PROCÉDÉS DE RECHERCHES

L'étude histologique de la glande urinaire à été poursuivie par nous au moyen des trois méthodes employées jusqu'ici en histologie : l'examen des tissus vivants eux-mêmes, les dissociations et les coupes en série. Ces trois procédés, se complétant etseconfirmant mutuellement, permettent, à condition de les employer simultanément, d'arriver à la connaissance la plus complète de la structure intime des organes.

La difficulté capitale à vaincre, dans l'étude qui nous occupe, est l'extrême altérabilité des tissus. La délicatesse des cellules rénales, comme de toutes les cellules glandulaires, a été remarquée par tous les observateurs. Lorsqu'on se contente d'étudier sous le microscope un lambeau du tissu du rein, sans le soumettre à l’action des réactifs dissociants ou des liquides fixateurs, on voit sans doute avec assez de netteté le carrelage polygonal formé par les cellules juxtaposées, et les éléments histologiques se présentent sur le profil de la préparation avec des contours bien délimités, comme des cellules épithéliales ordinaires. C'est à cet examen incomplet qu’on s’en est le plus souvent tenu. Tout au plus a-t-on quelquefois soumis les tissus à une dilacération superficielle au moyen d’aiguilles à dissection, dans l'espoir de détacher les éléments constituants. Mais cela a conduit à des erreurs sans cesse répétées dans les monographies peu approfondies, et dans les ouvrages généraux.

Pour avoir une idée précise de la structure intime de la glande, il faut avoir recours à des dissociations un peu plus méthodiques et surtout à des coupes. C’est alors que surviennent les difficultés. Sous l'influence des réactifs auxquels il est soumis, l’épithélium se détruit complètement et se réduit en lambeaux méconnaissables, si on ne prend des pré-

cautions suffisantes. Ce fait est facile à expliquer, bien que personne, à ma connaissance, n'ait cherché à en donner la raison, Lorsqu'on abandonne à lui-même dans de l’eau de mer un fragment de tissu frais et bien vivant du rein d’un Mollusque marin, par exemple, les éléments cellulaires continuent à vivre de la même manière qu'ils le faisaient à l'état normal: les cellules ciliées vibrent et les cellules glandulaires continuent à sécréter; elles se gonflent, en absorbant sans doute l’eau où elles sont plongées, puisqu'elles ne peuvent plus en retirer du sang; elles finissent par crever et laissent échapper dans le liquide environnant les excreta qu’elles contenaient. Le même phénomène se passait dans l'acte normal de la sécrétion. Les cellules ciliées, écrasées par le gonflement simultané des cellules glandulaires voisines, dépérissent aussi, et quelque temps après avoir été abandonné à lui-même, le fragment a perdu tout son épithélium ; on ne retrouve plus au-dessus de la trame musculaire el conjonctive qui formait le stroma de l'organe, qu'une petite quantité de mucus coloré par les excreta urinaires. seul reste de l’épithélium rénal.

IL importe donc avant tout d'arrêter immédiatement la sécrétion.

1° Fixation des tissus rénaux. — Les fixateurs ordinaires, et l’acide osmique en particulier, qui est si précieux pour fixer les micro-organites les plus délicats, les cils vibratiles. n’offrent ici aucun avantage; bien mieux, ils semblent activer la sécrétion, et lorsque sur un lambeau vivant qu’on examine au microscope, on laisse tomber une goutte d’une dissolution d'acide osmique, on voit les cellules glandulaires se gonfler, et dépasser comme de grosses vésicules, le niveau moyen de la couche épithéliale.

Les meilleurs résultats m'ont été donnés par l'acide acétique et l'acide picrique, et, mieux encore, par un mélange de ces deux acides. L’acide picro-sulfurique, m'a fourni aussi de bonnes fixations.

En résumé, voici le procédé qu'il est commode d’em-

+ ci

ployer pour la fixation des éléments épithéliaux du rein. On casse le plus rapidement possible avec une pince coupante la coquille du Mollusque à étudier et on en détache le rein avec de fins ciseaux. On le plonge ensuite pendant une ou deux minutes dans une dissolution d'acide osmique au centième, qui fixe les cellules ordinaires et les cellules ciliées ; puis, après avoir lavé rapidement le tissu, on le laisse pendant quelques heures dans un mélange d'acide picrique et d'acide acétique. On le porte ensuite dans de l'alcool à 70°, où on peut le laisser aussi longtemps qu’on le veut; il est alors prêt à subir l’action des liquides dissociants, ou à être repris pour des coupes hislologiques.

2° Dhissociation des éléments anatomiques du rein. — Le rein des Mollusques ne saurait être étudié, comme on l’a presque toujours fait jusqu'ici, surtout en France, en dilacérant simplement avec des aiguilles à dissection un lambeau de tissu placé sur une lame de verre. Si en effet ce procédé, tout à fait primitif, semble au premier abord donner des résultats, il ne conduit en réalité qu’à des erreurs assez graves. Lorsqu'on a traité de la sorte un fragment de rein, on voit sous le microscope la lame de verre couverte de petites vésicules sphériques, claires, d'aspect assez variable. Le plus souvent, elles présentent une enveloppe très mince, granuleuse, de nature protoplasmique, entourant une goutteleltte d’un liquide hyalin et non granuleux. Au centre de cette dernière se trouvent en général une ou plusieurs concrétions colorées, qui donnent à l'organe sa couleur caractéristique.

Quelquefois, au contraire, plusieurs gouttelettes de liquide hyalin se trouvent réunies dans la même vésicule et entourées par la même enveloppe protoplasmique. La pluparl des auteurs ont cru voir dans ces vésicules les éléments cellulaires du rein, et presque tous décrivent cet organe comme « formé d'éléments sphériques, mais devenant polyédriques par pression réciproque, se détachant avec la plus grande facilité ». La description de ces prétendues cellules

embarrasse un peu les anatomistes. Ils ne leur trouvent en général pas de noyaux, à moins qu’ils ne considèrent comme tel la vacuole, lorsqu'elle est très petite, ou même la concrétion (!). Quelquefois cependant, mais assez rarement, on décrit un noyau dans la couche protoplasmique périphérique.

Très souvent même, on a pris la vacuole pour une seconde cellule de production endogène, contenue à l'intérieur de la première. Ces mêmes désaccords se retrouvent aussi bien dans les mémoires relatifs aux Lamellibranches que dans ceux qui ont trait aux Prosobranches ou aux Pulmonés.

En réalité ces descriptions si variables sont le résultat de l'insuffisance du procédé employé. Ce que l’on observe de la sorte, ce ne sont pas les cellules, mais les produits d'excrélion issus des cellules elles-mêmes. C’est en effet sous forme de vésicules que les produits de disassimilation rassemblés dans une vacuole sont expulsés du corps de la cellule elle-même. Au contraire, celle-ci reste en place et peut continuer sa fonction sécrétrice pendant un certain temps encore. Les aiguilles ont pour effet de crever l’élément ana-

tomique et de faciliter l’expulsion de la vésicule. Mais le

corps même de la cellule reste attaché à sa membrane basilaire, à laquelle il adhère fortement. Ainsi s'explique l’absence de noyaux dans les sphères hyalines qui nagent sur la lamelle. Dans les rares cas où ils peuvent s’observer, leur présence s'explique facilement par le fait que, sous l’influence de l’action mécanique exercée par les aiguilles, le proltoplasma en s’échappant de la cellule a pu accidentellement entrainer le noyau.

Pour isoler les éléments sans les détruire ni les déformer, il est absolument nécessaire de faire usage de liquides dissociants. Ces liquides dissolvent le ciment intercellulaire, désagrègent les cellules, et on peut facilement les détacher intactes de leur membrane basilaire en passant un pinceau très fin sur la surface du tissu. Le liquide qui m'a rendu le plus de services est l'acide chromique au 1/1000. On le mélange avec de l'acide acélique qui arrête la sécrétion du

mucus, et on peut faire agir ce liquide sur les tissus frais sans même prendre la précaution de les fixer.

Mais la même liqueur ne conserve pas également bien les cellules glandulaires et les cellules ciliées de revêtement; par exemple, un mélange contenant moitié d'acide acétique, très bon pour la conservation des cellules glandulaire, détruit presque complètement les cellules ciliées qui ne se retrouvent plus sur les préparations. Aussi ont-elles échappé souvent dans les observations. Pour les avoir, il faut supprimer l’acide acétique el dissocier par l’acide chromique pur au 1/10000, dans lequel on plonge le tissu quelques heures, après avoir fixé par l'acide osmique. Le mélange employé par B. Haller (acide acétique, glycérine et eau), quoique également assez bon, ne m'a pas donné des résultats aussi satisfaisants.

La dissociation doit se faire dans l'eau, et le tissu doit être lavé soigneusement dans ce liquide, la plupart des matières colorantes étant inactives dans les milieux acides. Après avoir pris les précautions que nous venons d'indiquer, on peut colorer par l’hématoxyline, qui m’a donné de très bons résullats.

3° Coupes histologiques. — La méthode histologique la plus précise est incontestablement celle des coupes. Toutes mes coupes ont été faites à l’aide du microtome automatique à bascule construit par Dumaige, qui, avec les pro-: cédés de fixation, de déshydratation et d’inclusion dont j'ai constamment fait usage, donne des résultats aussi bons qu'on puisse le désirer.

Voici quelle série d'opérations nécessilait la techniqne à laquelle je me suis arrêté après de nombreux essais comparalifs :

a. Coloration et durcissement. — 1° L'objet fixé comme Je l'ai indiqué précédemment est coloré dans une dissolution de picrocarminate d’ammoniaque. Ce réaclif est préférable à tout autre. En effet, l'acide picrique qui sert de base à la fixation des cellules glandulaires, ne durcit les éléments que d’une façon passagère. Les objets ainsi préparés ne doivent pas être mis au contact de l'eau ou des dissolutions

aqueuses. Dans ces condilions, en effet, la fixation cesse, le mucus se gonfle en absorbant de l’eau, et les cellules épithéliales se détruisent entièrement. Cet inconvénient se produit beaucoup moins avec le picrocarminate; aussi c'est à ce réactif que j'ai eu recours pour les colorations en solutions aqueuses, qui ont élé toujours le premier terme de mes opérations. Il est utile que l’objet ait été plongé quelques heures dans l’alcoo!l à 70°, avant de subir l’action du picrocarmin. L'alcool achève la fixation commencée par l'acide picrique, et agit comme mordant, rendant plus vive la coloration rouge due au carmin.

2° Après avoir séjourné un ou deux jours dans le picrocarmin, la préparation est graduellement durcie en la plongeant successivement dans des alcools à 70°, 90° et 100°. Un séjour de vingt-quatre heures dans chacun d'eux suffit. Pour déshydrater complètement le tissu, on renouvelle deux jours de suite l’action de l'alcool absolu. Mais en même temps que cette déshydratation, l’objet recevait une nouvelle coloration. En effet, je n'employais jamais l’alcool absolu qu’en l’additionnant d’un peu de bleu de méthylène, qui colore en bleu le protoplasma et les muscles, et a si peu d’action sur les noyaux, que lorsqu'il est employé seul, ces derniers se détachent en clair au milieu du protoplasma fortement coloré.

De la sorte les coupes présentaient toujours une coloration multiple, les noyaux se délachant en rouge et les muscles en violet, sur la coloration bleue du protoplasma des cellules, des fibres conjonctives, des nerfs, et sur celle plus foncée encore des membranes basilaires des épithéliums et des plateaux des cellules ciliées. Les vacuéles pleines de suc cellulaire, si fréquentes dansles cellules glandulaires du rein, restaient complètement incolores.

b. Inclusion des objets durcis. — Pour enrober la préparation dans la paraffine, 1 fallait la faire passer successivement dans l'huile de cèdre, dans la paraffine mélangée à l'huile de cèdre, et enfin dans la paraffine pure. Elle était

REIN DES GASTÉROPODES PROSOBRANCHES. vl

plongée cinq heures au moins dans chacun de ces deux derniers bains, maintenus dans un bain-marie à température constante, le premier à 40°, le second à 50°.

c. Procédé de fixation des coupes sur les lames porte-objets. — Les éléments cellulaires du rein des Mollusques étant souvent très pelits, les coupes, pour être claires, devaient être extrêmement fines. Il à fallu Le plus souvent en réduire l'épaisseur à moins d’un 1/400 de millimètre. Les coupes, faites dans des conditions convenables, restent attachées les unes aux aulres en un long ruban. Ce procédé a rendu d’immenses services pour l'étude anatomique des animaux, surtout depuis que Paul Mayer a indiqué un procédé permeltant de les coller et de les étaler directement en séries sur le porle-objet au moyen d'un mélange d'albumine et de glycérine. Mais ce procédé lui-même quoique réalisant un progrès considérable présente de nombreux inconvénients. Il en est de même de celui de Giessbrecht, qui propose la gomme laque dissoute dans l’alcool absolu. Celui que je vais décrire, que nous avons exclusivement employé, M. Bernard et moi, ne laisse véritablement rien à désirer. Les coupes sont fixées au verre assez solidement pour qu'il soit possible, alors même qu’elles ont été incluses dans le baume et scellées depuis longtemps, de retirer le couvre-objet qui les protège, afin de les soumettre à de nouvelles réactions. On peut en outre les décolorer, les recolorer sur place, sans que la préparation souffre en quoi que ce soit. Le fixateur employé est simplement la gélatine. On en fait une dissolution très claire, à deux ou trois parties pour cent parlies d’eau, de façon que la masse soit bien liquide, même à une température peu élevée. On filtre soigneusement, et on étend une couche de cette gélatine bien fluide sur la lamelle porle-objet, avec un petit agilateur. On dépose alors à la surface de cette couche les rangées de coupe, qui surnagent sans adhérer à la lamelle. Cela permet de les faire mouvoir à volonté sur la lame de verre, et de les disposer par suile en séries aussi régulièrement qu'on le veul.

On porle ensuite la lamelle sur une plaque légèrement chauffée (40° environ), juste assez pour ne pas laisser fondre la paraffine. A cette douce chaleur, les coupes s’élalent spontanément à la surface de la gélatine; tous les plissements qui s'élaient produits pendant la coupe sous l'action du rasoir, s'effacent d'eux-mêmes, et on à une préparation bien plane et bien unie.

I n’y a plus qu’à enlever au moyen d’un tortillon de papier Joseph le superflu de la gélatine, et à laisser sécher quelques heures. Grâce à ce procédé, on peut coller en quelques minutes un nombre considérable de coupes.

d. Montage des coupes dans le baume. — 5° La gélatine une fois bien desséchée, la paraffine est facilement éliminée ; il suffit pour cela de plonger quelque secondes, la lamelle dans un bain de xylène; la paraffine se dissout, et on enferme la préparation dans du baume de Canada dissous dans du xyiène, dans la porportlion de 5 pour 15.

Il arrive souvent, au moment ou l’on dépose le couvreobjet que la gélatine n’a pas perdu toute son eau; celle-ci se dépose alors sur la plaque en fines gouttelettes qui obscurcissent la préparation comme d’un nuage, et rendent l'observalion impossible. Mais cet inconvénient peut être aisément évité en plongeant la plaque dans un mélange de xylène et d'alcool absolu. Les parties encore humides se couvrent inslantanément d’une buée, qui disparaît rapidement sous l’action déshydratante de l'alcool absolu. Il importe de plonger la plaque, au sortir de ce bain, dans le bain de xylène, de façon à enlever l'alcool; sans quoi, sous la double influence de lavidité de l'alcool pour l’eau et du froid produit par son évaporalion, un nuage formé par des gouttelettes d’eau se forme sur la plaque, et la ternit entièrement.

L'emploi de l'alcool absolu ne dispense d’ailleurs pas de laisser sécher préalablement la gélatine pendant quelque temps. L'alcool agissant sur la dissolution liquide coagulerait la gélatine et la rendrait opaque.

e. Procédés de décoloration et de coloration des coupes déjà

fixées au porte-objer. — Le procédé que nous venons de décrire a le précieux avantage de permettre de colorer et de décolorer les coupes à volonté. On ne peut le faire que difficilement quand les coupes sont collées à l’albumine. Celle-ci, sous l'influence des réactifs,se colore presque autant qu’elles. Nous n'avons employé pour ces colorations tardives que des réactifs colorants dissous dans l'alcool absolu. Ceux qui s’emploient en solution aqueuse ne pouvaient pas donner d'aussi bons résultats.

La matière colorante, le bleu de méthylène, par exemple, est dissoute dans un mélange à peu près égal d'essence de girofle et d’alcool absolu. La première retarde l’évaporation de l'alcool qui a pour effet de produire sur la lamelle une précipitation de bleu de méthylène. Il faut éviter à tout prix cette évaporation, en ajoutant de temps en temps quelques gouttes de la liqueur colorée. Le meilleur moyen consiste à plonger la plaque tout entière dans un bain de cette liqueur. Mais il faut veiller avec soin pour saisir le moment où la coloration a atteint la limite convenable. En laissant l'immersion se prolonger au delà, on risque de voir la plaque se colorer uniformément, ce qui est sinon un obstacle absolu, du moins une gêne pour l'observation. On arrête immédiatement l’action du colorant en lavant la plaque avec un mélange d'alcool absolu et d'essence de girofle. C'est ce même mélange qu’on emploie comme décolorant, mais son action est trés lente, ce qui permet de l'arrêter facilement au moment opportun.