IDENTIFICATION DU GERME

Les boîtes de Pétri, de retour au laboratoire, sont mises à l’étuve à 37°. Un léger délai à la température ordinaire n’est pas gravement préjudiciable à la vie du microbe. Ce délai sera cependant aussi court que possible.

Pendant les deux premiers jours n'apparaissent que des colonies banales. Au cours de la deuxième journée, parfois de la troisième, on voit naître sur les parties de la surface encore vierges, de très fines colonies du diamètre de la pointe d’une aiguille, surélevées et blanchâtres. Elles atteignent rapidement un millimètre de diamètre. Elles présentent alors un aspect caractéristique qu’il suffit d’avoir vu une fois pour éviter toute confusion. Elles sont nettement arrondies et bombées. Leur circonférence est nette, régulière ; vues sous une lumière oblique, elles ont une surface luisante, nacrée, un reflet métallique. L'ensemble revêt tout à fait l’apparence d’une gouttelette de mercure. Les colonies sont entourées d’un halo d’hémolyse. Peu nombreuses, 5 à 10, sur une même boîte, parfois confluentes, elles sont souvent aussi très rares. La découverte d’une seule d’entre elles, dûment identifiée, autorise le diagnostic de coqueluche. Les colonies avoisinantes sont très nombreuses mais ne prêtent vraiment à aucune confusion.

On porte dans une goutte d’eau distillée sur lame, une parcelle de la colonie à examiner. Flle est aisément prélevée par l’anse de platine et facilement émulsionnée sur la lame. Au contraire, des colonies microscopiquement semblables, telles que celles du micrococcus catarrhalis fuient devant l’instrument qui cherche à les capturer, en glissant sur la surface de la gélose, et se laissent difficilement étaler.

Le microbe de BorDEr-GENGOU est un coccobacille immobile, ovoïde, de un à deux w de longueur, un tiers de & de largeur. Il a la forme d’une navette et présente assez souvent un groupement analogue à celui des diplocoques. D’autres fois, il s’agglomère en petits amas. Après repiquages sucessifs sur milieu de BorD£T, il diminue de grandeur et devient cocciforme. Il récupère son aspect primitif par passage

sur milieu liquide puis solide. Il est strictement aérobie.

Il ne prend pas le Gram. Au violet de gentiane il faut préférer, pour le colorer, le bleu phéniqué de Kühne, ou mieux encore le bleu de toluidine suivant la formule de BORDET et GENGOU :

Blé de:toltidine ss eee BRAS 5 gr.

IAICOOLE +9

Fausse 500 cmÿ

on — a

Après dissolution complète, on ajoute 500 gr. d’eau phéniquée à 5 %, puis on filtre vingt-quatre heures plus tard. Cette coloration met bien en évidence sa forme en navette : espace clair central, teinte plus foncée sur ses bords et aux extrémités.

Cette morphologie du bacille de BoRDET est tout à fait semblable à celle de la bactérie de Pfeiffer. Ni la taille, ni la forme ne permettent de différencier les deux germes. Il importe donc de les transporter sur des milieux d'identification. Nombreux sont ceux qui ont été proposés dans ce but. En pratique, les seuls employés sont : le milieu de Bor- DET, la gélose au sang, la gélose ascite.

— Sur milieu de BorDET, le repiquage donne après trois ou quatre jours des colonies semblables aux premières. Nous avons vu qu'après plusieurs passages, le microbe s’amoindrit jusqu’à devenir cocciforme. Pour faciliter l'identification du germe, on peut ensemencer du bacille de BORDET à côté du microbe à reconnaître et comparer l’aspect des deux colonies au bout de trois ou quatre jours.

— Le meilleur milieu d'identification et de conservation des souches est, sans conteste, la gélose au sang. Elle est constituée par de la gélose ordinaire à laquelle on incorpore 30 % de sang frais défibriné. En quarante-huit heures, les colonies forment à sa surface une mince strie blanche qui s’épaissit par la suite.

KLEINSCHMIDT (11) additionne la gélose au sang de 2 % de glucose. Le bacille de BORDET y donne en soixante-douze heures des colonies grisètres, hémolysantes, alors que la bactérie de Pfeiffer ne provoque la formation que de colonies transparentes, rares et sans action sur l’hémoglobine. On peut conserver indéfiniment le bacille de BOoRDET sur ces deux milieux en le repiquant toutes les cinq à six semaines.

L'une des caractéristiques du bacille est de pouvoir s'adapter aux milieux privés de sang dès le deuxième ou troisième passage. La bactérie de Pfeiffer n’y pousse jamais. On obtient ainsi, sur gélose ascite ou sur sérum coagulé, des colonies d’un blanc jaunâtre poussant lentement en quatre à sept jours et qui s’épaississent plus tard.

D’autres milieux ont été décrits pour la culture du bacille de Bor- DET : le milieu de LEGROUX, à l’amidon de pomme de terre; il a l’avantage de faire pousser les microbes dès le premier repiquage en trois ou quatre jours sans qu’il soit besoin d’ajouter de sang. Le milieu chocolat des Américains n’est autre qu’une gélose au sang cuit : le microbe n’y pousse pas au premier passage.

L'an dernier GUNDEL et SCHLUTTER (10) ont proposé une autre méthode pour la différenciation du bacille de Borper. Ils font au lapin une injection intra-dermique avec une émulsion contenant par centimètre cube cinq milliards des germes à l’étude. Au bout de vingt-quatre

La

heures, il se forme un élément papulo-nécrotique au niveau du point d'injection, s’il s’agit bien du bacille de BorDET. L/émulsion de bacilles de Pfeiffer ne donne aucune réaction.

Il'existe enfin un dernier moyen de prouver la spécificité du bacille trouvé dans les boîtes de Pétri : l’agglutination. Celle-ci peut être faite rapidement en émulsionnant une colonie dans une goutte de solution physiologique à laquelle on ajoute du sérum expérimental dilué du 1/100° au 1/1.000°. On observe macroscopiquement et microscopiquement la réaction. Nous reviendrons plus loin sur la ARE et les résultats de l’agglutination.

Voilà donc une première méthode biologique de Honocte de la coqueluche. Précocement positive, avant l'apparition des quintes, d'exécution facile, elle a une valeur indiscutable : correctement effectuée, la recherche du bacille est pour ainsi dire toujours positive dans la période de début de la maladie cliniquement indémontrable qui s'étend du cinquième au quinzième jour. Elle reste positive jusqu’au vingtième jour. Après cette époque, elle perd beaucoup de sa valeur qui devient nulle à la quatrième ou cinquième semaine, date à laquelle on ne retrouve plus aucun bacille à l’ensemencement, ce qui explique l'absence de contagiosité de la coqueluche aux environs de la quatrième semaine. D'ailleurs, après l'apparition des quintes, l'intérêt de cette recherche est beaucoup moindre. Nous l'avons employée pour la plupart de nos petits malades : elle s’est montrée fidèle ; nous avons pu la contrôler par l'apparition des quintes et par la réaction de fixation. Elle nous a permis presque toujours de trancher un diagnostic hésitant.

Cependant, nous avons eu parfois quelques difficultés à obtenir cet examen en raison, soit du peu de soin que prenaient nos malades des boîtes de Pétri, soit de la mauvaise technique avec laquelle ils effectuaient l’ensemencement. En effet, il existe deux inconvénients : l’exécution de l’ensemencement par des sujets non expérimentés, la fragilité du milieu. Cette fragilité le rend difficilement transportable et maiheureusement trop peu de laboratoires à l’heure actuelle sont en mesure de faire cette recherche sur place. Au Danemark, pour faciliter le transport, on utilise des boîtes de Pétri en aluminium :: innovation intéressante mais qui n'empêche en rien l’altération du milieu luimême pendant le trajet.

Quoi qu’il en soit, l’ensemencement du bacille de BorpEï sur boîtes de Pétri constitue une précieuse ressource pour le diagnostic précoce de la coqueluche. Nous souhaitons vivement qu’elle se répande de plus

en plus car c’est là le seul moyen pratique de diagnostic avant l’apparition des quintes.

RÉACTIONS D’AGGLUTINATION ET DE FIXATION DU COMPLÉMENT DANS LA COQUELUCHE

Il n’est pas dans notre intention d'étudier en détail les réactions d'agglutination et de fixation du complément. Leur technique délicate, la longueur des manipulations en font des méthodes d’exception. Ce-pendant nous passerons rapidement en revue chaeune d’elles et verrons quelles conclusions nous pouvons tirer de la mise en œuvre de ces procédés.

[1 — Réaction d’agglutination

BorprtT et GENGOU (1), après leur découverte, cherchent à prouver la spécificité du bacille par l’agglutination. Ils préparent une émulsion, dans deux à trois centimètres cubes de sérum physiologique, de colo-

-nies développées en deux jours sur gélose au sang, d’une concentration de deux milliards de germes par centimètre cube environ. Puis ils injectent au cheval tous les deux ou trois jours, suivant la réaction, cent centimètres cubes du mélange : au total, quinze injections, soit un volume de deux litres et demi de vaccin. Les anticorps apparaissent au bout d’un mois environ et l’immun-sérum ainsi obtenu peut agglutiner une émulsion microbienne jusqu’au 1/5.000°. GIÉSE (4), en 1918, reprend ces travaux. KRUMWIEDE (7), en 1923, agglutine des bacilles de BoRDET avec un sérum de lapins immunisés. C’est ainsi qu’il découvre deux souches de bacilles, À et B, chacune étant agglutinable par le sérum homologue et non agglutinable par le sérum hétérologue. Jurién Marie (21) signale dans sa thèse des recherches analogues. Il immunise des lapins en pratiquant vingt injections intra-veineuses d’une émulsion de deux milliards de germes par centimètre cube. Il procède par séries de cinq injections séparées par quatre jours d’intervalle. La quantité de vaccin employé varie entre © cc. 5 et I cc. 5; injecté au début après chauffage à 50°, il est employé pur après les

premières séries. D’autre part, deux immun-sérums A et B lui avaient été fournis par les Américains. La technique même de l’agglutination est très simple : elle consiste à laisser trois heures à 37°, puis quatre heures à la température du laboratoire un mélange de x cc. d’émulsion bactérienne avec des dilutions d’immun-sérum de 1/100° à 1/5.000°.

Les investigations de nombreux auteurs ont montré que le pouvoir antigène du Bacille de BorpET diminuait très rapidement. L'agglutination effectuée sur une même souche de bacilles, mais à plusieurs mois de distance, donne des résultats fort différents : très nette lorsque la souche est récente, elle est beaucoup moins caractéristique lorsque la souche servant d’antigène a été entretenue dix à douze mois au laboratoire par repiquages successifs. L’agglutination ne se produit plus alors qu’à un taux de dilution très faible du sérum.

L'agglutination, test d’authentification d’une souche de bacilles au moyen d’un immun-sérum expérimental, est donc une méthode fidèle. Il importe toutefois que l’immun-sérum ait été préparé depuis peu et que les bactéries servant d’antigène, aient été récement isolées de l’organisme. Signalons que ni KRISTENSEN (8), ni JULIEN MARHE, n’ont pu retrouver de souches microbiennes agglutinables par le sérum À américain : au contraire, toutes les souches observées étaient agglutinées par le sérum B. L'existence de deux races différentes, À et B, basée uniquement sur des recherches d’agglutinabilité, n’est donc nullement démontrée.

Nous avons eu rarement recours à l’agglutination pour vérifier la spécificité des microbes en provenance de nos petits malades. Mais toutes les fois que nous avons fait cet examen nous avons obtenu une excellente agglutination pour un taux de dilution de 1/5.000° d’immunsérum.

Beaucoup plus infidèles sont les recherches tendant à authentifier un sérum de coquelucheux par son pouvoir agglutinant vis-à-vis d’un antigène constitué par une souche de bacilles de BoRDET. BoRDET et GENGoU, Carévrrz et MEYER (3), GIESE, JULIEN MARIE sont très réservés sur ce point. La réaction est en effet très inconstante, le taux d’agglutination extrêmement variable et souvent très faible, enfin quelquefois la bactérie de Pfeiffer serait agglutinée par le sérum de coquelucheux. À ce point de vue, la méthode présente donc peu d'intérêt pour le diagnostic tardif de la coqueluche.

Voici, en dernier lieu les résultats des recherches de J.-J. Mrr- LER (22). Il injecte une série de lapins avec un vaccin phénolé, une autre série avec une endotoxine obtenue en congelant puis chauffant une émulsion de bacilles. Il constate que cette dernière préparation provoque plus rapidement dans le sérum la formation d'anticorps que

on —

le vaccin phénolé et conclut que les substances antigènes de bacille de BorDET sont relativement thermostables tandis que ses toxines sont inactivées à 37°.

Si toutefois ces données ne résolvent pas le problème de l’'agglutination, du moins peuvent-elles être d’un utile secours pour la prépa- ‘ration des vaccins, le pouvoir vaccinant étant dans une certaine mesure parallèle au pouvoir antigène. Nous exigerons donc d’un vaccin non seulement que sa date de préparation ne soit pas trop éloignée du jour où 1l doit être utilisé, mais surtout que les souches employées à son élaboration, aussi nombreuses que possible, proviennent de microbes récemment isolés de l’organisme, et que la préparation soit effectuée par chauffage plutôt que par addition de substances chimiques antiseptiques.