.

Coloration. — En général les pièces se colorent plus facilement en masse, alors qu’elles n’ont pas encore subi le traitement relatif à l'inclusion, mais elles se teignent d’une façon hétérogène, le pourtour étant exagérément coloré alors que le centre ne l'est pas encore ou à peine ; cependant cet inconvénient est très atténué pour certaines substances très colorantes, et pour la même substance les solutions alcooliques sont ordinairement plus pénétrantes. Les colorations sur coupes sont préférables parce qu’elles se font d'une façon homogène, et qu'on peut les surveiller au microscope ; l’action ordinairement moins énergique de la matière colorante est d’ailleurs compensée par la très faible épaisseur à pénétrer. D'un autre côté il est utile pour le contrôle pendant le sectionnement et la manipulation des coupes de paraffine, que les coupes de la pièce y soient rendues visibles par leur coloration.

Les solutions alcooliques sont les plus avantageuses pour la colo-ation en masse, par leur plus grande pénétration et par une meilleure conservation de la pièce pendant son séjour prolongé

dans le bain colorant ; mais par leur volatilité elles sont incommodes pour le traitement des coupes. Les solutions aqueuses sont préférables pour les coupes ; il sera commode de faire flotter par capillarité à la surface du bain contenu dans un verre de montre, la lamelle portant les coupes collées à sa face inférieure. Les solutions g/yceriques. ne s'évaporant pas, peuvent être disposées par gouttes sur le verre qui porte les coupes ; mais ces solutions m'ont paru avoir pour les diverses matières colorantes une énergie de coloration bien moindre que les solutions aqueuses. J’ai donc employé presque toujours une solution alcoolique pour la coloration en masse, une solution aqueuse pour Ja coloration sur coupes.

L'état dans lequel le fixateur laisse les tissus influe considérablement sur la coloration, et notamment sur l'élection nucleaire. Ainsi avec les colorants au carmin ou à l’hématéine, cette élection se produit bien dans les tissus frais, ou dans les tissus fixés par la chaleur, les alcools, les acides acétique ou formique, l'acide chromique faible, l'acide osmique en vapeurs à action peu prolongée, acide osmique ajouté en très petite quantité à la matière colorante, le bichromate de potasse ou d’ammoniaque avec ou sans un peu d'acide osmique ; l'élection était faible surtout dans certains tissus avec les fixateurs mercuriques ou picriques ; l'acide nitrique seul ou associé à l’acide chromique, même par une action très courte et malgré des lavages prolongés et des neutralisations de l’acidité, en différenciant les structures nucléaires, ne laisse plus le colorant se porter que sur le nucléole, un peu aussi sur le réseau chromatique et la membrane nucléaire, mais pas assez pour bien faire ressortir par la couleur le noyau dans son ensemblé ; l'acide osmique en solution gêne encore plus la coloration surtout par le carmin, en sorte que l'emploi de la safranine est le corollaire de celui du liquide chromo-acéto-osmique. Ainsi les meilleurs fixateurs gênent la coloration élective.

L'élection directe ne se produisant pas avec le meilleur réactif l'acide nitrique, j'étais conduit à employer la méthode indirecte par une décoloration, portant sur le plasma cellulaire avant d'atteindre le noyau; ce plasma était ensuite coloré par une substance d’une autre teinte. Dans cette coloration combinée, l'élection peut être conservée surtout parce qu'avec certaines matières colorantes, le noyau déjà teint est réservé dans la seconde coloration lorsqu'elle west pas poussée trop loin. Le choix des deux colorants est basé sur une étude préalable des principales substances colorantes; celte

étude se rapporte surtout aux pièces fixées par les acides nitrique ou chromonitrique.

Carmin. — Un des grands avantages du carmin est sa fixité devant les milieux ordinaires, intermédiaires ou conservateurs ; il ne donne pas assez de visibilité aux détails, mais son éclat est au contraire avantageux pour faire ressortir certains points sur un fond différent ; à cet égard il paraît tout indiqué pour la coloration élective des noyaux.

Le carmin boraté alcoolique est un colorant assez énergique et assez pénétrant : peur des fragments d’Annélides, après 1/2 à 1 jour uivant la dimension, la coloration est forte et uniformément répartie ; d’ailleurs, grâce à l'alcool, il n'y a pas d’inconvénient à y laisser les pièces plus longtemps. Le carmin au lithium et le carmin ammoniacal produisent également une forte coloration, mais ils n’ont pas d'avantage sur le carmin boracique, et ils ont l'inconvénient de ne pas être conservateurs. Le picro-carmin est beaucoup moins énergique et il pénètre difficilement ; même avec les réactifs les plus favorables, il n’a pas les propriétés d'élection nucléaire qu'il présente chez d'autres: animaux; par contre, il possède une certaine élection pour les membranes basales et la substance conjonctive, qui sont teintes en rose alors que le reste n’a encore que la teinte jaune de l'acide picrique. Le carmin alune donne une coloration extrêmement faible même par un séjour prolongé, et sur coupes ; le carmin aluné acétique est encore d'action très lente ; l’acide osmique qu’on a proposé d’ajouter en très pelite quantité au colorant m'a paru donner un peu plus d'intensité à la coloration, sans la rendre suffisante. Le carmin acètique en masse pénètre assez mal donnant une coloralion exagérée à la périphérie ; sur les coupes, la coloration est rapide, mais sans élection suffisante, ot l’acide les plisse lorsqu'elles ne sont pas très bien collées. Le carmin chlorhydrique s'est montré très peu pénétrant malgré un séjour prolongé. — De cet examen résulte la supériorité incontestable du carmin boraté alcoolique comme colorant total, par sa pénétration, son action énergique, assez rapide et finalement assez uniforme, et ses propriétés conservatrices.

La décoloration a été surtout étudiée sur des pièces ou des coupes colorées au carmin boraté alcoolique. Une solution chlorhydrique doit être faite avec de l'alcool à 70°), ; j'ai étè conduit à employer,

comme plus rapide et sans inconvénient, une solution à 1°/, plus forte que celle qui est habituellement indiquée ; en masse, on renouvelle la solution jusqu’à ce qu'il ne sorte plus guère de nuages colorés, ce qui exige en moyenne une heure pour des fragments d'Annélides; on pourrait prolonger davantage car la coloration nucléaire ne s’efface que lentement ; d’ailleurs si on voit sur la coupe que lélection est insuffisante, on peut la traiter par la solution chlorhydrique, et la décoloration est presque instantanée, pour n’atteindre ensuite que lentement les noyaux ; ici le séjour prolongé serait dangereux, car si la coupe n’est pas bien collée l'acide détermine son gonflement et son plissement. L'acide acélique même pur ne décolore pas aussi rapidement que cette solution alcoolique d'acide chlorhydrique. L’acide chromique faible décolore tout ensemble sans déterminer d'élection.

Hématéine. — On sait que l'hématéine est la substance colorante d’un brun jaunâtre que donne l’'hématoæyline par oxydation ; c’est cette hématéine elle-même qui en présence de certains réactifs donne sur les tissus des dépôts très colorés, de teinte variée suivant le réactif, qui ne seraieht autres que des laques (P. MAYER).

Les colorants usuels de ce groupe ont pour base l'alun et produiraiont des laques aluminiques. Parmi les anciennes solutions : celle de BœHMER ne m'a donné que des résultats assez inégaux comme teinte et comme élection ; la solution de DELAFIELD a une action énergique, et j'ai vu des coupes ainsi traitées se maintenir colorées plusieurs années dans la glycérine; la solution glycérique et acétique de ErrLicH me paraît se conserver indéfiniment, elle ne donne pas de coloration exagérée, elle est un peu élective, elle a l'avantage de pouvoir être déposée sur les coupes sans crainte d'évaporation; des solutions nouvelles aqueuses (hémalun) et alcooliques (hémacalcium), ont été établies rationnellement (P. Mayer) sur la connaissance actuelle de la composition des colorants dérivés de l’hématoxyline. Toutes ces solutions à l'alun ne m'ont donné qu'une élection et souvent une définition insuffisantes. Des vapeurs d’acide osmique agissant après le colorant m'ont servi dens certains cas à accentuer les limites des éléments.

La production de laques chromiques et ferriques est, à mon avis, bien préférable au point de vue de l’intensité et de la netteté de la coloration ; celles-ci sont produites par l’action successive sur les

tissus de l’hématéine et de sels de chrome ou de fer. Nous examinervns dans un paragraphe spécial l’action de ces sels métalliques, souvent à la fois de mordonçage et de virage, sur les colorations à l'hématéine

La simple teinture, destinée à être virée, peut se faire, comme on sait, soit avec une solution aqueuse d’hématéine toute préparée, soit avec une solution d'hématoæyline « mürie », c’est-à-dire colorée par son oxydation en hématéine, ou à la longue par l’action de l'air surtout à la lumière, ou instantanément par l’action de traces de permanganate de potasse ajoutées jusqu’à ce que la solution devienne rouge foncé ; de telles solutions colorent en jaune d'une façon plus intense et plus rapide que les solutions fraîches d’hématoxyline ; cependant au virage la différence est moins grande. Dans les solutions trop vieilles, trop mûries, l’hématéine elle-même s'est en partie transformée, la coloration et surtout le virage se font mal. Un petit cristal de thymol empêcherait la formation de champignons, qui peuvent prendre quelque part à cette altération, bien qu’elle ne soit pas ainsi complétement évitée. On peut colorer en masse, mieux alors avec une solution alcoolique, mais on obtient souvent ainsi des colorations excessives à la périphérie ; et pour avoir une bonne coloration hématique il me paraît nécessaire d'opérer sur les coupes pour pouvoir la surveiller.

Je ne suis pas arrivé davantage à une bonne élection par la méthode indirecte avec les colorants hématiques ; sur des coupes teintes par l’hématoxyline aqueuse ou l’hématoxyline de ExrLicx l'acide chlorhydrique à 1°], en solution alcoolique ou l'acide acélique décoloraient d’une façon presque uniforme; des pièces colorées à l'hématoxyline de DELArELD et traitées par la glycérine formiquée résistaient davantage à la décoloration, mais également d'une façon uniforme. L’alun de fer et d'ammoniaque agissant sur des coupes colorées très fortement (par mordançage avec ce même réaclif) décolore progressivement (HEIDENHAIN), mais la décoloration n’est pas régulière dans toute la coupe, et tout en me rendant bien compte par ces essais même de l'excellence et de la commodité de cette méthode pour mettre en évidence certains détails de structure cellulaire, je ne l'ai pas trouvée applicable à une coloration élective d'ensemble.

Couleurs d’aniline. — Les couleurs d’aniline ont un grand pouvoir colorant ; parmi celles que j'ai étudiées, la sa/ranine, le

Bleu lumière et l'acide picrique se sont montrées très pénétrantes ; c'est ainsi qu'avec le picrocarmin l’intérieur est déjà jaune alors que la coloration rouge n’est encore que superficielle ; le vert de méthyle, le bleu d’aniline, le bleu de méthylène, la cyanine (bleu de quinoléine), le violet de méthyle, la vésuvine {brun Bismarck), ont montré une action bien moins rapide.

Un inconvénient des couleurs d’aniline est le peu de stabilité de leur teinture vis-à-vis de l'alcool ; il n’en est cependant pas ainsi de certaines d’entre elles, solubles surtout dans l’eau, notamment le Bleu de méthylène et le Bleu lumière ; il est vrai que la safranine après mordançage par le permanganate de poiasse (HENNEGUY) est beaucoup plus stable vis-à-vis de l'alcool et qu'il en est un peu de

même du vert de méthyle par action de l'iode (HeiDENHAIN) ; d'autre part, l'acide picrique , facilement enlevé par l'alcool, continue cependant à teindre le contenu des vaisseaux.

Au point de vue de l’effet de leur coloration, les couleurs d’aniline, malgré la vivacité de leurs teintes, m'ont toujours paru donner plutôt un éclat plus ou moins agréable à la totalité de la coupe qu’une bonne définition des éléments et de leurs rapports ; notammentje n'ai pu obtenir d'élections nucléaires suffisantes et surtout suflisamment précises. Le but est ici différent de celui de la cytologie, où certaines de ces couleurs sont employées avec succès à faire ressortir exclusivement tel ou tel détail de structure, surtout dans des éléments spéciaux ; c’est ainsi que je n’ai pas trouvé à utiliser le mélange EurLicu-BioNDI-HEIDENHAIN , même après traitement préalable par l'acide acétique et par l'iode.

Quantà l'élection par la méthode indirecte, décoloration par l'alcool absolu, je ne l’ai pas trouvée assez précise, sauf pour les nucléoles et les contenus glandulaires ; et d’ailleurs la coloration ultérieure par l’hématoxyline la masquait complètement. L'élection inverse de décoloration nucléaire produite par la glycérine sur les coupes teintes par la Cyanine ou le Bleu lumière m'a paru assez nette, et propre à ne pas masquer la coloration préalable du noyau par le carmin.

Colorants divers. — Le carmin d'indigo, ensolution aqueuse, mieux avecde l’acide oxalique, colore peu sur coupes et sans élection, et se décolore un peu par l'alcool ; mais c’est la substance colorante qui m'a paru le mieux réserver les parties, par exemple le noyau, teintes par le carmin, dont la coloration ne se trouve en rien masquée;

il en résulte d'assez belles différenciations ; la coloration et la pénétration sont plus intenses qu'avec le Bleu lumière qui donne, moins nettement aussi, des résultats analogues.

Le Kernschwarz donne une teinte grise, mais moins intense et moins définissante que l'hématoxyline avec virage.

Renforcement. — On peut renforcer la coloration par deux procédés, qu’il sera d’ailleurs avantageux de combiner : le mordançage qui a pour effet d'accélérer la coloration, et le virage pour donner une imprégnation plus foncée et surtout plus définissante. Les agents de mordançage et de virage sont des sels métalliques ; certains d’entre'eux servent à la fois aux deux usages, mais ils ont la plupart aussi un effet ultérieur de décoloration qui force à limiter dans le virage le titre de leur solution et de la durée de leur action.

Les sels de fer : alun de fer et d'ammoniaque à un très haut degré, sulfate de fer, perchlorure de fer, citrute de fer et d'ammoniaque à un faible degré sont des mordants pour l’hématéine; pour le carmin lui-même l’alun de fer est mordant et aide à la pénétration. — L'alun de fer conserve aux coupes une teinte bleue et le mordançage qu’il a produit gène le virage par le bichromate de potasse ; l’alun de fer vire les colorations au carmin, donnant une teinte plus foncée pour le carmin boracique et une teinte grise pour le carmin acétique (ZacHarIAs, avec le citrate de fer et d’ammoniaque) : J'ai trouvé pour le carmin acélique viré la coloration insuffisante, le virage nul dans les parties superficielles trop colorées, et quant au citrate je l'ai trouvé bien inférieur à l’alun de fer pour le virage. — Par une action à peine prolongée l’alun de fer ne tarde pas à faire disparaître la coloration hématique ; cette décoloration progressive et surveillée d'une coloration extrêmement forte, due au mordançage par ce même alun, (HERDENHAIN) est une méthode excellente et commode en cytologie, mais qui n’est guère applicable à une préparation d’ensemble, à cause de l'inégalité de décoloration dans l'étendue de la coupe. L’alun de fer efface aussi peu à peu le carmin.

Le bichromate de potasse est un mordant pour l’hématéine, quoique bien moins énergique que l'alun de fer; et il a l'avantage sur d’autres mordants que la coloration hématique, lorsqu'elle n’est pas trop forte, ne masque pas la coloration au carmin des noyaux. Le bichromate de potasse est en mème temps un excellent agent de virage après coloration par l'hématoxyline (HE&IDENHAIN), donnant aux

coupes une teinte très définissante, grise (sauf mucus bleu), sans donner d’opacité, sauf aux fibres musculaires adultes ; les coupes colorées à l’hématéine m'ont paru virer beaucoup moins bien. Le bichromate de potasse en solution concentrée décolore la laque chromique d'hématéine provenant du virage et le carmin, mais la décoloration n’est pas instantanée : donc vis-à-vis du carmin, elle n'empêche en rien un bain de mordançage pour la coloration hëmatique, et pour le virage de celle-ci elle exige seulement la surveillance des coupes ; mais mieux vaut encore, surtout pour le virage, se servir de solutions très étendues, environ au 1/50 de la solution saturée, (quelques gouttes de solution concentrée dans l’eau d’un verre de montre), dont l’action de virage est plus lente (environ une demi-heure), mais dont l'action plus lente encore de décoloration nese laisse voir que longtemps après (au moins quelques heures). Pour éviter la décoloration, on peut substituer le chromate neutre de potasse (HEIDENHAIN) même sans inconvénient en solution concentrée; mais je trouve qu’il produit souvent un mauvais virage bleu, et que, si les noyaux sont colorés au carmin, la teinte rouge est assez facilement masquée, ce qui diminue la différenciation élective. En somme le bichromate de potasse m’a donné d'excellents résultats comme mordant et comme vireur; sià la simple vue ou par l'observation microscopique, on s'aperçoit après virage que la coloration hématique est insuffisante, on peut replacer les coupes dans la solution d’hématoxyline, qui par suite du mordançage qu'a produit le virage, ne les colorera que mieux ; j'ai constaté d’ailleurs, que, dans le même temps, un simple bain d’hématoxyline entre deux bains de bichromate avait une action moins rapide qu’une telle succession alternante, répétée plusieurs fois.

Le permanganate de potasse même à1°/, est un mordant énergique pour l’hématéine, et aussi pour la safranine (HENNEGUY). Il ne vire pas et même à un titre beaucoup plus faible il fait disparaître la coloration hématique virée par d’autres agents: les noyaux gardent d’abord la teinte, mais la décoloration est très irrégulière dans l'étendue de la coupe ; il est vrai qu’il n'empêche pas le virage au gris par le bichromate de potasse ; seulement il ne pourrait être employé comme mordant pour l’hématoxyline sur des coupes à noyaux préalablement colorées par le carmin, parce qu'il décolore celui-ci instantanément.

Les sels de cuivre, acétate en solution forte (BENDA) ou sulfate

à 1°/, (ViALLANES), peuvent servir de mordants et de vireurs ; cependant je trouve que la teinte bleue donnée par eux au virage est moins bonne que la teinte grise due au virage par le bichromate, il est vrai que celui-ci peut être employé pour virer au gris après mordançage par les sels de cuivre; mais après ce mordançage la coloration hématique masque plus ou moins sur les noyaux la coloration au carmin; le sulfate de cuivre concentré efface le carmin, mais étendu l'effet n’est pas sensible.

Coupes en série. — La méthode de la paraffine se trouvait naturellement indiquée pour des recherches qui exigeaient des coupes en séries, au point qu’à certains niveaux l’absence d’une seule coupe eût été funeste ; d’ailleurs, avec les précautions nécessaires, ce procédé ne m'a pas paru amener d’altérations notables par suite du ratatinement dû à la déshydratation et au chauffage prolongé à une température un peu élevée dans le bain de paraffine ; ces inconvénients sont réels, mais bien inférieurs aux avantages, et en général ont évidemment été très exagérés, eu égard aux excellents travaux dus à cette méthode aujourd’hui si employée.

Paraffines. — Je me sers pour la pénétration d'une paraffine fusible vers 45° ; la température à laquelle la pièce est maintenue dans le bain est ainsi aussi peu élevée que possible, car les paraffines plus molles donnent de mauvais résultats pour le sectionnement ; on verra à propos de la confection et du collage des rubans les raisons qui m'ont fait adopter pour l'inclusion une paraffine plus dure, fusible vers 55°. La paraffine doit tenir sa fusibilité de sa nature chimique elle-même, et non de l'addition de dissolvants reconnaissables à l’odeur ou d’autres mélanges: ils lui feraient perdre de son homogénéité, et de sa translucidité qui n’est déjà que trop faible. On recommande ordinairement la paraffine ayant déjà servi, en sorte qu'il est bon de reprendre les déchets de la taille des blocs ; on prépare même souvent des paraffines fortement recuztes d'avance, jusqu'à leur donner une teinte un peu ambrée et une légère odeur empireumatique ; l'expérience m'a montré qu'une telle cuisson, lorsqu'elle était exagérée, donnait de mauvais résultats par un plus grand écrasement à la coupe ; seulement faible, cette cuisson, à l'inconvénient d'enlever de la translucidité, et, si ce procédé améliore réellement beaucoup de paraffines, j'ai trouvé de bons échantillons qui, translucides et non recuits, ne le cédaient en

rien aux autres, surtout en leur appliquant la trempe, comme ilsera dit plus loin. J'ai renoncé à la double pénétration successive de celloïdine et de paraffine, dont le but serait de maintenir adhérentes toutes les parties de la coupe par la persistance de la celloïdine après dissolution de la paraffine : le collage m’a paru assez parfait pour permettre de supprimer cette précaution, qui était une assez grande complication et qui augmentait la dureté de la pièce par rapport à la paraïfine ambiante.

Dissolvants. — La paraffine se dissout bien dans le œylène, le {oluène, le chloroforme, l'éther, moins facilement dans les essences de cèdre, de bergamolte, de cajeput.

Pour la pénétration des pièces, l’éther et le culoroforme, plus volatils, s'échappent plus facilement de la paraffine fondue ; il faut cependant pour débarrasser complètement un bain, même peu profond, chauffer notablement plus haut que leur point d’ébullition, ce qui n’est possible, sans élever trop la température que pour l'éther ; on peut ainsi arriver avec ce dernier à produire une pénétration très rapide; mais pour ces deux dissolvants des bulles peuvent rester engagées dans les tissus et produire des cavités ; de plus ils n’ont pas l'avantage des autres dissolvants de montrer par éclaircissement le moment où leur pénétration préalable dans les pièces est complète. Avec les essences de cèdre et de bergamotte, qui peut-être ratatinent moins, la paraffine m'a paru pénétrer les pièces plus lentement qu'avec le xylène ; même, pour certains échantillons d'essence de cèdre,,la pièce bien imbibée et éclaircie, se pénétrait à peine de paraffine. Dans le cas où les pièces imbibées devraient séjourner à l'air, par exemple pour une orientation préalable hors du bain de paraffine, les essences de bergamotte ou de cèdre seraient indiquées par leur faible volatilité ; on pourrait encore d’ailleurs remplacer ultérieurement ces essences. En somme, tout au moins dans les cas ordinaires, le æylène me paraît préférable.

Pour débarrasser les coupes de la paraffine, la volatilité du chloroforme et de l'éther doivent les faire rejeter, et le xylène, qui d’ailleurs dissout presque instantanément, me paraît encore ici préférable.

Récipient. — Au heu de verres de montre à fond courbe et d’où on ne détache la pièce qu’en chauffant un peu, ou de boîtes à

parois métalliques mobiles qui laissent fuir bientôt la paraffine fondue, ou de boîtes confectionnées en papier, encore perméable, ou en feuilles métalliques, qui laissent déborder par ascension capillaire dans les plis, je trouve plus commode l'emploi de petites capsules en étain pour (le bouchage des bouteilles), de prix extrémement minime, que l’on déchire l'inclusion faite: on range et on oriente les pièces sur le fond plat, dans le bain même de pénétration, et on peut faire, comme repères provisoires, des entailles sur le bord de la capsule ; les dessins qui se trouvent ordinairement sur le fond des capsules et sur lesquels se moule la paraffine peuvent aider à l'orientation; de même dans la méthode d'orientation préalable avec fixation par le collodion (PATTEN, WoopworTH), on peut se servir de capsules à fond quadrillé, ou de petites lames d’étain pareillement impressionnées.

Pénétration : chauffage. — Les capsules contenant le bain fondu, sont, plus simplement que dans une étuve, placées sur une plaque chaufjante, donnant des températures graduées en s’éloignant de l'extrémité chauffée; si on désire avoir dans une très petite longueur de grandes différences de température, on prendra une plaque de tôle, le fer étant moins conducteur ; mais en général le cuivre est préférable, etil n’est pas nécessaire de donner à la plaque une grande longueur pour trouver successivement les températures d’inclusion et de pénétration, et aussi de dessiccation pour le collage des rubans. Le chauffage se fait avec une petite flamme de gaz sur une canalisation munie d’un régulateur de pression, ou d’une petite lampe à essence, et on règle la flamme à une hauteur déterminée : le régime établi, on place la capsule, par tàätonnement ou par habitude, de manière qu'à l'extrémité la moins chauffée, la paraffine reste solide ; dans les conditions indiquées, le régime est assez stable pour qu'il ne soit guère nécessaire de surveiller qu'à la chute de la température ambiante à la fin du jour, pour rapprocher la capsule si la limite entre la paraffine fondue et non fondue ne se maintient pas au même niveau.

Dans certains cas cependant, pour ne pas exiger une surveillance trop prolongée et afin d'éviter l'emploi d'une étuve plus longue à régler, j'appliquai à la plaque, ou mieux encore à une boîte métallique couverte, le régulateur suivant relatif au chauffage par une flamme quelconque. Les variations avec la température du volume

d’un fluide (eau ; ou air plus sensible, mais influencé par les variations de pression atmosphérique), déplacent du mercure dans un dé faisant partie d’une petite balance ; celle-ci porte aussi une valve de mica qui provoque la compensation à la moindre variation, en admettant plus ou moins le flux de chaleur sur le bord de la plaque. Pour plus de détails sur la construction simple, et le fonctionnement de ce thermostat, je renvoie à la note que j'ai publiée à ce sujet (1).

Pénétration : durée. — La durée du bain de paraffine pure ne varie pas seulement avec les dimensions de la pièce ; par exemple, tandis qu'une heure de ce bain suffisait pour des fragments d’A{olobophora fœtida, pour des morceaux de Nephthys, sans doute à cause de l’épaisse cuticule malgré son interruption aux deux surfaces de section, la pénétration n’était pas toujours complète après trois heures.

L'emploi du vidre, en débarrassant rapidement de l’essence, peut abréger la durée ; mais c’est là une complication qui ne paraît pas préférable à la prolongation du bain de paraffine fondue.

Inclusion. — Les pièces, étant saisies avec un pince légèrement chauffée, sont transportées dans le bain de paraffine fusible à 55°. Elles y sont orientées définitivement avec une aiguille légèrement chauffée.

Après quelques minutes seulement de séjour dans ce bain, la flamme est éloignée et de l’eau froide est injectée sous la capsule afin de solidifier la paraffine au fond et d'érnmobiliser les pièces dans le cas où leur déplacement serait à craindre pendant le transport ; puis immédiatement la capsule est appliquée à ia surface d’une eau froide; lorsque la pellicule, dont on hâte en soufflant la formation, à la surface de la paraffine est suffisante, on introduit un peu d’eau froide, et enfin on plonge complètement la capsule ; cette #empe a pour effet, par une solidification rapide de donner un bloe bien homogène ; mais l'introduction de l’eau est un peu délicate : si la pellicule est trop mince, l’eau l’entrouvrant coule au fond du bain y déterminant des vides. Le principal avantage des paraffines cuites est de

(1) Au. Micne. Sur un régulateur de température à flamme quelconque et spécialement son application à une plaque chauffante. — Comptes Rendus Soc. Biologie (Paris), 83 déc. 1892.

se solidifier d’une façon homogène, rendant cette trempe inutile ; mais j'ai indiqué précédemment d’autres inconvénients de ces paraffines, et il suffit d'un peu d’attention pour bien exécuter cette opération.

Bien que les pièces soient situées vers la surface inférieure de la paraffine solidifiée, elles en sont encore séparées par une couche suffisante ; on peut même sans inconvénient gratter un peu pour enlever un léger dépôt d’impuretés, et polir la surface : alors surtout on aperçoit assez la pièce pour failler convenablement le bloc ; ou bien au contraire on conservera les lignes d’orientalion pour effectuer cette opération.

Coupes. — Pour couper les blocs de paraffine j'ai employé un petit instrument, du type des nicrotomes à bascule, relativement léger et facilement transportable, et dont la brièveté du levier n'était pas un inconvénient notable à cause du peu de largeur des pièces à débiter. Les épaisseurs marquées ont été reclifiées par une expérience directe en effectuant un assez grand nombre de coupes, revenant au point de départ, et mesurant l'intervalle maintenant vide entre le tranchant du rasoir et le bord du bloc. Les coupes ont été faites généralement à l'épaisseur de Eu 4

Les raisons qui m'ont déterminé à me servir d’une paraffine d'inclusion fusible à 55°, sont les suivantes : Le bloc ne se ramollit pas et ne se déforme pas à la main pendant qu'on le manipule ; Le sectionnement n'est pas gêné par une température ambiante un peu élevée et il n’est pas nécessaire l’été de refroidir en plongeant préalablement dans l’eau fraiche ou en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool ; si le ruban, souvent électrisé par le travail de section de la pièce (l'électrisation ne se produit pas dans la partie du ruban, où il n'y a que de la paraffine, la pièce n’étant pas encore entamée ou étant déjà épuisée) vient à se rompre et vient par attraction s'appliquer sur la main, il ne s’y ramollit pas et on peut l'en dégager, ce qui est impossible pour une paraffine fusible à 45° ; enfin lorsque la pénétration est incomplète, il m'a semblé que le ruban était moins défectueux avec une paraffine dure.

Il est vrai que par contre une plus grande dureté de la paraffine est généralement considérée comme provoquant l’enroulement des coupes ; c'est ce que l’on observe pour beaucoup de paraffines, lorsque la température extérieure est basse, et ce à quoi on remédie

en chauffant un peu le bloc; mais alors que ces paraffines ont déjà à 12° sv sl , une tendance à l’enroulement pour = à = "/.., si on ne les chauffe

pas un peu, j'ai trouvé des échantillons de paraffine fusible à 55°, qui, à cette même température ne présentait pas cet enroulement, non seulement pour toutes les épaisseurs données par le microtome, mais même pour des plaquettes découpées à 1/7 "/,.

Les coupes de paraffine éprouvent toujours un certain écrasement, moindre d'ailleurs pour les blocs contenant une pièce, que pour ceux de paraffine pure et par là moins durs ; cet écrasement ne dépend pas cependant seulement du degré de mollesse de la paraffine, et ne tient pas uniquement aux plis puisqu'il n’est pas complètement annulé par le déplissement.

Les plis se forment seulement lorsque la coupe atteint la pièce, parce que celle-ci est plus dure ; il y a donc avantage à ce point de vue à employer une paraffine de pénétration plus molle, que la paraffine d'inclusion : je me suis servi à cet usage d’une paraffine fusible à 45°, les paraffines de fusibilité plus inférieure devenant trop molles pour la coupe.

Les coupes successives adhérent et forment rwban sans tendance à l’enroulement, même pour certaines paraffines fusibles à 55°, surtout lorsque les bords parallèles sont bien rectilignes de manière à permettre le contact sur toute la largeur ; pour plus de sûreté on peut d’ailleurs avec une aiguille chauffée enduire une des faces d’une légère couche de paraffine très molle. Il n’est pas nécessaire que le bloc de paraffine soit beaucoup plus épais que la pièce, ce qui a l'avantage de permettre"de ranger un plus grand nombre de coupes et de Les parcourir plus facilement sous le microscope. Quant aux bords latéraux, je taillais toujours l’un d'eux obliquement ce qui, par la direction des dents obtenues m'évitait toute erreur dans l'orientation ultérieure des fragments du ruban. Il est préférable de tenir le ruban par une extrémité, soulevé de manière à frotter le moins possible contre le rasoir.

Collage. — Je colle les coupes sur la Zamelle et non sur la lame, trouvant à ce procédé plusieurs avantages : 1° Il est plus facile de découper le ruban en fragments correspondant aux dimensions de la lamelle ; seulement il faut remarquer que pour pouvoir lire ultérieurement dans le sens habituel, il faut préalablement retourner

les fragments bout pour bout: 2° à cause de ses dimensions plus petites la lamelle est plus maniable : on peut donc placer les réactifs dans des vases plus petits, par exemple des verres de montre, et, profitant de la légèreté de la lamelle et des actions capillaires, la laisser flotter renvervée à la surface des réactifs aqueux : 3° on peut sur une même préparation disposer sur la lame plusieurs lamelles portant des objets à comparer différents d’origine ou de traitement : 4 les rayons lumineux n'ont à traverser que la lamelle et il n’y a pas de crainte qu'aux forts grossissements la distance à l'objectif soit trop grande par une trop forte épaisseur du milieu conservateur. L’inconvénient du procédé est la fragilité plus grande des lamelles, mais l’habitude le réduit considérablement, et, à part le séjour dans les réactifs, la lamelle est maniée fixée à une lame par capillarité, due à l’interposition d’une gouttelette d’eau.

Les procédés anciens par l'emploi de substances collantes sont infidèles et incommodes, à part le procédé de Mayer par l’albumine glycérique coagulée par la chaleur et par l'alcool, qui avec une certaine sûreté, a le mérite de la rapidité ; mais cette méthode a le grave inconvénient d'introduire des substances étrangères, qui, outre qu'elles salissent les préparations, peuvent, coagulées et colorées (dans le cas de coloration sur coupes) donner lieu à des confusions.

Le procédé idéal, à mon avis, est le collage par dessication, perfectionnement de la méthode de GAULE : le ruban étant disposé sur un liquide qu'il ne mouille pas, l’évaporation de ce liquide attire la paraffine contre le verre et l'y fait adhérer. Le liquide employé primitivement par GAULE était l’a/coo!, mais il s’évapore trop vite, j'ajoute que !les rubans sont plus fragiles par suite du décollement plus facile des coupes successives ; l’eau réussit bien mieux, elle a cependant sur l’alcool le désavantage de s’étaler moins bien à la surface du verre, surtout lorsque cette surface n’est pas propre; les bains de nettoyage sont peu efficaces, et l’ébullition dans de l’eau de savon, qui est encore le meilleur de ces procédés ne réussit pas toujours ; j'étais donc, pour utiliser ces lamelles, revenu à l'alcool, en projeltant ensuite l'haleine sur les coupes, ce qui substituait doucement l’eau à l’alcool, en même temps que par ce chauffage les coupes commençaient à se déplisser ; mais je me suis aperçu que le simple frottement de la lamelle entre le pouce et l'index mouillés suffisaient pour forcer l’eau à mordre sur la surface, à condition de

ne pas essuyer ensuite la lamelle, mais seulement de la laver à l’eau ; l'inconvénient de cet état impur de la surface n’est pas pour le collage, que j’ai toujours vu réussir aussi bien, mais pour l’étalement du ruban, gêné par la forme bombée de la surface de l’eau. — Les coupes sont deéplissées en chauffant la lame, qui porte la lamelle avec l’eau et les fragments alignés du ruban ; ces fragments s’allongent par ce déplissement, on doit en tenir compte lors de la fragmentation du ruban. Un chauffage, rapide sur une petite flamme et surveillé en passant le doigt sous la lame, m'a paru le plus avantageux : On arrive ainsi avant la dessiccation à déplisser complètement les sections de la pièce beaucoup plus rebelles que la paraffine, et il se produit sous le ruban moins de bulles provenant de l’air de la paraffine que dans un chauffage lent et prolongé. Si on chauffait jusqu’à fondre la paraffine, le collage, tant qu'il y a assez d’eau, n’en serait pas Compromis, mais les coupes se déplaceraient ; ce risque disparaît par l'emploi d'une paraffine dé pénétration plus fusible que la paraffine d’inclusion ; si la paraffine des coupes fond, celles-ci sont maintenues par la paraffine environnante encore solide. — En touchant le bord de la lamelle avec le bout du manche d’un scalpel, on fait écouler Fexcès d’eau. On peut alors se borner à laisser l'évaporation se produire à l’air ; mais, surtout si la température est basse et si on a employé une paraffine dure, il est plus sûr de chauffer légèrement pour conserver à la paraffine une certaine mollesse et lui permettre d’être attirée par la capillarité contre le verre ; cette condition est très importante : par une simple dessiccation à l’air froid, des coupes faites avec une paraffine à 55° présentaient des insuccès de éollage, qui n'avaient pas lieu pour des coupes d'une paraffine à 45°; un ruban ayant été disposé et traité comme il vient d’être dit, sur la longueur d’une lame, dont une extrémité était un peu chauffée et l’autre froide, les coupes de la première extrémité ont montré un collage parfait, insuffisant pour la seconde. Lorsque l’excès d’eau est enlevé, un chauffage trop élevé empêcherait le collage, probablement parce qu'alors la paraffine après fusion forme épaisseur sous la coupe. Quelquefois, au bout de quelques minutes de dessication à chaud, le collage est déjà suffisant; mais il est préférable si on craint les risques, d’attendre quelques heures. Plus tard, au moment de traiter par un dissolvant, il sera complètement inutile de fondre préalablement la paraffine, comme on le conseille : j'ai toujours omis cette pratique. — Avec les

précautions indiquées, c'est-à-dire pour des coupes bien déplissées et maintenues pour la dessiccation à une température douce, ce procédé m'a toujours complètement réussi ; je n'ai vu parfois quelques coupes se décoller que l'hiver, alors que je n'avais pas appris l'importance d'un léger chauffage pendant la dessiccation. Au contraire les coupes convenablement collées adhèrent à un point tel que je les ai vues supporter l'épreuve d’un jet d’eau tombant d’un fort robinet à une distance de 1 à 2 décim. ; si l’étendue de la surface des coupes est une condition favorable, elle n’est pas indispensable, et je possède des préparations montrant des séries complètes de coupes à peine distingnables à l'œil nu ; après avoir laissé macérer un fragment de ver, je l’ai traité et inclus comme une pièce compacte, les éléments dissociés se sont très bien maintenus en place ; ALTMANN a fait digérer des coupes ainsi fixées, sans voir le moindre déplacement des parties non attaquées ; des coupes bien étalées peuvent être impunément traitées par une Solution alcoolique d'acide chlorhydrique au . dans le but de produire l'élection de la matière colorante. Au contraire, des coupes mal étalées pourraient se décoller par agitation, et surtout ne supporteraient pas le traitement par la solution chlorhydrique, dont l'effet serait alors d’augmenter les plis — Certains auteurs ont cru pouvoir attribuer leurs insuccès à l'emploi de fixateurs chromiques; je n'ai pas d'observations détaillées à ce sujet, mais je ferai remarquer que le liquide chromo-nitrique avec lequel la plupart de mes pièces ont été fixées est un fixateur chromique. Je ne serais pas étonné, d’après mon expérience personnelle, que ces explications, comme d’autres semblables auxquelles je m'étais d’abord arrêté dans quelques cas d'insuccès, fussent illusoires, et que la vraie cause résidàt dans le mode opératoire. En tout cas, il y a un fait : sur un grand nombre de mes préparations, dont certaines contiennent près de deux cents coupes, il n’y a pas de vides. —Je ne vois donc pas d'utilité à introduire de la gélatine dans l'eau, même en l’employant comme

HENNEGUY au x avec une trace de bichromate de potasse au

moment de s'en servir pour rendre insoluble, avec l’aide de la lumière, la mince couche qu’elle formera ; même à cette dose se présentent encore les inconvénients indiqués plus haut pour l’addition de substances collantes ; d’ailleurs, si le déplissement était imparfail, l'efficacité du procédé serait encore limité. — La

méthode de la simple dessiccation me paraît donc parfaite comme méthode normale de collage des coupes: sûre lorsqu'elle est bien employée, propre et n’altérant pas, élégante ; l'emploi de l’albumine étant réduit aux essais rapides.

Milieux conservateurs. — Avec des coupes assez colorées pour ne pas craindre un fort éclaircissement, les résines sont certainement lo milieu conservateur le plus commode : aussi me suis-je presque toujours servi de résine d'Ammar (incolore, non teintée comme le Baume de Canada) dissoute dans le xylène ; je ne lui ai pas reconnu le prétendu inconvénient d’une fragilité plus grande. La résine doit être dissoute dans un liquide volatil, sinon elle reste indéfiniment pâteuse et la préparation est peu maniable : par exemple l'essence de bergamotte, dont j'indique plus loin la très grande commodité pour le traitement antérieur, doit être soigneusement chassée par le xylène ; par contre le chloroforme employé comme dissolvant est gênant par sa trop grande volatilité. ;

La glycérine, utile parfois parce qu’elle n’éclaircit pas d'une façon exagérée, exigé des opérations compliquées de bordure ; la gélatine glycérinée n’a pas cet inconvénient : Sur une goutte, déposée sur la lame et maintenue fondue par une douce chaleur, est appliquée la lamelle, qui se trouve ensuite fixée par refroidissement, quoique d’une façon moins solide qu'avec les résines ; mais j'ai dû renoncer à l'emploi de ce procédé commode, ayant reconnu que dans celte gélatine glycérinée, quoique solide, la coloration hématique disparaissait à la longue comme dans la glycérine. L’essence de bergamoite, extrêmement peu volatile, et se résinifiant à la longue, peut être employée pour conserver provisoirement, comme avec la glycérine, mais dans un milieu réfringent, des coupes que l’on pourrait reprendre facilement ; j'ai conservé ainsi plusieurs années des coupes, même non recouvertes, sans altération ; seulement la coloration hématique, effacée dans la bergamotte encore liquide dès les premières heures, doit être reproduite.

Milieux intermédiaires. — Pour le passage des milieux plus ou moins aqueux qui constituent les fixateurs, les colorants ou les liquides de lavage, à la paraffine et à son dissolvant, pour le passage de celui-ci aux colorants aqueux sur coupes, pour le retour au dissolvant des résines de conservation, l’eau et ces dissolvants ne se

mouillant pas, alcool est l'intermédiaire presque obligé ; cependant LU

tout contact n’est pas absolument impossible, et l'alcool absolu n’est pas rigoureusement indispensable, le mélange pouvant se produire entre l'essence et un alcool d’un titre qui dépend non seulement de l'essence, mais aussi de la quantité relative des deux liquides.

Déshydratation. — Une pièce ou une coupe s’imbibe d’éther au sortir d’un alcool très aqueux, et de chloroforme dans un alcool bien inférieur à 90°; mais ces deux dissolvants ont le grave inconvénient de ne pas indiquer par l’éclaircissement le moment de la pénétration complète ; l'essence de cajeput pénètre encore au sortir d’un alcool notablement inférieur à 90°, l'essence de bergamotte et le {oluène d'un alcool à 90°, le æylène et surtout l'essence de cèdre ne réussiront pas toujours pour l'alcool à 95°. — Pour les pièces il n’y a pas grande complication à passer par l’alcoo! absolu, et cela est plus sûr. Pour éviter l’action brusque des essences, on se sert des procédés habituels, mélange à parties égales d’alcool absolu et d'essence, ou, par la méthode de GIESBRECHT, en plaçant l’alcool sur l'essence, où la pièce s'enfonce d'elle-même peu à peu, ce qui ne serait pas applicable à l’éther, plus léger que l’alcool, et au chloroforme qui laissera flotiter la pièce à sa surface. Pour des fragments d’Annélides, cette imbibition, y compris le bain d'essence pure, n’exige pas en moyenne plus de + heure. — Quant aux coupes, il est plus sûr d'éviter l'alcool absolu trop volatil, en traitant au sortir de l’alcoo!l à 90 ou 95 par l'essence : le traitement direct par le xæylène serait à la rigueur possible, soit lorsqu'on s'aperçoit, après dissolution de la paraffine et traitement par l'alcool à 95, que toute la paraffine n’a pas disparu, soit au moment du retour à l'essence après coloration des coupes, mais le xylène s'étale alors difficilement. Un procédé plus sûr et très commode consiste à traiter par l'essence de bergamotte qui prend facilement sur la lamelle en dirigeant son inclinaison pour la répandre sur toutes les coupes ; il se produit des nuages, mais l’alcool et l’eau s’évaporant bien plus vite que cette essence, on n’a qu à abandonner à elle-même la préparation, l’éclaircissement survient bientôt, surtout si on a eu soin de verser l'excès de liquide ; cette propriété de l’essence de bergamotte est très précieuse pour éviter la surveillance et prévenir les distractions ; on sait même qu'un oubli indéfini n’aura d’autre inconvénient pour la préparation que de nécessiter une nouvelle coloration, si celle-ci était hématique.

Hydratation. — Lorsque l'essence est en faible quantité le mélangesefaitbien plus facilement: ainsi,saufpour l'essence de cèdre, avec des alcools inférieurs à 90 pour le æylène, surtout pour l'essence de bergamotte, encore plus pour l'essence de cajeput, et enfin dans une mesure bien plus étendue pour le foluène, le chloroforme et l'éther ; en sorte que l'alcool à 95 ou 90 peut servir pour chasser des coupes l'essence qui a servi à dissoudre la paraffine.

Lavages. — Pour les alcools forts et les essences, au lieu de se servir d’un bain permanent, il est plus commode de laver avec quelques gouttes versées d’un flacon compte-gouttes. Pour l’eau, le lavage se fait plus commodément en faisant flotter par capillarité la lamelle retournée à la surface du liquide. — [action de l’eau sur les coupes imbibées d'alcool détermine de violents tourbillons qui pourraient altérer les coupes mal collées : on peut les éviter en faisant précéder l’eau de glycérine à cause de sa viscosité, ou plus simplement, après avoir débarrassé la lamelle de la plus grande partie de l'alcool, en la déposant brusquement à la surface de l’eau. Au contraire l'alcool chasse facilement vers le bord de la lamelle, soit l’eau, soit l'essence. — On se débarrasse de l'excès de liquide, en inclinant la lamelle et touchant par l’angle inférieur pour l’eau du papier buvard ou mieux la surface de ce liquide, pour les essences et pour l'alcool un linge ou du papier buvard ; l'alcool versé ainsi sur le doigt servira aussi à nettoyer la face libre de la lamelle, sans oublier la vérification, d’ailleurs facile par l'aspect, de sa situation.

Conclusions. — Les #nimaux tués par le fixateur (acide mitrique) sans 2mmobilisalion préalable, sauf dans certains cas, prennent ordinairement une situation convenable pour les coupes sagittales. Des fivateurs principaux, l'acide nitrique au — ou au-dessus, en solution alcoolique au +, et l’acide chromo-nitrique, qui ne paraît guère agir que par son acide nitrique, m'ont donné de beaucoup les meilleurs résultats.

Après ce fixateur, aucune coloration ne m'a permis d'obtenir d'élection par la méthode directe, et, par la méthode indirecte, je n'ai eu de bons résultats que par coloration avec le carmin et décoloration par l’alcool chlorhydrique (alcool 70, acide à 1 °/,). D'autre part les colorations de fond les plus définissantes ont été produites par les colorants hématiques avec virage foncé, rendant plus visible et