C. — LES LOIS DE L’AÉROBISATION

Constance de la mensuration. Constance de l'évolution en trois étapes. Retour au type anaérobie de l’anaérobie de reconstitution. Création de races nouvelles par la sporulation aérobie. Perte du pouvoir pathogène et neutralisation du germe. — 1° Nous pouvons, après avoir établi cette première conclusion, passer aux faits généraux qui se dégagent de l'étude comparée des différents germes faite au point de vue de leur aérobisation. Or l'homogénéité des résultats est des plus remarquables. Souvent une expérience faite avec un germe ne diffère de celle faite avec le microbe suivant que par le nom du micro-organisme; et, dans l'exposé de nos recherches, nous avons dû écourter certains paragraphes, qui paraissaient n'être que la reproduction d’un paragraphe d'un chapitre antérieur.

Des tubes de 12 centimètres de hauteur avec un diamètre de 4 cm. 1/2 en lait profond; en eau peptonée gélatine, des tubes de 15 centimètres donnent d’excellents résultats aussi bien avec le bacille d'Achalme qu'avec le vibrion septique ou le bacille du tétanos, etc. Un vide de 40 à 50 centimètres de 10 minutes suffit à la culture initiale des anaérobies en tubes d'Achalme.

Cette similitude dans la mensuration de l'anaérobiose, nous la retrouvons dans la biologie de l’aérobisation. Bacille d’Achalme, vibrion septique, bacilles du tétanos, bacille gracile éthylogène s’aérobisent de la même façon.

L’aérobisation se fait soit en diminuant progressivement la hauteur de colonne du milieu liquide, c’est l'aérobisation en gamme descendante de profondeur, soit en augmentant progressivement la pression dans la culture en série de tubes d’Achalme, soit par délanolisation, soit par culture en gélatine, etc., elle est toujours facile à obtenir et identique à elle-même.

2° De même la biologie des germes aérobisés est calquée l'une sur l’autre. Vibrion septique, bacille d'Achalme, bacille du tétanos, etc., voient leur aérobisation évoluer en 3 phases.

Dans la première, le bacille reste lui-même; cette première étape est caractérisée par la conservalion de toutes fonctions avec

toutefois une certaine atténuation du pouvoir pathogène qui reste spécifique. Mais dans la deuxième phase, nous assistons à un phénomène des plus curieux; la disparition progressive en cultures aérobies de tous les caractères distinctifs du microorganisme, l'intégrité et la conservation des fonctions dans les cultures anaérobies.

N'est-ce pas un fait impressionnant en biologie que cette orientation bilatérale de deux repiquages d'une même colonie? Si le fil de platine ou la pipette se porte sur un milieu aérobie, les ferments s'atténuent, le microbe cesse de digérer le blanc d'œuf, de coaguler le lait, de liquéfier la gélatine; le pouvoir de chimiotaxie négative disparaît, l'aérophilie s'accroît; mais si le même fil de platine ou la même pipette fécondent des milieux sans air, les cultures obtenues, sœurs des cultures neutralisées, gardent la différenciation chimique, fermentative et pathogène.

3° Quelle plus belle preuve de la puissance de l'adaptation au milieu que l'histoire de l'anaérobie de reconstitution! Voici un germe aérobisé du 2° stade né du repiquage en série des germes les plus terribles; il est en train de devenir un germe neutre, indifférent, inoffensif, infermentogène! Eh bien, remettons-le en milieux anaérobies. Souvent d'emblée, quelquefois après quelques cultures, il renaît pour ainsi dire de lui-même et retrouve toute sa différenciation; car il avait dans son innocuité apparente, dans sa neutralité superficielle, gardé pour quelque temps encore la possibilité de revenir à sa différenciation puissante.

L'anaérobie de reconstitution, ainsi que nous l'avons dénommé, a fait retour au type anaérobie strict, tellement qu'il ne lui reste plus rien de son aérobisation passagère : il est revenu au degré d'anaérobiose primitif.

La troisième étape de la vie aérobie est caractérisée par la perte définitive des signes de différenciation. Ici plus de double voie : en culture aérobie, en culture anaérobie même en série, le germe neutralisé a perdu toute énergie; il n’est plus lui-même, il n’est plus capable de le redevenir. Le plus terrible des bacilles s'inocule par centimètres cubes sans impressionner l'animal réacuf!

Même à ce moment, quelques faits de régénération par inoculation massive à l’animal montrent l'identité d'origine. L'innocuité

est d'abord une question de dose, le retour au type primitif une question de longue série d’anaérobiose!

Enfin et surtout la persistance en dernière ligne de l’agglutinabilité par les sérums spécifiques donne la preuve indéniable de l'absence de toute erreur!

4° L'anaérobie de reconstitution fait retour au type primitif; mais la sporulation aérobie fixe, encore qu’inconstamment, le microbe dans ses propriétés biologiques nouvellement acquises.

Si un bactériologue, non prévenu de ces faits, rencontrait dans ses recherches un microbe aérobie ayant le chimisme, la biologie d’un microbe anaérobie des mieux différenciés, il conclurail certainement à la disparité du microbe initial et de son dérivé aérobie. C'est à cause de cette création de races nouvelles que nous avons pu discuter la question si intéressante de l'identité ou de la non identité du vibrion septique et de la Bactérie septique aérobie. La création de races nouvelles fixées dans leur degré d’aérobisation est un des phénomènes les plus curieux de nos recherches.

5° Même dans les inoculations aux animaux, les expériences sont comparables d’un germe à l’autre. Une grande loi se dégage identique à celle de la perte des fonctions chimiques. Au cours de la vie aérobie, le pouvoir pathogène perd progressivement sa signature spécifique, tend à devenir banal pour disparaitre en dernier lieu. Le bacille du tétanos donne d'abord la toxhémie convulsive spécifique, et le bacille d'Achalme son phlegmon gazeux; plus tard une toxhémie tardivement convulsive succède à l’inoculation du bacille de Nicolaïer; un abcès banal à-pus louable, encore que très concret, va caractériser l’inoculation du bacillus perfringens en voie d'aérobisation.

Plus tard encore, vibrion septique, bacille d'Achalme, bacille du tétanos donneront lieu à ces cachexies mortelles, à ces amaigrissements athreptiques que Thiercelin a rapporté dans l’athrepsie infantile aux toxines de l’entérocoque (Traité des maladies de l'enfance du P' Grancher, 2° éd.). En dernier lieu, le bacillogène devient un microbe neutre et sans importance; son inoculation n’est suivie d'aucun phénomène.

Il n’est donc pas une fonction que l’aérobisation laisse aux microbes anaérobies. Au cours des 3 étapes nouvelles, le pouvoir pathogène s’atténue le premier, le chimisme diminue, se dissocie

et disparaît; la sporulation devient difficile et cesse de se produire, seule la morphologie persiste.

La conservation primitive du pouvoir pathogène en culture profonde aérobie peut éclaircir, entre autres problèmes scientifiques, le rapport de la fonction anaérobie des microbes et des fermentations gangréneuses observées en pathologie, rapport discuté dans ces derniers temps.

Veillon et Zuber, et leurs élèves Guillemot, Rist, Hallé, etc. crurent pouvoir établir à la suite de leurs belles recherches sur les anaérobies que la gangrène des tissus était fonction du caractère anaérobie des germes pathogènes. Cette opinion fut d’abord admise; mais bientôt elle fut considérée comme trop exclusive, en particulier par MM. le P' Roger et E. Weill qui publièrent dans la Presse Médicale (1901, n° 76, 21 septembre) un cas de gangrène bénigne des paupières due à un microcoque aérobie. Dans une étude de la broncho-pneumonie gangreneuse des pneumoconioses parue le 30 avril 1902 dans la Presse médicale, nous avons à ce sujet rappelé la première observation de notre thèse de doctorat en médecine (mai 1900). Cette observation a trait à un cas de bronchopneumonie dont la formule bactérienne consiste en un diplocoque aérobie associé à un bacille anaérobie. Ainsi la présence dans un foyer pulmonaire d'un bacille anaérobie n’entraîne pas nécessairement la déchéance gangréneuse de ce territoire. Lorsque Legros par l’étude de la bactérie septique aérobie eut démontré définilivement l'existence de gangrènes due à un microbe aérobie, on put conclure que la loi de Veillon-Zuber ne pouvait plus être considérée comme absolue. Elle reste pourtant vraie dans la plupart des cas.

Nos expériences apportent à la pathogénie des gangrènes une nouvelle contribution. Les microbes étudiés par Veillon comme le bacillus perfringens ne sont pas gangréneux en tant qu'anaérobies: car ils cessent d'être anaérobies tout en restant gangrénigènes. Il semble même que leur pouvoir pathogène soit différent des fonctions chimiques; car ils cessent d'être gangrénigènes avant de perdre leur pouvoir fermentatif.

De l'émasculation progressive et régulière de ces bacilles justement redoutés pour la constance de leurs effets et dont la virulence semblait faire partie intégrante, il faut rapprocher, au point de vue de la biologie générale, les recherches de Charrin et de Nittis qui rendirent le bacillus subtilis virulent, et celles de Vincent qui a étudié dans les Annales de l’Institut Pasteur (1898) les « Aptitudes pathogènes de certains saprophytes ». Nos recherches forment la contre-partie de ces travaux :

Charrin et de Nittis pour exalter le subtilis employèrent trois procédés : culture sur des bouillons de plus en plus riches en sang; passages au travers de l'animal; éducation sur des milieux artificiels de plus en plus riches en certains poisons diastasiques, comme la toxine diphtéritique. Ils obtiennent par les deux premiers procédés, surtout grâce à l'injection massive à l'animal et à la sélection des espèces une race capable de tuer en moins de 24 heures avec des quantités peu considérables, apte à fabriquer des produits solubles les uns mortels, les autres vaccinants. La maladie reste bactériologiquement locale. Ils concluent que la distinction des microbes en pathogènes et non pathogènes est tout à fait artificielle. Les expériences de Vincent mènent à une conclusion identique, en même temps quelles établissent antérieurement à nos recherches la possibilité d’anaérobiser des aréobies. Il cultive en sacs de collodion intra-abdominaux les saprophytes aérobies; mais il insiste sur la nécessité de donner aux sacs des parois épaisses, et d’y laisser une certaine quantité d'air. A ces conditions indispensables pour l’expérimentation avec le bacille Mégaterium s'ajoute pour le bacillus mesentericus vulgatus la nécessité d’agiter le sac de collodion avant l’ensemencement. Au 6° passage en sac de collodion le microbe a acquis une virulence considérable, puisque 2 gouttes injectées sous la peau de la souris la tuent avec des lésions de péricardite et de pleurésie hémorragique et une septicémie considérable. Fait important par comparaison avec nos recherches «en même temps que le bacille megaterium acquérait de la virulence, on constatait un changement manifeste dans les caractères de ses cultures ». Au lieu d’un voile surmontant le bouillon presque clair, on obtenait des bouillons uniformément troubles; il semblait s'être adapté aux nouvelles conditions d’anaérobiose relative réalisées par la culture en sac de

collodion.

Le bacillus mesentericus vulgatus au 7° passage en sac de collodion tue la souris blanche en moins de 12 heures à la dose de 8 gouttes. Un lapin de 2,530 grammes mourut en 30 heures à la suite de l'injection intraveineuse de 4 cc. d’une culture au 8° passage en sac. Parallèlement à ces variations biologiques, le bacille modifie considérablement les caractères de culture. Au lieu de former à la surface du bouillon un voile dense épais qui envahit la surface interne du verre, on trouve une culture uniquement trouble avec un voile délicat. Examinée après 15 jours la culture est remarquablement pauvre en spores. Enfin sur gélose et sur pomme de terre, le baciile forme une strie opalescente rappelant celle du bacille d’Eberth.

Il nous faut citer en entier le dernier paragraphe qui constate l'adaptation complète à la vie anaérobie, coïncidant avec l'acquisition de propriétés pathogènes :

« Il n’est pas jusqu’à l’un de ces attributs les plus importants et en apparence les plus immuables, à savoir son caractère strictement etessentiellement aérobie, dont notre bacille ne puisse dans une certaine mesure, se dépouiller à son tour.

Malgré son avidité pour l'oxygène, le microbe s’est lentement habitué à vivre dans l’abdomen des animaux, dans des conditions d’oxygénation beaucoup moins favorables. Si avant de fermer la culture en sac et de la mettre dans le péritoine, on additionne le milieu d’un peu de sulfo-indigotate de soude et qu’on retire le sac déjà après 48 heures, on constate que l’indigo a été totalement réduit. Les cultures en sac dégagent une odeur particulière caséeuse analogue à celle des anaérobies et que n'ont pas les cultures faites à l'air libre. Il y a plus : en cultivant in vitro et dans le vide fourni par la pompe à mercure le bacille retiré du sac, on s’aperçoit qu'il s’y développe, quoique très faiblement, alors qu'un échantüillon témoin primitif ne donne lieu à aucune culture. Le bacille modifié trouble le bouillon dans ces nouvelles conditions et réduit l’indigo. La culture anaérobie examinée au microscope montre des bacilles normaux, sans spores, sans formes d’involution. Il y a donc eu véritablement culture dans le vide d’un microbe exclusivement aérobie. Ces essais ont été poursuivis; mais à la deuxième génération, la culture était devenue beaucoup plus faible, et la troisième génération fut nulle !. »

1.1 y a loin de ces faits à la méthode générale de transformation des aérobies en anaérobies facultatifs que nous avons formulée, et qui nous a guidé dans l'étude de l’anaérobisation du bacille du charbon.

D. — L'ALLOBISME; MÉTHODE D’IMMUNISATION

L'application de la diminution progressive du rôle pathogène nous a permis de jeter les bases de l’allobisme, méthode d'immunisation et de vaccination contre les microbes anaérobies.

Dans nos expériences il faut distinguer l'immunisation allobique obtenue par inoculation de toxines et la vaccination allobique obtenue par inoculation de cultures d'abord atténuées puis virulentes. Souvent l'immunisation allobique sera le premier temps de l'allobi-vaccination. L’allobi-sérothérapie devra être recherchée par les injections de sérum d'animaux allobi-immunisés ou allobivaccinés : l’asepsie du sérum sera, dans ce dernier cas, surveillée attentivement.

Dans notre note à la Société de Biologie nous écrivions (séance du 28 juillet 1906) : « Il nous a paru désirable de simplifier autant que possible la méthode et d'aboutir à une technique simple et pratique. Aussi avons-nous rejeté comme difficultueux le procédé qui découlait le plus naturellement de nos recherches et qui consistait à injecter aux animaux successivement des cultures aérobisées du 3°, du 2° et du 1+ stade, enfin des cultures anaérobies. Ce procédé d’ailleurs très bon nécessite l'obtention longue et relativement délicate de cultures du 3° stade. Parallèlement dans l’allobi-immusation nous avons utilisé l’injection successive de cultures filtrées ou mortes ou bouillies des 3 stades, procédés que nous ne recommandons pas, puisqu'il est possible d’être plus simple, » Nous aurons à montrer prochainement l'utilité de l'emploi de cette technique un peu difficultueuse.

Mais en général les immunisations et vaccinalions allobiques utilisent les cultures en lait et bouillon, dont la colonne liquide a une hauteur de 4 à 7 centimètres, et dont le chimisme est conservé, plus tard les cultures initiales en lait et en bouillon profond, c’està-dire les premiers repiquages en tubes profonds de cultures anaérobies. Dans les différents cas, on passe de l'injection de la culture filtrée dans le vide, à la culture stérilisée au formol, mais injectée sans filtration, de manière à injecter les corps microbiens et les toxines; puis à la culture vieillie vivante; enfin à la culture

vivante de 4 à 8 jours. Il faut se souvenir que les cultures en bouillon sont beaucoup moins virulentes et moins toxiques que les cultures sur lait. Les inoculations vont en général de 1 à 5 cc., elles sont faites de 4 en 4, ou de 8 en 8 jours. Aucune nouvelle inoculation ne sera faite sans avoir vérifié le poids de l’animal qui ne doit pas avoir diminué entre deux inoculations. Pour faire tolérer l'injection, il est souvent utile d’injecter en même temps que la culture 2 à 5 cc. de liqueur de Gram, ou 2 à 10 ce. d'iodipine.

Il faut éviter dans ces manifestations l'emploi de cultures sporulées; donc les cultures en eau blanc d'œuf non filtrées ne seront pas utilisées.

Nous avons donné avec l'étude du vibrion septique, une progression de vaccination de cobaye. Nos recherches sur la vaccination contre le bacille du tétanos et le bacille d'Achalme seront publiées dans un travail ultérieur — nous ne voulons les donner qu'après avoir étudié leurs conséquences médicales — elles ne seraient pas à leur place dans un ouvrage de pure biologie.

E. — BACILLES ET BACILLOGÈNES.

Hypothèsesur l’origine des microbes anaérobies pathogènes. — 1° Si le hasard des études bactériologiques faisait rencontrer au cours de recherches un bacille anaérobie et son bacillogène, c’est-à-dire son dérivé aérobie neutralisé, privé de toutes ses fonctions, l'étude de ces deux germes ferait conclure à leur nécessaire séparation. Rien ne les rapproche que leurs caractères histologiques; le bacillogène ne peut plus remonter au type différencié, et des manipulations longues sont indispensables pour passer du bacille au bacillogène. Quelle est du bacille ou du bacillogène la forme primiuve? À vrai dire, l’expérimentation nous fait rencontrer le bacille et non le bacillogène et passer du bacille au bacillogène, et non vice-versa. Néanmoins, de la comparaison et de l'étude de ces deux variétés est née dans notre esprit cette hypothèse que le bacillogène est le microorganisme initial et que le bacille est un

microorganisme transformé et différencié par adaptation à la vie parasitaire.

La nature va du simple au complexe, et non du complexe au simple. Un germe parasitaire ne saurait primitivement exister, il ne peut être qu’une forme d'adaptation au cours de l’évolution des êtres organisés. Le bacillogène, micro-organisme indifférent, s’est trouvé par le hasard des conditions d’existence des animaux, transporté dans un organisme supérieur; en s’y développant, il a acquis pour assurer son existence des fonctions nouvelles qui se sont sélectionnées, et qui grâce à la sporulation sont devenues définitives. Ainsi est né le bacille, ainsi peut-être, continue à se faire la transformation incessante de micro-organismes libres et indifférents en bactéries parasites et pathogènes.

2° Faut-il en présence de ces phénomènes prononcer le nom de transformisme microbien? La question doit être réservée. Car si en faveur de cette théorie, on invoque la métamorphose complète qui accompagne l’aérobisation du germe et l'incapacité absolue pour le bacillogène de revenir à un moment donné au type bacille, il est facile de répondre que le bacillogène porte, malgré sa neutralisation, en lui-même la direction de sa différenciation. Un bacillogène tétanique, tant qu'il peut faire retour au lype anaérobie, redonne un bacille du tétanos; notre méthode permet toujours de passer du vibrion au vibriogène, etc. Quant à quelques faits rares, semblables à ceux que nous avons signalés à la fin de l'étude du bacille d'Achalme, nous ne les avons pas reproduits systématiquement. Dans ces conditions, nous préférons les considérer uniquement comme une indication de nouvelles recherches !.

1. Depuis la rédaction de ce mémoire, nous avons pu, avec la collaboration de notre maître et ami Thiroloix, découvrir et étudier la transformation du bacille du rhumatisme articulaire aigu en entérocoque (Sociélé médicale des hôpitaux, octobre 1907).