E. — LE BACILLE DU TÉTANOS ET SON AÉROBISATION
Nous n'avons ni le désir ni la prétention d'écrire une monographie du bacille du tétanos; un gros volume ne saurait y suffire : Nous voulons simplement reproduire dans ses grandes lignes les caractères essentiels morphologiques, biologiques et expérimentaux de ce germe si intéressant par sa profusion dans la nature, qui contraste heureusement avec la rareté de ses méfaits. Nous suivrons dans cette revue rapide les traités classiques de Macé, Besson, Bezançon, etc.
I. — Le bacille du tétanos découvert par Nicolaïer est extraordinairement répandu; on le trouve dans la terre, dans les excréments des animaux, dans la vase où abondent des spores. L'inoculation d’un peu de terre de jardin au cobaye le fait mourir soit de la septicémie de Pasteur, soit de toxhémie tétanique.
L'aspect morphologique du bacille du tétanos varie dans les cultures et dans les foyers d'inoculation.
Dans les cultures jeunes, c'est un bâtonnet très fin, allongé, à extrémités rectangulaires mesurant environ 4 u de long et 0 w 4 de large, légèrement mobile, ne traversant pas rapidement le champ du microscope, mais se déplaçant d'un mouvement lent et flexueux, muni de cils nombreux, longs et sinueux, insérés sur les parties latérales. Mais après le 10° jour dans les cultures faites à 22°, au bout de 36 à 48 heures dans les cultures faites à l'étuve à 37, quelquefois même dans le pus, on trouve les formes sporulées, bâtonnets grêles, plus courts, portant exactement à leur extrémité, et à une seule de leurs extrémités, une petite sphère réfringente d’un diamètre triple environ de la largeur du microbe. Le bacille sporulé est immobile : c’est la forme en épingle.
Dans les vieilles cultures, le corps du bâtonnet se désagrège et bientôt on ne trouve plus que les spores mêlées à des formes d’involution massuées, courbées, en haltères, moniliformes, etc.
Le bacille du tétanos prend le Gram et le Claudius; la spore se
colore par la technique ordinaire. La méthode de Ziehl donne de bons résultats.
Le bacille du tétanos est « moins exigeant (sous le rapport de l’anaérobiose) que le vibrion septique : il peut se développer dans des milieux contenant de petites quantités d'oxygène et s'accoutumer à vivre dans un air faiblement raréfié. Dans la pratique des cultures il faut néanmoins le traiter comme un anaérobie strict ».
La culture est possible de 15 à 4%°, surtout abondante de 37 à 3%; il pousse sur tous les miliéux; le bouillon Martin lui est très favorable, tandis que les milieux organiques non sanglants comme l’albumine et le sérum donnent des résultats médiocres.
En bouillon, le bacille trouble le milieu qui s’éclaircit vers le 15° jour avec formation d’un dépôt abondant, la culture dégage des gaz abondants et une forte odeur de corne brûlée. Il y a élaboration d’indol.
En gélatine, développement de colonies ayant l'aspect de petits points nuageux d'où partent des aiguilles concentriques disposées en auréole; la liquéfaction commence à partir du deuxième jour.
En gélose Liborius, aspect analogue, naturellement sans liquéfaction. Le lait est digéré sans être coagulé.
Sur pomme de terre, développement pénible. Vaillard et Vincent ont obtenu sur ce milieu en culture anaérobie des colonies en couche mince, humide, luisante, assez semblables à celles que donne le bacille typhique. Ces colonies sont composées de très longs bâtonnets non sporulés.
Debrand a obtenu des cultures aérobies mixtes de ba cilles du tétanos et de subtilis; dans ces conditions, les propriétés du bacille restent intactes.
D'après Achalme, le bacille du tétanos liquéfie la gélatine, digère le blanc d'œuf par sa sécrétion de trypsine, mais ne fait fermenter aucun des hydrates de carbone usuels; il ne saccharifie pas l’amidon et n'intervertit pas la saccharose.
La spore du bacille du tétanos est très résistante; une ébullition d'environ 10 minutes est nécessaire pour amener sa destruction.
Inoculé aux animaux dans certaines conditions, le bacille du tétanos leur donne la maladie spécifique. Les souris, rats et cobayes sont très sensibles, le lapin résiste un peu mieux; le chien est difficile à infecter; le pigeon et la poule sont réfractaires. La maladie est reproduite par inoculation de terre (procédé non rigoureux puisque la nature des germes injectés est indéterminée), par inoculation de
cultures pures — elle n’est pas reproduite (Vaillard, Vincent et Rouget) par inoculation des spores pures à moins qu'on n'y ajoute soit une culture d'un microbe fût-il non virulent, soit une substance de chimiotaxie négative comme l'acide lactique (1/4 cc.); toutefois l'inoculation faite au sein d’une plaie contuse, insuffisamment protégée par l'impossibilité de la phagocytose, est souvent mortelle. Cette innocuité de la spore pure s'oppose heureusement à son ubiquité et à sa résistance aux agents physiques; elle explique la rareté du tétanos, comme elle permet de comprendre le tétanos a frigore, et le tétanos dit médical ou sans plaie.
L'exposition des spores desséchées à la lumière diffuse leur imprime des modifications profondes qui sont pour nous du plus haut intérêt.
D'abord la germination de la spore est moins rapide; la culture moins abondante; puis les bacilles cessent d'être sporogènes et pathogènes; plus tard la spore perd la faculté de germer. Par contre Vaillard et Vincent ont obtenu des cultures actives avec des spores insolées pendant 59 heures, mais à l'abri de l'air.
Les travaux de Knud Faber, Vaillard et Vincent ont montré que la toxine du bacille du tétanos est aussi nocive que la culture complète. Inoculée à l'animal à dose suffisante, elle reproduit le tétanos typique. Vaillard et Vincent ont obtenu des toxines qui tuent le cobaye au 1/1000° de centimètre cube et la souris au 1/100 000°. La toxine télanique a une affinité particulière pour le tissu nerveux, affinité qui peut se manifester in vitro (Wassermann, Takaki, Metchnikoff, etc.). L'ingestion de toxine est en général inoffensive.
La question de la vaccination et celle de la sérothérapie antitétanique ont été résolues par différents expérimentateurs.
D'abord Behring et Kitasato vaccinèrent des lapins par inoculaüons combinées de toxine et de trichlorure diode, selon le procédé employé pour la vaccination antidiphtérique.
Brieger, Wassermann et Kitasato emploient la méthode infidèle du mélange de culture et de bouillon de thymus. Tizzani et Cattani inoculent des cultures atténuées.
Il faut arriver aux travaux de Vaillard, de Roux et Vaillard pour arriver à la solution véritable du problème.
Voici la technique de Vaillard, pour l'immunisation du lapin.
À 3 jours d'intervalle, on injecte dans une veine de l'oreille
deux doses de 10 cc. d’une culture filtrée chauffée pendant une heure à 60°. Cinq jours après, on injecte 10 cc. du même filtrat chauffé une heure à 55°; enfin après un nouveau délai de 5 jours, on injecte 10 ce. de la culture chauffée à 50° pendant une heure. Dès ce moment l'animal est immunisé; on renforce ensuite l’état réfractaire au moyen d'injections de cultures filtrées pratiquées tous les 8 à 10 jours à des doses croissantes de 5, 10, 15, 30 ce.
Voici, résumée d’après Roux et Vaillard, l'immunisation d’un lapin.
Le premier jour l'animal reçoit sous la peau 3 cc. de toxine tuant la souris à 1/4000°, additionnée de 1 ce. de solution de Gram. Le cinquième jour on injecte de même 5 cc. de toxine + 2 cc. de solution de Gram. Le neuvième jour, on donne 12 cc. de toxine + 3 ce. de solution de Gram. Le dix-septième jour l’immunisation de l'animal est obtenue; son sérum présente la propriété antitoxique; on peut dès lors lui donner de8 jours en8 jours 5, 10, 20, 30, 40 cc. de toxine pure; plus tard on rapprochera les injections et on les pratiquera dans le sang ou le périloine; on peut arriver à donner d’un seul coup jusqu’à 100 à 200 cc. de toxine.
Le cheval est immunisé par une technique analogue.
Avant les injections de toxine, Behring injecte aux chevaux un mélange de toxine et d’antitoxine.
Depuis les travaux de Behring et Kitasato, on connaît les propriétés thérapeutiques du sérum des animaux immunisés. Il faut environ 3 mois pour pouvoir utiliser le sérum d’un cheval dont on entretient l'immunité par des injections hebdomadaires de fortes doses de toxine.
Nous ne pouvons entrer ni dans le détail ni dans la discussion des applications du sérum. En se rapportant aux travaux de Roux et Vaillard, on peut dire que le sérum antitoxique prévient sûrement le tétanos lorsqu'il est injecté avant la toxine tétanique. L'injection simultanée de sérum et de toxine laisse se développer un tétanos bénin local. Lorsque l'injection de sérum succède à l'injection de toxine, les guérisons sont d'autant plus fréquentes que l'intervalle entre les deux injections est plus court.
En pathologie humaine, le sérum se montre tout-puissant pour la prophylaxie du tétanos et les médecins ont accepté la pratique de Nocard, c’est-à-dire l’inoculation préventive de sérum dans le traitement des plaies suspectes. Malheureusement en cas de tétanos
déclaré, les résultats sont variables, et médiocres, même avec la technique de l’inoculation intracérébrale (Roux et Borrel).
Il est donc permis de faire, dans une voie illustrée déjà par de si beaux travaux, de nouveaux efforts.
Signalons, en terminant cette revue trop rapide de la biologie du bacille du tétanos, la propriété agglutinative du sérum antitétanique.
Alors que le sérum humain, prélevé à l’état de santé ou de maladie, n’a aucune action agglutinante, que le sérum normal de cheval et d'âne agglutine le bacille du tétanos au taux de 1 p. 100, le sérum antitétanique agglutine les cultures jusqu'à la proportion de 4 p. 50000. Cette propriété nous servira dans le contrôle de nos recherches.
Il. — Expériences originales. — Nous n'avons pas donné au bacille du tétanos la place d'honneur dans nos recherches, malgré son importance dans la pathologie vétérinaire et médicale, parce que son caractère anaérobie n’est pas absolu.
1° À ce propos il faut rappeler les remarquables expériences de Vaillard et Vincent, et signaler les résultats de Valagussa, Ferran, Belfanti et Pescarolo, Sanchez Toledo et Veillon.
Dans leur mémoire des Annales de l'Institut Pasteur (1891, p. 4), Vaillard et Vincent disent de ce germe : « Il se développe en vase ouvert dans des milieux disposés en couche épaisse, pourvu que l'accès de l'air soil assez limité. Ainsi on obtient des cultures abondantes et rapides sur les milieux bouillon, gélatine, gélose, non purgés d'air, dans un tube étroit bien rempli et hermétiquement clos, ou bien dans une pipette ordinaire simplement étranglée au-dessus du niveau du liquide et sans qu'il soit nécessaire d’obturer l'extrémité ouverte. Les cultures ainsi obtenues sont très actives. Toutefois les cultures strictement anaérobies correspondent le mieux aux propriétés biologiques du microbe. »
D'après Macé, le caractère relatif de l'anaérobiose du bacille tétanique explique la possibilité de sa croissance dans les cultures impures où l'oxygène est en majeure partie absorbé par les espèces étrangères; on pourrait l'habituer à croître dans un air à peine raréfié sans lui voir perdre ses propriétés.
I y a longtemps, Lampiasi (5° réunion de la Société italienne de Chirurgie tenue à Naples en 1888) aurait obtenu des cultures pures d'un bacille sporogène cultivable à l'air sur tous les milieux, dont l'inoculation au lapin et au cobaye produirait le tétanos (?), Ce bacille venait du sang d’un homme et de deux marins atteints de tétanos.
Le 31 mai 1889 Belfanti et Pescarolo font à l’Académie de médecine de Turin une communication intéressante (Voir Centralblatt für Bakteriologie, 20 août et 30 septembre 1889). Ils obtiennent des cultures aérobies virulentes; mais notent que dans la vie aérobie, le bacille modifie sa morphologie; elle varie d’un bâtonnet court et presque arrondi jusqu’à celle d’une baguette de tambour. La virulence du bacille est proportionelle à l’odeur de putréfaction que dégage la culture, elle varie en intensité sans règle fixe. En cas d'atténuation, la culture faite avec une atmosphère d'hydrogène fait reparaître les propriétés pathogènes.
Sanchez Toledo et Veillon décrivant les cultures en gélatine Liborius disent (Archives de Médecine expérimentale, 1890, p. 723) : « Les nuages se développent et s'étendent à mesure que la culture vieillit, et arrivent quelquefois, lorsque la culture est très abondante, à effleurer la surface supérieure de la gélatine. Il semble donc que la culture qui n’a pu commencer qu’à l'abri de l’air peut, une fois qu'elle est en train, se continuer quelquefois en sa présence comme si le bacille secrétait quelque substance capable de réduire l'oxygène ou comme sile développement des gaz leur faisait une atmosphère isolante en se dissolvant dans la partie supérieure de la gélatine... » Ce phénomène auquel les auteurs suivants ont paru attacher plus d'importance que S. Toledo et Veillon euxmêmes, se retrouve d’ailleurs dans la culture en gélose et gélatine Liborius d'un grand nombre d’anaérobies ; il n'empêche pas d’ailleurs les auteurs d'affirmer (p. 725), deux pages plus loin, que le bacille du tétanos est strictement anaérobie.
Valagussa (Annal. d'igiene sperim., VIII, 1898, p. 396), au lieu d'employer les cultures mixtes comme fit Debrand, cultive le bacille du tétanos en culture aérobie dans des bouillons filtrés où se sont développés antérieurement certains germes favorisants comme le bacillus subtilis, le bacillus fluorescens liquefaciens, le proteus vulgaris. Les caractères extérieurs des cultures sont peu
Ke
modifiés; mais à l'examen, on trouve des bâtonnets de 3 à 5 & tout à fait immobiles; de plus le microbe est bien plus fragile et ne fabrique plus sa toxine spécifique. Mais il recouvre son pouvoir toxique à la longue dans les cultures anaérobies, en vivant à l'abri de l'air, au contact de toxine tétanique virulente ou des produits de culture de saprophytes.
Citons enfin le travail de Ferran (Centralblatt für Bakteriologie, XXIV, 1898, p. 27) qui aurait obtenu des cultures aérobies par l'agitation répétée d'une culture en bouillon anaérobie soumise au contact de l'air.
2e Le bacille du tétanos obéit aux lois générales de l’aérobisation tout en présentant quelques caractères un peu spéciaux que nous allons préciser ; les voici :
Les résultats des expériences ne sont pas aussi constants que les résultats obtenus dans nos recherches sur les autres anaérobies. Dans une série même de tubes profonds ordinaires, larges ou étroits, on peut parfois trouver certains tubes négatifs, bien que des tubes plus aérobisés aient donné des cultures; c'est le phénomène de l'aérobisation déréglée. D’autres fois, deux tubes ensemencés de la même façon, dans les mêmes conditions, donnent, l’un un résultat positif, l’autre un résultat négatif : c'est l’aérobisation irrégulière.
Fait plus particulier : dans les contrôles sur gélose inclinée de nos expériences d’aérobisation, alors que l’aérobisation est loin d'être achevée, un tube de gélose donnera accidentellement une abondante culture. Les repiquages de ce tube sont tous négatifs; le germe a épuisé sa force dans cette aérobisation par bonds, adaptation trop rapide à la vie vraiment aérobie.
Enfin, au fur et à mesure de son aérobisation, le bacille tend à devenir moins mobile. Des formes d'involution se montrent dans les premiers tubes, puis le microbe prend une forme plus-courte et plus trapue. En même temps, le pouvoir sporogène diminue dans les milieux ordinaires pour persister plus longtemps dans les milieux albumineux. La spore se détache alors rapidement du
corps microbien, comme dans les cultures du bacillus perfringens.
Sous ces réserves, on peut établir les faits suivants de mensuration de l’anaérobiose et d’aérobisation.
S1 l’on ensemence à la pipette dans les parties basses, avec 7 à 10 gouttes d’une culture anaérobie en tube cacheté bien développée, des tubes profonds de lait, voici les résultats obtenus :
Tous les tubes contenant du lait crémeux poussent, quelle que soit leur hauteur ou leur diamètre; car il s’agit de véritables tubes cachetés.
Tous les tubes profonds de lait écrèmé ayant un diamètre de 1 cm. 1/2 et une hauteur de colonne de liquide de plus de 10 centimètres donnent une culture abondante. Les tubes de9 centimètres donnent des résultats irréguliers et tardifs. Dans les tubes de 8 à 7 cm. 1/2, le bacille végète quelquefois sans altération chimique du milieu : ce sont les cultures que nous avons dénommées histologiques.
Dans les tubes étroits de lait, c’est-à-dire dans les tubes ayant 1/2 centimètre de diamètre, les cultures sont positives franchement jusqu’à 6 centimètres. Des hauteurs de colonne de 4 cm. 1/2 et 4 centimètres donnent encore des résultats appréciables: En tubes capillaires, culture positive quelle que soit la hauteur de colonne du liquide, d’ailleurs avec des résultats irréguliers.
Dans les tubes de À centimètre de diamètre, la hauteur de 8 centimètres est suffisante. Par contre les tubes de culture de 2 cm. 1/2 de diamètre exigent pour donner une culture une hauteur de 16 centimètres de colonne de lait.
Le bouillon et l'eau peptonée donnent les résultats suivants, qui sont surtout nets si on utilise un milieu liquide d’eau peptonée glucose gélatine facile à préparer et très favorable à la culture du bacille du tétanos.
Dans les tubes ayant 1 cm. 1/2 de diamètre, belle culture en 24 à 36 heures au-dessus de 18 centimètres de hauteur de liquide; belle culture en 24 à 96 heures au-dessus de 15 centimètres. De 12 à 15 centimètres on obtient des résultats tardifs, capricieux et irréguliers. Quelquefois, par exception, des tubes de 9 à 12 centimètres ont donné des cultures peu vivaces.
Les tubes larges d’un diamètre de 2 cm. 1/2 ne donnent de culture qu'avec des hauteurs beaucoup plus grandes.
Si on diminue le diamètre des tubes, la hauteur de colonne
minima diminue également comme pour le lait : avec les tubes de 1 centimètre, hauteur minima 10 à 12 centimètres;
Le tube étroit de un 1/2 centimètre donne comme toujours des résultats intéressants; on peut descendre à 6, 5 1/2, quelquefois 5 centimètres.
L'eau blanc d'œuf et l’eau fibrine peuvent être utilisées à cause de la fonction tryptique du bacille. Ces milieux donnent des résultats intéressants mais irréguliers. Examinons d’abord les résultats en eau blanc d'œuf :
Avec un diamètre de À em. 1/2, la hauteur minima de liquide nécessaire varie de 41 centimètres, ce qui donne des résultats bien inconstants, à 16 centimètres environ. Lorsque le tube de fibrine contient un culot de poudre de fibrine de 3 à 4 centimètres de hauteur, et que l’ensemencement est fait dans ce magma, on peut obtenir de très belles cultures avec une hauteur moindre; mais il s'agit alors de conditions spéciales, de cultures en morceaux d'organes, non de véritables cultures liquides. La culture en tubes d’Achalme fermés à des pressions variables constitue la mensuration de l’anaérobiose en gamme de pression : elle donne des résultats assez irréguliers. En général sur lait ou bouillon de 3 à 5 centimètres de hauteur, on obtient de belles cultures en 24 à 48 heures avec un vide de 60 centimètres. Les jours suivants, les tubes fermés avec un vide de 60 à 30 centimètres (pression de 16 à 46 centimètres) se développent progressivement. Avec une pression de 46 centimètres la culture met quelquefois 15 jours à être positive; souvent elle est peu abondante, et même peut rester histologique.
Si l’on compare les chiffres de mensuration d’anaérobiose du bacille du tétanos à ceux obtenus avec les bactéries précédentes, on remarque une identité presque complète; en tout cas, rien ne confirme l'opinion émise par les auteurs classiques d'une moindre exigence d'anaérobiose de ce germe : Vincent a simplement réalisé la culture en tube étroit. Quant au phénomène signalé par Sanchez Toledo et Veillon nous en avons donné la facile interprétation.
De la mensuration de l’anaérobiose on passe aisément à l’aérobisation véritable du bacille du tétanos, qui s'obtient selon la technique générale que nous avons fixée.
Le procédé de la culture en tubes Liborius de gélatine donne des résultats tellement semblables à ceux déjà énoncés dans l’étude du vibrion septique et du bacille d’'Achalme, qu'il nous semble inutile d'y insister.
Par une série de cultures en tubes d’Achalme remplis de lait, de bouillon Martin, d’eau peptonée gélatine, fermés à des pressions croissantes, on arrive progressivement à cultiver le bacille du tétanos dans des tubes de culture ordinaire, tubes bas, à la pression atmosphérique. Le lait est digéré comme dans les cultures anaérobies.
De même les tubes de lait profonds de diamètre ordinaire ou étroits, sont utilisés pour des repiquages en gamme descendante de hauteur de liquide. En partant non de la culture de hauteur minima, mais d'une culture rapidement abondante, on repique tous les 4 à 5 jours des tubes dont le liquide a une hauteur décroissante de 1 à 2 centimètres. Ainsi on ensemence souvent avec le tube initial lait 1 1/2-11, un deuxième tube, lait 1 1/2-10, puis un troisième, lait 1 4/2-9, etc.; si l'intensité de la culture s'’arrête, on fait un repiquage sans diminuer la hauteur, ou même on revient à une hauteur légèrement plus élevée. En définitive, en 5 à 10 Lubes, on obtient la culture vraiment aérobie avec digestion de la caséine; les tubes de gélose inclinée donnent de belles cultures, après ensemencement avec les laits 1 1/2 diamètre, 3 hauteur.
Dans les séries décroissantes en bouillon ordinaire, souvent le microbe perdrait sa vitalité si on n'avait soin de redoubler les étapes, ou même au besoin, en cas de moindre richesse de la culture, de remonter pendant quelques passages la hauteur de la colonne de liquide.
La gamme décroissante d'eau peptonée-gélatine-glucose donne des résultats bien plus sûrs.
3° En somme avec des précautions, on arrive à obtenir la culture sur gélose inclinée. Les caractères en sont les suivants (voir fig. 8) :
Un ensemencement à l’ôse fait développer sur le trajet de la strie du fil quelques colonies arrondies de 2 à 6 millimètres environ de diamètre, sensiblement saillantes, régulières, humides et presque crémeuses. La couleur varie d’un blanc franc à une temte un peu opaline légèrement bleutée ou teintée de gris. Souvent, en parti-
culier lorsque la culture est exposée à la lumière, la teinte devient jaunâtre, sans atteindre jamais la nuance du staphylocoque doré qu’elle rappelle atténuée. Le fil de platine s'en charge aisément au moindre contact, comme il fait d’une culture de bacille de Friedlander. Un ensemencement abondant donne sur gélose inclinée une nappe légèrement teintée en jaune ou presque opaline, rappelant fréquemment les cultures de bacille d'Eberth, aspect identique, malgré la richesse plus luxuriante de la culture aérobisée, à la culture anaérobie sur gélose inclinée ou sur pomme de terre (Vaillard et Vincent).
Sur les milieux sanglants et sur gélose hémoplase, la culture paraît moins homogène; elle est parsemée de petites saillies arrondies qui se détachent sur le fondde la nappe; la teinte de la culture devient un peu plus foncée.
Sur lamelles, bacille court plus large que le bacille cultivé en anaérobie, rappelant comme dimensions lebacille d'Eberth et même le bacille court diphtérique, gramien, c’est-à-dire résistant à la décoloration par l’alcool après l’action de la liqueur de Gram, peu mobile, non sporogène, bien que les repiquages en eau blanc d'œuf sporulent abondamment. Dans les premiers tubes, on trouve soit uniquement, soit en quantité variable des filaments démesurés, des bacilles de forme irrégulière à renflement terminal, coudés, incurvés, massués, granuleux, sinueux, etc.
Cette asporulation, et cette richesse de formes d'involution dans les jeunes cultures aérobies sur gélose inclinée amène un rapprochement avec les résultats déjà cités plus haut de Vaillard et Vincent dans leurs essais de culture anaérobie sur pomme de terre. « Nous avons réussi, disaient-ils ‘, à obtenir la culture sur pomme de terre où le bacille du tétanos forme une couche humide luisante assez semblable à celle que donne le bacille typhique, composée de longs bâtonnels sans renflements ni spores. »
L'inoculation de repiquages de culture sur gélose inclinée en bouillon et lait donne aux animaux la toxhémie convulsive spécifique, légèrement atténuée ou au moins prolongée.
4 Le premier stade de l’aérobisation, stade d'intégrité biolo-
