Annales de l'Institut Pasteur, 1889, p

déjà été signalée par M. Ejeldàhl; la seoonde a été mise en évN dence par M. Duclaux, et plus récemment par MM. Roux et Yersin.

Mode de préparation de la sucrase.

Je me suis adressé pour cette étude à la sucrase, quMl est facile de se procurer rapidement et en quantité notable; de plus, son action sur le saccharose est relativement simple, et le sucre interverti peut être dosé avec précision au moyen de la liqueur de Fehling. Pour se procurer la sucrase il suffit, comme Ta indiqué M. Duclaux dans sa Microbiologie^ de remplacer le liquide de culture de VAspergillm Niger arrivé au terme de son dévelo]^ pement par de Peau sucrée ou même de l'eau pure ; am btwt de 48 heures environ, on a un liquide actif, qui j^éfente cet avan* tage de ne renfermer, en dehors de Isw svcrase, qu'une quantité très faible de matériaux en sololion, environ un décigramme par litre. Cette sécrétion de sucrase est accompagnée de phénomènes intéressants Mr lesquels je reviendrai plus loin.

Ce liquide ^«r s'altère rapidement par suite de l'invasion des infinimefti petits, si on l'abandonne à lui-même, peut être conservé pendant plusieurs jours si on prend la précaution de Tadditionner d'une trace d'essence de moutarde, procédé qui a déjà été employé par M. Roux pour la conservation des diastases; celte essence n'a aucune iuQuence sur l'action de la sucrase.

Un autre procédé, qui permet d'avoir un liquide tout à fait exempt d'organismes étrangers, consiste à cultiver l'Aspergillus en liquide Raulin stérilisé, dans des fioles à tubulure latérale effilée, à fond très plat et à col droit; lorsque la plante est en pleine fructification, on décante le liquide par l'efftlure et on le remplace par de l'eau distillée stérile, après avoir lavé la face inférieure de la mucédinée avec de l'eau également stérile. Le maximum d'activité du liquide correspond à peu près au moment où, d'abord jaune verdâtre, il commence à virer du vert au brun clair.

Le procédé de filtration à travers la porcelaine, si précieux pour la stérilisation des liquides, ne conduit dans le cas présent à aucun résultat : plusieurs essais de filtration, faits dans des conditions variées, m'ont montré qu'avec le liquide provenant

Je l'Aspergillus, la matière active est presque intégralement retenue parle filtre.

Influence de variations faibles de la réaction du liquide diastasifère

sur VinterveMion du sucre.

Nous voilà en possession d'un liquide . avec lequel, nous pouvons, essayer des interversions de saccharose. J'ai toujours opéré dans des tubes larges, placés pendant, une heure dans un bain-marie réglé à 56^ température d'optimum d'action de la .sucrase. J'ai choisi la température de 56^, parce qu'au voisinage du. maximum de faibles variations, impossibles d'ailleurs à .éviter, dans la température, ne se traduisent que par des variations insignifiantes dans l'action de la sucrase ; j'ai choisi, pour la durée de l'interversion, une heure, parce que, si on la prolonge davantage, les phénomènes d'oxydation, dont je parlerai plus loin, peuvent intervenir et troubler les résultats.

Le volume de liquide renfermé dans mes tubes était toujours de IQcc que j'amenais après l'expérience à 20<^*^ avec les eaux de lavage. Le liquide sucré sur lequel je faisais agir la sucrase jetait une solution de saccharose à 40 ou 50 0/0, ne réduisant pas la liqueur de Fehling. Au sortir du bain-marie, les tubes étaient refroidis rapidement et additionnés d'un léger excès de potasse, de manière à arrêter toute action. J'ajouterai enfin que lorsque j'ai dû prolonger mes expériences pendant plus de 3 ou 4 heures, j'ai toujours opéré avec des liquides stériles, placés dans des conditions qui ne permettaient pas l'intervention des microbes.

Un premier fait facile à constater, c'est que le liquide à sucrase obtenu comme je viens de le dire apporte toujours avec lui une certaine acidité due à l'acide oxalique produit par VAspergillus; cette acidité est souvent très faible, mais le liquide supporte toujours l'addition de quantités mesurables de soude étendue avant d'arriver à bleuir le papier de. tournesol rouge. J'ai toujours fait usage d'un papier que j'avais reconnu préalableipent pouvoir déceler nettement g^l^ de soude.

Les expériences qui suivent montrent que la quantité de sucre interverti par une même dose de liquide à sucrase, à peine acide, va en diminuant à mesure que la qu;antité de soudç

présente va en augmentant, bien que celte augmentation de la soucie se fasse par degrés si faibles qu'ils n'amènent aucun changement de teinte dans les papiers les plus sensibles; plies font voir que dans les limites où existe ce que nous appelons la neutralité au point de vue des papiers colorés, la sucrase est très sensible à des variations qu'aucun réactif ne pourrait accuser.

Expérience I. — Huit tubes, renfermant chacun 2ec de liquide à sucrase, sont additionnés de quantités croissantes de soude à ^-^^ et le volume total est amené à tO*îc avec de l'eau et de l'eau sucrée. Voici les quantités de sucre interverti au bout d'une heure à 56o :

Proportion correspondante Sucre interverti de soude en millionièmes, en centigrammes

Jusqu'à Fessai 4, le liquide est sensiblement acide; à partir de l'essai 7 la réaction est faiblement alcaline.

ExpÉRiENGR n. — Les conditions sont les mêmes que dans l'expérience précédente.

Ici, j'ai employé de la soude à ^^; dans les essais 1 et 2, la réaction du liquide était sensiblement acide; à partir de l'essai 4, elle était alcaline.

Expérience III. — Je prépare deux liquides A et B, renfermant 40cc du même liquide à sucrase ; A renferme 4«c de soude A ^ ; B, 2cc. Chacun de ces mélanges a été amené à 50^^^ avec de l'eau distillée. B est neutre au papier (c'est ainsi que nous entendrons à l'avenir la mention neutre)\ A est légèrement alcalin; ils ont été additionnés respectivement de 20 et 40 millionièmes de soude.

No» d'ordre des expériences.

Soude ajoutée en ce.

5'î<^, additionnés de 5c o de saccharose à 50 % ont donné au bout d'une heure à 56» :

A 40,7 centigr. de sucre interverti.

Ce ralentissement considérable de l'interversion, lorsque le milieu est alcalin, est-il dû à ]a réaction du milieu, ou à une altération de la sucrase, facilitée par celte réaction ? Les expériences que je rapporterai plus loin, quand j'étudierai les phénomènes d'oxydation, semblent montrer que c'est cette deuxième explication qu'il faut accepter.

Nous pouvons tirer des faits qui précèdent une première conclusion : c'est que des quantités de diastase identiques peuvent fort bien, lorsqu'on les place dans des conditions identiques en apparence, intervertir des quantités de sucre très dilFérentes, et que, inversement, des chiffres identiques peuvent être fournis par des quantités de diastase très différentes. Nous pouvons, de plus, y trouver l'explication de certains faits que je ne veux que signaler en passant.

Si l'on prépare un liquide à sucrase avec une culture d'^lspergillus i'diiQ sans précautions dans une cuvette de porcelaine, et qu'on abandonne à lui-même le liquide obtenu, son activité va d'abord en croissant. Il se peuple, comme je l'ai dit plus haut, de microbes qui vivent de préférence à la surface, et augmentent l'acidité du liquide; cette augmentation d'acidité, si faible qu'elle soit, suffit cependant pour que la richesse du liquide en sucrase semble avoir augmenté; les faits signalés tout à l'heure nous en donnent l'explication. C'est sans doute la même cause qui explique une observation de Ad. Mayer*, relative à l'augmentation du pouvoir inversif d'une solution de sucrase de la levure, maintenue pendant quelques'heures à 32^.

On sait aussi que la sucrase agit, comme les autres diastases, proportionnellement à sa quantité et à la durée de l'action, au moins dans des limites sur lesquelles M. Duclaux a insisté dans sa Microbiologie. Je mettrai tout à l'heure en lumière une cause de non proportionnalité au temps; pour ce qui est de la proporlionnalité à la quantité, elle n'existe et on ne peut

i. Ad. Mayer, Die Lehre von dm chcmischen Fermenten oder EnzymologiCy Heidelberg, 4882, p. 8.

l'observer qu'avec des liquides à sucrase qui se trouvent par hasard neutres ou très voisins de la neutralité ; pour peu que le liquide s'écarte de la neutralité, ou conçoit qu'en en prenant dos quantités croissantes, on introduit dans les expériences d'interversion des quantités croissantes d'acide ou d'alcali qui empêchent la proportionnalité d'être exacte. Je dois dire cependant, sans qu'il soit pour cela nécessaire d'entrer dans des détails expérimentaux qui m'entraîneraient trop loin, que l'excès d'alcali semble avoir à ce point de vue une influence beaucoup plus considérable que l'excès d'acide ; on retrouve beaucoup plus facilement des nombres proportionnels en opérant avec un liquide faiblement acide qu'avec un liquide alcalin, sans doute parce que dans le second cas les phénomènes d'oxydation, que je \ais exposer maintenant, ont une action de plus en plus efficace k mesure que Talcalinité croît.

Oxydatkm de la sucrase; sa destruction par la chaleur.

On admet géodralement que les diastases sont des matières éminemment oxyânbles, et plus oxydables en milieu alcalin qu'en milieu neutre ou acide. C'est là une opinion d'ordre général qui, je me hâte de le dire, est en partie exacte pour la sucrase, et qui résulte de faits épars recueillis par divers expérimentateurs, saus qu'on ait jamais fait d'expériences directes destinées à le démontrer. Nous allons voir apparaître dans les phénomènes d'oxydation de la sucrase les mêmes influences, bien qu'un peu moins ac(*en tuées, de variations faibles dans la réaction du liquide diastasifère.

Expérience I. — Voici tout d'abord une expérience qui montre que la sucrase s'oxyde en milieu neutre ou voisin de la neutralité.

Les liquides qui m*ont servi sont les mélanges A et B mentionnés plus haut dans ma troisième expérience. A, je le rappelle, est légèrement alcalin, B est neutre; t*^^ dé ces liquides intervertissant respectivement, en 1 heure, à 36'', 40otg,7 et 66,6 de sucre. Quatre tubes renfermant > chacun 5cc de A quatre autres renfermant 5c«î de B, sont mis au bain- marie, à 56o. Toutes les heures, je mets dans un tube de chaque série 5cc d*eau sucrée et je dose le sucre interverti après 1 heure. Je trouve les nombres suivants, le numéro d'ordre de chaque expérience indiquant le temps pendant lequel chaque tube est resté à 56o avant Taddition de saccharose.

Diminution totale en 4''.

On voit qu'avec le liquide le plus alcalin, Toxydalion commence plus tôt et qu'elle- est plus' énergique qu*avec le liquide neutre. Ici apparaît la cause de non proportionnalité au temps à laquelle je faisais allusion plus haut.

Expérience II. — L*oxygène est bien la cause de la diminution d'aclivité de ces liquides. Voici, en efTet, une expérience dans laquelle un liquide neutre, dont l*'*^ donnait, au bout de 1 heure à 56°, 25*^^, 4 de sucre inierverti, a été chaufTé pendant 6 heures à 56°, d'une part dans un tube ouvert, de l'autre dans un tube scellé, vide d'air. Au bout de ce temps une expérience d'interversion a donné :

Cenligr.

Tube vide d'air 25,4

Tube ouvert 19,8

11 faut cependant ajouter que l'action plus prolongée d'une température de 36°, même en Tabsence d'air, eût amené une diminution dans l'activité du liquide, ce qui n'a pas lieu d'étonner, si Ton songe que la sucrase est détruite vers 70°, température qui n'esi pas de beaucoup supérieure à la température d'optimum d'action, S6°. Ainsi, le liquide précédent, chauffé [)endant 24 heures à 56*^, dans le vide, n'a plus donné au bout de ce temps, dans les mêmes conditions que plus haut, que 18^7 de sucre interverti. Concluons donc qu'a cette température lorsque Tac tion est prolongée au delà de o à 6 heures, à la diminution d'activité du liquide par oxydation vient se superposer celle qui est due à l'action de la ch;ileur.

Celte action de la chaleur, à l'exclusion de celle de l'oxygène, mérite de nous arrêter un instant, parce qu'elle dépend, elle aussi, de la réaction du milieu.

Mais ici se présente pne difficulté. Nous n'avons jusqu'à présent opéré qu'avec des volumes égaux d'un mêm»* liquide dias tasifère; les nombres obtenus étaient comparables, pnrce que ridenlité des conditioms d'expérience se trouvait ré.ilisée. Il n'en sera plus de même si, composant avec les mêmes doses d'un même liquide diastasifère des mélanges neutres, acides ou alca-

lins, nous les soumettons à une cause de destruction que nous voulons montrer agir inégalement sur ces raélânges^. Si Ton se reporte aux premières expériences de ce travail, on verra que des volumes égaux de ces liquides ne peuvent plus donner des chiffres identiques, parce qu'il y aura entre eux des différences de réaction.

Voici comment j'ai tourné cette difficulté. Dans l'étude qu'on trouvera exposée plus loin sur Tinfluence de doses croissantes des divers acides organiques ou minéraux sur l'interversion du sucre par la sucrase, j'ai observé que, à mesure que les doses d'un même acide vont en croissant, l'effet vçi en s'accélérant, puis en diminuant, de telle sorte que pour chaque acide il y a une dose dont l'effet est maximum. Pour l'acide acétique en particulier cette dose d'effet maximum est de |^. De plus, de petites variations dans la quantité d'acide employé de part et d'autre du chiffre maximum n'introduisent pas de variation appréciable dans la quantité de sucre interverti.

J'ai donc opéré toutes les interversions dont il va être question en présence de ^ d'acide acétique. Devant celte dose l'alcalinité ou l'acidité faible qu'apporle le liquide diastasifère disparaît, comme on le verra, absolument, etdes liquides qui, employés tels quels, conduiraient, comme ceux de mes premières expériences, aux chiffres les plus différents, fournissent des quantités de sucre interverti identiques. Je me suis arrêté à l'emploi de l'acide acétique pour plusieurs raisons. D'abord la dose de ^ est assez considérable pour pouvoir être mesurée avec exactitude ; de plus, à la température de 56®, l'acide à ce degré de concentration ne prend qu'une faible part à l'interversion du saccharose; il en intervertit pour sa part 5 centigrammes environ, dans les conditions où j'ai opéré, et c'est là une quantité relativement faible si on la compare à celle que la sucrase intervertit en subissant l'influence de l'acide.

Nous voil^ donc en possession d'une méthode qui nous permet de réaliser les conditions d'identité dont je parlais en commençant, identité vérifiée expérimentalement comme on va le voir. Revenonsàl'actiond'unetempératuredeSe^surlasucraseen Tabsence d'oxygène. Tous les chiffres qui suivent représentent en centigrammes la quantité de sucre interverti trouvée, dimi-

nuée de celle que l'acide acétique intervertit seul dans les mêmes conditions.

Expérience III. — Je prends des volumes égaux d'un liquide diaslasifère très faiblement acide, et je fais trois mélanges, A, B, G, amenés au même volume, et renfermant: A, ^ d'acide acétique ;B, le liquide laissé tel quel; G, ijJôô ^® soude. 1 centimètre cube de chacun de ces Ifquides, en présence de i o/o d'acide acétique, donne, comme je l'annonçais, un seul et même chiffré 43,6 de sucre interverti. Je chauffe ces liquides dans des tubes vides d*air à 56°, pendant 24 heures. Au bout de ce temps, ils me donnent les résultats suivants: '