H 2 C-CH 2 H 2 C-CH

H 2 C CH.COOH

NH

HOOC CH.COOH

nh 2

Cet acide glutamique peut être oxydé à un degré supérieur ou amidé, de sorte que le métabolisme de la proline peut être représenté comme suit:

Proline + 02--^ ac. glutamique

(+ NH 3 glutamine

(-(- 1/2 0 2 —ac. a-cétoglutarique

+ NH 3

On doit signaler la guadinase comme le premier ferment de désamination dont on ait démontré expérimentalement l’existence dans les moisissures. (Iwanoff et Awetissowa, 1931). La formation de cette enzyme est activée par le sucre. Par un artifice très intéressant, les auteurs produisent des tissus de moisissure, exempts d’uréase, grâce à quoi ils sont à même d’obtenir les deux composants de la guanidine, l’urée et l’ammoniac, dans les proportions moléculaires caractéristiques de la guanidine.

L’asparaginase, déjà citée plus haut, a souvent été étudiée depuis une trentaine d’années. Elle a été préparée la première

fois par Lang (1904) à partir d’organes de boeuf broyés. En une heure, il obtint une désamidation complète de l’asparagine. Shibata (1904) a recherché cette même enzyme dans une préparation de mycélium d’Aspergillus niger. Il n’a jamais obtenu de séparation de l’azote aminé et, avec l’asparagine, il n’obtient pas davantage d’action sur le radical amide, tandis qu’il put obtenir cette action sur l’acétamide, l’oxamide et la benzamide. C’est pourquoi il a cru être en présence d’une amidase qui, à titre d’exception seulement, n’agit pas sur l’asparagine, et il rattache à cette interprétation l’idée que la valeur nutritive de l’asparagine repose sur ses propriétés d’acide aminé et non pas sur sa fonction amide.

Effront (1908) est parvenu pour la première fois à détacher également l’azote aminé et ceci, non par la préparation d’une enzyme mais par l’action d’une levure vivante. La levure décompose non seulement l’asparagine et la leucine mais aussi l’acide aspartique et l’acide glutamique. Entretemps, Pringsheim (1908) avait essayé, mais sans succès, de réaliser au moyen d’une préparation d’enzyme les dissociations que n’avait pas réussies Shibata. Il a publié ce résultat négatif, après avoir pris connaissance des données d’EFFRONT, pour montrer clairement les erreurs à éviter dans les préparations de l’enzyme. Shibata et Pringsheim avaient fait des préparations dans l’acétone, et c’est à cela qu’il faut, suivant Pringsheim, attribuer la destruction de l’enzyme. Aussi Fürth et Friedmann (1910) ont-ils supprimé toute extraction au moyen de solvents organiques. Les produits d’autolyse de la levure, qu’ils ont préparés, libèrent de l’asparagine une quantité d’ammoniac très considérable; cette quantité cependant reste toujours inférieure à ce qu’aurait pu libérer quantitativement la fonction amide de l’asparagine. Donc il n’a toujours pas été prouvé qu’une enzyme ait attaqué la fonction amine de ce même corps. En résumé, on a réalisé depuis Lang des perfectionnements de méthodes, mais l’essentiel de la question est resté sans solution.

BLANCHETièRE (1917) a été le premier à pouvoir faire apparaître expérimentalement le comportement différent du radical amine et du radical amide. Il travaille avec le Bacterium fluorescens. En milieu faiblement alcalin, le radical amide est détaché complètement au cours de la première semaine et, immédiatement après, le radical amine est attaqué. Mais ce deuxième stade dure cinq semaines de sorte que l’ensemble de la décomposition de l’asparagine dure six semaines. Cette longue durée est incontestablement un grand inconvénient pour se faire une représentation

•claire de la séparation du radical amine; cependant le dispositif opératoire de BLANCHETièRE présente un grand avantage sur celui de ses devanciers et même sur celui qui a été utilisé dans des recherches effectuées beaucoup plus tard. En effet, le Bacterium fluorscens se développe dans l’asparagine seule comme milieu nutritif. On peut donc se dispenser d’ajouter d’autres substances pour le nourir, et ainsi observer isolément la décomposition de l'asparagine.

Ensuite, pendant dix ans, personne ne poursuit les recherches sur ces enzymes, mais pendant le même temps on met en lumière le rôle physiologique important de l’asparagine, notamment dans les plantes supérieures.

En 1927. von Euler et Myrbück doutent encore que l’asparaginase agisse uniquement sur l’asparagine. En effet, aucun auteur antérieur n’avait exclu la possibilité que la désamidase de l’asparagine pût agir également sur la fonction amide de quelques autres corps.

Grover et Chibnal (1927) sont les premiers à constater nettement que la désamidation et la désamination sont deux processus distincts et ils veulent chercher à mieux connaître le passage de l’acide aspartique à l’asparagine. Ils travaillent avec des racines d’orge. Jusque-là, on n’avait suivi l’action de l’asparaginase que par des déterminations de l’ammoniac engendré comme produit de dissociation. La formation de l’acide aspartique restait encore une hypothèse. Ces auteurs étudient le phénomène par titrométrie, et les valeurs trouvées concordent avec les valeurs calculées théoriquement pour l’acide aspartique.

Mais ils croient que l’asparaginase n’est pas une enzyme exceptionnelle parce que l’érepsine agit également sur l’asparagine. Au contraire, d’après la nature reconnue complexe de l’érepsine, cet argument n’est pas valable. Par ailleurs, l’année suivante deux publications voient simultanément le jour, celle de Bach et celle de Geddes et Hunter, qui démontrent que l’asparaginase est spécifique pour la désamidation de l’asparagine, les deux publications ayant pour objet l’Aspergillus. Geddes et Hunter constatent que leur préparation, extraite à l’eau froide, est rendue inactive par la chaleur, l’alcool et l’acétone. Après une purification plus poussée, par adsorption, l’azote amidé est attaqué vivement tandis que l’azote aminé reste inattaqué. Les auteurs constatent une faible action sur la glutamine et ils en tirent la conclusion que l’action de l’enzyme appelée „asparaginase” est limitée au radical amide de l’asparagine. Donc ces recherches ont confirmé l’existence d’une asparaginase spécifique.

La préparation de Bach, comme toutes les précédentes, est san$ influence sur la fonction amino-acide proprement dite. En 1930 Schmalfuss et Mothes comparent d’une manière détaillée leurs résultats avec ceux de Bach. En principe, ils peuvent confirmer entièrement ses résultats, seules les limites de l’activité sont un peu différentes. Geddes et Hunter, Bach, Schmalfuss et Mothes aboutissent donc unanimement au fait que l’Aspergillus dispose d’une enzyme dont l’action se manifeste spécifiquement par l’hydrolyse du radical amide de l’asparagine, mais on tâtonne encore sur la détermination des circonstances de cette action.

Schmalfuss et Mothes se sont efforcés d’expliquer la dissocia*: tion de la fonction amine in vivo par des données empruntées à des préparations d’enzyme; mais il y a là des difficultés sérieuses. Le radical amide est dissocié activement in vivo quel que soit le pH, tandis que in vitro la décomposition est liée à un optimum très net qui se manifeste à pH = 7,8. L’explication tentée page 151: „es besteht berechtigte Vermutung dasz diese Desamidierung des Asparagins bei saurer Reaktion nicht iden 7 tisch ist mit der Desamidierung bei hohem pH” ne paraît pas satisfaisante. *

La préparation d’enzymes donne encore moins d’éclaircissements lorsqu’il s’agit de l’amino-azote de l’asparagine. Alors que in vivo le radical amine n’est attaqué qu’en milieu acide, il n’y a de décomposition quelconque in vitro, ni à pH élevé, ni à pH bas, et les auteurs notent simplement (page 140) „dasz der Amino-N des Asparagins durch ein Ferment nicht angegriffen wird”. Ils ne sont donc pas parvenus à reconstituer dans la moisissure vivante, les données des préparations.

L’avantage de la préparation de Schmalfuss et Mothes est son action énergique sur le radical amide; son désavantage, une pureté déficiente. La préparation de Geddes et Hunter est pure mais beaucoup plus faible. Or, Grassmann et Mayr (1933) ont réalisé une préparation de levure dont la purification est très poussée et qui, en même temps, est très active. En se fondant sur une dizaine de critères, ils apportent une distinction nette entre l’asparaginase et les di- et polypeptidases. Même lorsque la chaîne carbonique de l’asparagine est reliée sous forme de peptide à une autre chaîne, comme dans l’asparagine-monoglycine ou dans l’asparagyldialanine, il ne s’ensuit pas que l’asparaginase entre en action; ce qui démontre très clairement que celle-ci n’est pas une peptidase, mais tout au plus une amidase qui agit uniquement sur un radical libre CONH 2 . En outre, l’action de cette amidase est limitée à une seule amide bien

déterminée: tous les radicaux amides n'ayant pas la même configuration que celle de la l-a-asparagine, résistent à l’action de cette enzyme purifiée. Lorsqu’au radical amine de l’asparagine on substitue un radical acétyle, la fonction amide résiste à toute attaque. Il en est de même lorsque le radical carboxyle libre est méthylé ou lorsqu’on expose à l’action de l’asparaginase les quatre isomères de l’a-hydroxy-asparagine et de la 0-hydroxyasparagine. La ^-asparagine elle aussi résiste à toute attaque de l’asparaginase.

Cet examen démontre donc définitivement l’existence d’une asparaginase qui est spécifiée par son action sur la seule asparagine naturelle.

Les recherches de Grassmann et Mayr donnent les renseignements les plus complets au sujet de la désamidation de l’asparagine. Bien qu’ils n’aient travaillé qu’avec un seul agent — la levure — leur étude a été poussée tellement à fond qu’il nous a paru inutile de reproduire leurs expériences avec l’agent que nous avions choisi, l’Aspergillus.

Par contre, la question de la désamination se présente d’une façon différente. Les publications citées jusqu’à présent tantôt mentionnent une désamination in vivo, tantôt n’en mentionnent pas, mais elles sont unanimes à constater une résistance du radical aminé in vitro . A ce sujet des résultats très remarquables ont été publiés récemment; ils se répartissent en deux groupes différents:

1° — Les études sur l’aspartase: Woolf (1929), Virtanen et Tarnanen (1932), Jacobsohn, Tapadinhas, Pereira (1935); .

2° — Les études sur la désaminase: H. A. Krebs (1933a, 1933b, 1935a et 1935b).

Nous ne nous préoccuperons pas de rechercher comment on pourrait faire concorder les résultats de ces recherches, mais nous faisons simplement remarquer que les agents utilisés dans ces deux groupes d’études sont très différents. Krebs travaille avec des coupes de tissus animaux, tandis que les autres travaillent avec des bactéries ou des pois en germination, ou font circuler du sang dans du foie de chien.

La dénomination „aspartase” est due à Woolf et elle désigne une enzyme qui affectue le passage de l’acide fumarique à l’acide aspartique. Virtanen et Tarnanen appuient surtout sur le fait que cette enzyme n’agit que dans ce seul cas particulier; au contraire, si dans ces corps le radical carboxyle ou l’hydrogène est remplacé par un autre radical, il n’y a plus d’action de l’aspartase. Les auteurs croient même que l’asparagine ne peut

être attaquée par l'aspartase qu’en passant par l’acide aspartique.

Enfin, Jacobsohn, Tapadinhas et Pereira réalisent une transformation in vivo de fumarate d’ammonium en acide aspartique. La conclusion commune de ces travaux sur l’aspartase est l’opinion que l’acide aspartique est désaminé par libération du radical amine et d’hydrogène, avec formation d’une double liaison.

Woolf et Virtanen insistent en outre sur la réversibilité de la réaction; ce trait présente une grande importance du point de vue physiologique, parce que dans ce cas la réaction étudiée par eux contribuerait à nous faire mieux comprendre la synthèse des acides aminés qui, jusqu’à présent, est restée assez énigmatique.

En attendant, on doit faire remarquer que cette interprétation de la transformation des corps aminés n’est pas la plus courante; jusqu’à un certain point elle est même en contradiction avec deux autres opinions suivant lesquelles les amino-acides se forment à partir d’hydroxacides ou de céto-acides.

Si un acide aminé passe à un hydroxacide, la désamination présente le caractère d’une hydrolyse, tandis que dans le passage d’un amino-acide à un céto-acide, la désamination se présente comme un processus d’oxydation.

Neubauer (1909) fut le premier à fournir un argument en faveur de l’opinion que la désamination est une oxydation et non pas une hydrolyse: lorsque des animaux sont nourris d’acides aminés dans lesquels on a introduit un radical phényle, on trouve dans l’urine les céto-acides qui correspondent à ces aminoacides. Les céto-acides correspondant aux amino-acides naturels n’ont pas pu être isolés, parce qu’on peut croire que s’ils se formaient, leur dissociation se produirait immédiatement.

Knoop (1925) a démontré ensuite que la synthèse des aminoacides a son point de départ non pas dans les hydroxacides, mais dans les céto-acides. Mais comme il y avait toujours des hydroxacides à côté des céto-acides, il n’était pas exclu qu’il pût y avoir avec la transformation par oxydation de l’aminoacide en céto-acide, une hydrolyse transformant l’amino-acide en hydroxacide. Le problème en était là lorsque Krebs s’y est attaqué; il a démontré par trois voies différentes que la désamination des amino-acides a lieu, avec les agents dont il s’est servi, par oxydation et exclusivement par oxydation.

Nous nous bornons à indiquer la première et la troisième démonstration de Krebs, qui aboutissent à un résultat certain; nous omettrons la seconde qui d’après les expériences de Bern-

heim et Bernheim (1934, 1935) et même d’après des expériences subséquentes de Krebs (1935) ne paraît pas entièrement probante.

Première démonstration de Krebs (1933a):

Dans un milieu contenant de l’oxygène il se forme à partir des amino-acides, beaucoup d’ammoniac et il ne s’en forme pas dans un milieu exempt d’oxygène. Du fait que la désamination est liée à la présence et à la consommation de l’oxygène on conclut que la voie par oxydation est la voie unique pour passer à une chaîne carbonique exempte d’azote.

La troisième démonstration de Krebs (1933a) va plus loin; elle prouve non seulement l’entrée en action de l’oxygène, mais encore la formation de céto-acides comme l’exige la formule:

R.CHNH 2 COOH + O R.CO.COOH + NH 3

‘ Les céto-acides n’avaient encore jamais pu être isolés à partir des a-amino acides aliphatiques. Pour atteindre ce but, on devra réaliser simultanément les conditions qui provoquent la formation d’un céto-acide et celles qui empêchent sa décomposition ultérieure. Krebs a atteint ce résultat par des dispositifs opératoires différents:

a) A partir de l’alanine, par empoisonnement du tissu à l’aide d’acide cyanhydrique et d’anhydride arsénieux, il est parvenu à isoler l’acide pyrotartrique qu’il a pu identifier comme hydrazone;

b) On détruit la structure cellulaire par un moyen mécanique; on empêche ainsi que les céto-acides disparaissent dans une réaction ultérieure; on obtient à la fois de l’oxygène, de l’ammoniac et des céto-acides dans les proportions 1:2:2 exigées par l’équation;

c) Dans de nombreux cas, la désamination a lieu — contrairement à ce qui se passe pour l’alanine — beaucoup plus rapidement que la dissociation du céto-acide; il n’est pas nécessaire de recourir alors à l’empoisonnement ni à la destruction de la structure cellulaire, car les céto-acides diffusent spontanément des coupes de tissus dans le liquide environnant.

C’est dans ce liquide que Krebs réussit l’isolation et l’identification des céto-acides qui correspondent aux acides aminés utilisés.

On peut faire à cet article de Krebs le reproche que ses exemples sont empruntés à des amino-acides qui ne se présentent pas trop fréquemment, tels que l’alanine, la leucine, l’isoleucine, l’acide aminobutyrique etc.; il y manque notamment les acides aminodicarboniques, si importants du point de vue

physiologique. Cette lacune a été comblée par un article du même auteur (1933b) dans lequel il annonce l’obtention des mêmes résultats pour l’acide aspartique et l’acide glutamique.

Le tissu de rein du rat, employé comme agent dans le premier article (1933a), s’est montré moins approprié pour ces expériences ultérieures (1933b); mais on a obtenu de bons résultats avec les reins de lapins, de cobayes et de chiens. Les vitesses de formation et de dissociation de l’acide oxalo-acétique ou de Pacide cétoglutarique sont telles que le céto-acide formé disparaît rapidement, de sorte qu’un empoisonnement par l’arsénie est nécessaire pour empêcher cette disparition.

Dans le premier article (1933a) l’auteur s’était heurté à un phénomène très étrange: la plupart des acides aminés non naturels se dissocient beaucoup plus rapidement — parfois 25 fois plus rapidement — que les acides naturels. Dans une publication subséquente Kkebs (1395a) a donné à ce sujet des indications plus précises. Bien qu’il n’eût pas isolé l’enzyme appelée par lui „désaminase”, tout semblait indiquer que la dissociation par oxydation des amino-acides tant lévogyres que dextrogyres est de nature enzymatique. Mais l’auteur a constaté qu’il y avait dans ces deux cas, deux „systèmes fermentatifs” présentant des différences notables.

C’est ainsi que le système par lequel sont désaminés les aminoacides naturels, est détruit par dessication du tissu, ne peut pas être extrait et est paralysé par les narcotiques. Par contre, le système par lequel sont désaminés les amino-acides non naturels résiste à la dessication, est soluble dans l’eau, est actif dans les extraits et n’est pas paralysé par les narcotiques. Ces faits prouvent l’existence de deux désaminases distinctes pour les acides aminés: une 1-désaminase et une d-désaminase. L’article renferme en outre une représentation plutôt hypothétique du mode d’action des deux systèmes et de leurs relations. Pour les données sur lesquelles Krebs fond son hypothèse, nous renvoyons à son travail original; nous n’en résumons ici que l’aspect général. La différence entre la 1-désaminase et la d-désaminase n’est peutêtre qu’une simple différence de structure; elles peuvent avoir des composants communs, de sorte qu’on ait: