A. — PROCÉDÉS DE CULTURE

Le problème bactériologique de l'étude des microbes anaérobies doit résoudre trois questions :

1° Étant donnée une humeur organique, par quel procédé peuton isoler les microbes anaérobies, qu'elle est supposée contenir?

2° Les microbes étant isolés, quel est le procédé de culture le plus simple pour en faire l'étude?

3° Quelle technique devons-nous utiliser pour conserver des échantillons?

La réponse à ces trois questions est la suivante :

1° Le procédé le plus simple de séparation des microbes anaérobies est le tube de gélose profonde ou tube de Liborius-Veillon, à condition d'appliquer notre procédé de la boîte de Pétri.

2 Le tube de culture et d'étude des microbes anaérobies, une fois isolés, est notre tube cacheté, avec sa variété le tube cacheté étranglé et ses applications le ballon cacheté, le ballon cacheté étranglé. Sa rigueur est absolue malgré sa simplicité.

3° Le tube de conservation des microbes anaérobies est le tube imaginé par Achalme; nous en avons donné la première description dans notre thèse de doctorat en médecine.

Voici le mode de préparation de ces différents procédés de culture : ‘

1° Description du tube de gélose profonde (Liborius-Veillon) . — Le procédé de la culture en gélose profonde a été décrit par Liborius en 1886 dans son mémoireintitulé : Beiträge zur Kenntniss der Sauerstoff bedürfnisse der Bakterien (Zeitschift für Hygiene, Bd 1). Malheureusement Liborius, pour isoler les colonies, expulsait le cylindre d'agar dans une boîte de Pétri; après un seul examen, la culture devait être rejetée et l'étude successive des colonies souvent longues à se développer devenait impossible. Veïllon et son collaborateur Zuber imaginèrent le prélévement des colonies à la pipette (Recherches sur quelques microbes strictement anaérobies et leur rôle en pathologie, Archives de Médecine expérimentale, juillet 1898).

Leur technique peut se terminer ainsi (voir fig. 1) :

On remplit d’une gélose bien transparente additionnée de glucose à la dose de 4 à 2 p. 100 de tubes à essai (22 cm. de long sur 15 mm. de diamètre) de manière que chaque tube contienne une colonne de 12 centimètres environ.

Au moment de l’ensemencement, on fait chauffer au bain-marie le nombre de tubes jugés nécessaires jusqu’à liquéfaction complète de la gélose. Les tubes sont alors mis à l'étuve à 40°, ou simplement mis au bain-marie dans l’eau maintenue tiède par la chaleur d'un petit brùleur de bec Bunsen.

Lorsque le tube pris à la main semble revenu à 40° ou même lorsque la joue peut supporter son contact, on ensemence dans un premier tube avec une pipette le produit à étudier, en ayant soin d’agiter la pipette au sein de la gélose. On prélève ensuite, avec une autre pipette,un peu de la gélose du tube n° 1 pour ensemencer le tube n°2 et ainsi de suite. Il faut en dernier lieu mettre les tubes dans l’eau froide qui provoque la prise de la gélose, avant de les porter à l'étuve à 37°. Cette précaution n'est pas indispensable.

On examinera les tubes de jour en jour; on notera les caractères des colonies apparues, et on les isolera par la manœuvre suivante :

On à eu soin auparavant de préparer des pipettes longues à partie effilée rigide, ce qui est possible en utilisant des tubes de 6 mm. de diamètre. Il devient facile d'aller à «la pèche» des coloniesmême

1. Pour la technique générale des cultures des microbes anaérobies, voir Roux, Annales de lInslilut Pasteur, Macé, Besson, Bezançon. Traités de Bactériologie. les thèses de doctorat en médecine de Guillemot (1899), Rist (1898), Tissier, Hallé (1898), Cottet (1900), etc.

fines développées dans la gélose en se conformant aux recommandations de Guillemot (thèse p. 40). Un tube en caoutchoucsouple de diamètre moyen, assez résistant, long de 40 centimètres, est fixé à la pipette par une extrémité, adapté par l’autre à un tube de verre de même diamètre qui est reçu dans la bouche. La colonie à prélever est repérée à la loupe : il suffit alors d'aller à sa recherche sous le contrôle de la vue avec la pipette épointée pénétrant dans la gélose. Une légère aspiration permet d'introduire la colonie dans l'effilure de la pipette. Cette colonie servira à ensemencer des tubes de gélose profonde préalablement fondus et maintenus à une température de 40°, comme il a été indiqué.

Les avantages de cette technique sont considérables : le tube, après prélèvement d’une ou de plusieurs colonies, n’a rien perdu de sa rigueur anaérobique, ni de sa pureté; l'étude en séries de colonies à apparition successive ne présente aucune difficulté. Si quelques colonies seulement se sont développées, un premier repiquage donnera d'emblée une culture pure; et la séparation se fera aisément. Il n’en est pas malheureusement de même dans les tubes initiaux riches en colonies : la pipette dans son passage peut se charger de germes étrangers à la colonie visée, d'où nécessité de faire de nouvelles manœuvres d'isolement avec les tubes de deuxième série, d’où obtention tardive des espèces pures, ayant perdu tout ou partie de leurs propriétés pathogènes. La technique de séparation risque de devenir tellement fastidieuse qu'elle écarte le bactériologue de pareilles recherches.

2° Pour remédier à ces inconvénients, nous avons imaginé le procédé de la boîte de Pétri, dont voici la description :

Dans la recherche à la pipette de la colonie à isoler, l'opérateur aura soin d’aspirer dans l’effilure de la pipette la colonie intacte, manœuvre facile avec les petites colonies, difficultueuse il est vrai avec les colonies vivaces. Cette manœuvre sera facilitée par le soin apporté à la confection des pipettes dont la partie effilée doit avoir une longueur maxima de 10 centimètres, et un diamètre de près de 1 mm. Nous recommandons également de briser l'extrémité de la pipette de manière à obtenir une section irrégulière et tranchante qui aide singulièrement la progression dans la gélose.

La pipette est retirée, elle contient dans sa partie effilée la colonie

à isoler : au lieu d'ensemencer immédiatement une nouvelle série de tubes de Liborius, il faut avoir soin de rejeterle minime cylindre de gélose à l'intérieur d'une boîte de Pétri, stérilisée précédemment au four Pasteur selon la méthode classique, et entourée de papier à filtre.

Dans la boîte de Pétri, la colonie servira à une double série de manœuvres. D'abord un lavage au bouillon stérile la débarrassera des germes accessoires ramassés par la pipette; d'autre part, après isolement de son cylindre de gélose, le prélèvement d'une parcelle permettra avant l'ensemencement un examen microscopique. Le procédé de la boîte de Pétri donne rapidement des cultures pures, et contrôle rigoureusement l'isolement des colonnes fait autrefois moins exactement.

3° Tube cacheté. Tube cacheté étranglé. Ballon cacheté simple ou étranglé (fig. 2). — Le tube cacheté ramène la culture en milieu liquide des microbes anaérobies à la simplicité de culture des microbes aérobies. Voici la technique bien simple de sa préparation : des tubes à culture ordinaires sont remplis de bouillon d’eau peptonée, d’eau blanc d'œuf ou de lait comme s'il s'agissait de préparer les milieux ordinaires. Mais on verse dans chaque tube une légère quantité de lanoline fondue, de manière à surmonter la colonne liquide d’une bague d'un demi-centimètre de cette substance. On stérilise à l’autoclave, un quart d'heure à 120° comme si aucune addition de lanoline n'avait été effectuée. Retiré de l’autoclave, après refroidissement, le tube cacheté se présente comme un tube contenant une colonne de liquide rigoureusement emprisonné par la bague solidifiée de lanoline. I serait impossible de distinguer un tube cacheté de houillon, d’un tube de gélatine surmonté de lanoline; le bouchon de lanoline adhère aux parois du verre, il ne laisse passer ni les liquides, ni les gaz, et cependant son emploi est des plus simples.

Prenez un tuhe cacheté par son extrémité inférieure, et présentez latéralement à la flamme du bec Bunsen la partie contenant le cylindre de lanoline, en roulant le tube entre les doigts. Rapidement, car la lanoline fond à 42°, la bague solide se liquéfie, le tube cacheté est devenu un tube liquide aussi facile à manipuler que le tube vulgaire de bouillon. Mais, fait de premier ordre, pendant

toute la série des manipulations, prises, réensemencements, additions, etc., qui doivent se faire à la pipette, la colonne liquide de lanoline interdit un contact quelconque entre l’air atmosphérique et le milieu. Les manœuvres terminées, il suffit de mettre le tube cacheté dans un verre rempli d'eau pour que la lanoline se reprenne ; il est remis à l’étuve, n'ayant rien perdu de sa valeur. Il est évident que le tube cacheté ne supporte pas l'emploi du fil ordinaire de platine.

Le tube cacheté peut se conserver longtemps avant d’être utilisé. Toutefois, si des tubes préparés n'étaient pas utilisés dans un délai de 2 à 3 mois, nous conseillons de les soumettre à une nouvelle ébullition, ou mieux de les porter dans l’autoclave 5 minutes à110°.

Nous avons contrôlé la valeur du tube cacheté par une double série d'expériences, destinées à vérifier la rigueur de son imperméabilité d’une part, la valeur de son anaérobiose de l’autre.

a. Sur la lanoline d’un tube de lait cacheté, on introduit à la pipette une petite quantité de culture sur lait de bactérium coli. Le lait sous-jacent à la lanoline n’est pas coagulé.

La même expérience renversée est également positive : une culture en lait cacheté de bactérium coli ne contamine pas du lait stérile recouvrant la bague de lanoline.

De même des tubes de lait cacheté sont conservés débouchés au laboratoire; le lait reste stérile. Une culture de moisissures versée sur la lanoline ne traverse pas la bague obturatrice.

b. Le tube cacheté est imperméable aux substances colorantes. Il l'est de dehors en dedans, car les solutions de thionine, fuchsine, bleu de méthylène, éosine, versées sur la bague de lanoline, ne la traversent pas. Il l’est également de dedans en dehors.

c. Le tube cacheté est imperméable aux produits chimiques; il ne laisse aucune réaction s'effectuer de dedans en dehors ou de dehors en dedans. Car des tubes cachetés remplis de liqueur de Gram, perchlorure de fer, acétate de plomb et amidon en solution aqueuse ont été respectivement recouverts de solution d’amidon, ferrocyanure de potassium, iodure de potassium, eau iodée. Aucune réaction chimique ne s’est effectuée.

d. Le tube cacheté est imperméable aux gaz. Malgré la colossale puissance de cet antiseptique, quelques gouttes de formol versées sur le bouchon d’ouate n'entravent pas les cultures en tubes

cachetés. Bien plus, les gaz produits dans les fermentations microbiennes repoussent la lanoline, mais ne la traversent pas. Ce phénomène nous a conduit à notre deuxième type de tube cacheté : le tube cacheté étranglé.

Les expériences suivantes, faites sous le contrôle de Nicloux, dans le laboratoire de M. le professeur Budin, d'après la méthode de notre maître Gréhant, établissent la faible teneur en oxygène de nos tubes.

a. Quatre tubes de lait cachetés contenant 32 cc. ont laissé, à la pompe à mercure, se séparer 2 cc. 35 de gaz, dont 1 cc. 95 de CO° (épreuve de la potasse) et 0 cc. 03 seulement d'oxygène (dosé par l'acide pyrogallique).

b. Quatre tubes d'eau peptonée cachetés préparés par addition à des tubes d’eau peptonée bouillie d’une bague de lanoline (préparation en deux temps) contenaient 30 cc. de liquide. La pompe à mereure en extrait 0 cc. 6 de gaz dont 0 ce. 35 d'acide carbonique (épreuve de la potasse) et seulement des traces d'oxygène.

c. À titre de comparaison, nous avons vu que quatre tubes de gélose profonde de Liborius contenant 39 cc. 5 de gélose sucrée renfermaient À cc. 21 de gaz dont 0 cc. 73 de CO? et des traces d'oxygène.

Ces expériences démontrent scientifiquement et mathématiquement la rigueur de notre nouveau procédé de culture.

Aussi Besson dans son traité classique en a-t-il fait le procédé recommandé.

Cependant le tube cacheté tel que nous venons de le décrire a un inconvénient né d’ailleurs de sa rigueur : le dégagement considérable de gaz fréquent dans les cultures anaérobies peut projeter au loin lanoline et bouchon d'ouate; la culture est alors exposée à toutes contaminations,

Dans ce cas, d’ailleurs, la gélose profonde du tube Liborius éclate; le tube d'Achalme fait explosion, ainsi que Thiroloix l'a signalé dans ses recherches sur le sang des rhumatisants.

Il est facile dans notre technique de remédier à ces difficultés par l'emploi du tube cacheté étranglé.

Le tube cacheté étranglé est un tube ordinaire de culture dont la partie moyenne a été légèrement effilée à la flamme. Ce tube sera rempli de milieu liquide jusqu'à l'extrémité inférieure de la partie étranglée. La lanoline occupe la partie rétrécie sur une hauteur de

un demi à un centimètre. On stérilise à l’autoclave et on utilise comme un tube cacheté ordinaire.

Que produit le dégagement de gaz dû à la fermentation microbienne dans un semblable tube? I1 occasionne le refoulement du bouchon de lanoline de la partie étroite du tube dans sa partie supérieure de diamètre ordinaire. Les gaz s’échappent, mais le bouchon d’'ouate n’est ni expulsé ni atteint; le lendemain, un léger chauffage au brûleur Bunsen redissout aisément la lanoline et recachète le tube.

La projection de l'anneau de lanoline dans la partie large du tube, dira-t-on, enlève à la culture son caractère rigoureusement anaérobie. Cette objection est pratiquement sans valeur; la culture est protégée contre le contact atmosphérique par le dégagement incessant et l'expansion des gaz de fermentation; jamais nous n'avons observé d’arrêt ou de ralentissement de prolifération.

Est-il maintenant nécessaire de décrire longuement le ballon cacheté ou le ballon cacheté étranglé? Le procédé de la bague de lanoline est indépendant de la forme et de la capacité du tube, vase, ou ballon de culture. Le ballon cacheté est un ballon rempli d’un milieu liquide jusqu'à l’origine du col; une bague de lanoline surmonte le liquide. Le ballon cacheté étranglé contient le cylindre de lanoline dans une partie de son col préalablement étranglée.

A ce propos, il est nécessaire de faire une simple remarque de technique pratique.

Dans la préparation du ballon cacheté, le niveau du liquide devra dépasser de deux à trois centimètres la naissance du col; il en sera de même pour le ballon cacheté étranglé. Faute de cette précaution, la bague après stérilisation pourrait descendre dans la partie large du ballon; d'où nécessité d'ajouter à la pipette du bouillon ou du lait stérile, manipulation qui comporte toujours un certain risque d'infection.

Uniquement désireux de décrire nos expériences, nous voulons cependant montrer à quelles méthodes compliquées ont recours certains auteurs. Voici, par exemple, «le procédé simple préconisé par Lothar Dreyer pour cultiver conjointement et concurremment les bactéries aérobies et anaérobies! ».

1. Analysé par A. Marie dans Bulletin de l’Institut Pasteur, 1907, p. 5.

« On ensemence avec l'humeur à étudier de la gélose inclinée, dont ensuite on recouvre la moitié inférieure avec de l’agar liquéfié, en prenant soin de tenir verticale la surface ensemencée : sur la moitié supérieure de celle-ci se développent les microbes aérobies; sur l’autre partie recouverte par la gélose pousseront les anaérobies, à la condition qu'il ne s'agisse pas d'anaérobies stricts », et d’ailleurs les microbes vont-ils supporter ce contact avec de la gélose versée chaude?

Nous voulons par contre signaler le tube de Legros. Cet auteur a utilisé pour la culture des anaérobies des tubes ordinaires recouverts d'huile de vaseline, procédé élégant, mais insuffisamment rigoureux, encore qu'il puisse être utilisé pour les anaérobies peu exigeants.

4° Le tube d'Achalme (fig. 3). — Pour conserver une culture, soit

que cette culture sporule et constitue une réserve de graine de microbe, soit que l’on veuille dans un but de démonstration, con-

server un tube caractéristique, il faut utiliser le tube d’Achalme. En voici la préparation et le mode d'emploi.

Un tube ordinaire de lait, bouillon ou sérum liquide est ensemencé. Dans un premier temps on suture à la flamme, à la partie supérieure, une baguette de verre de 7 cm. de longueur environ. Dans un deuxième temps, en tenant le tube par le fond et par la baguette, on flambe circulairement à la soufflerie sa partie moyenne; on l’étire légèrement, après l'avoir retiré de la flamme lorsque le verre se ramollit, de façon à produire un étranglement séparant la partie du tube contenant le milieu de culture de la partie supérieure. Cette portion amincie doit avoir 2 mm. environ de diamètre ; elle ne doit pas être flexible.

Dans un 3° temps, en chauffant la partie supérieure du tube, on détermine un deuxième rétrécissement, au niveau duquel on brise le tube : il se présente alors de la manière suivante :

La partie inférieure ou fond du tube est surmontée d'une partie rétrécie, puis d'une partie plus large qui se continue à nouveau par un segment effilé. Il suffit alors dans un 4° temps d'introduire l’effilure terminale dans le tube en caoutchouc de la trompe à eau, et de faire fonctionner la trompe. Lorsque le vide est fait, la fermeture au bec de Bunsen de l'effilure première fait obtenir une

culture en Lube de verre clos, que l'on peut conserver indéfiniment.

Une modification préconisée par Achalme facilite la conservation de son tube après examen de la culture.

Un nouvel étranglement fait au-dessus du niveau du liquide permet de régénérer le tube qui est fermé à nouveau après production d'un étranglement à la flamme du bec Bunsen.

Le tube d'Achalme est devenu le point de départ de procédés moins rigoureux et simplifiés de culture des anaérobies en milieux liquides. Citons en particulier le procédé de Biffi (Un método nuevo para el cultivo rapido de los microbios anaerobios estrictos, Bulletin de l'Académie de Médecine de Lima, 1904, n° 2). L'auteur emploie des tubes de culture ordinaires qu'il fait bouillir et laisse refroidir avant l’ensemencement, Quand l’ensemencement est effectué, il fait une effilure à la partie supérieure du tube, fait bouillir à nouveau la partie haute du liquide, et ferme à la lampe pendant le dégagement de vapeur.

Ce procédé pour être simple ne paraît pas d’une technique rigoureuse, puisqu'il expose les germes ensemencés à être détruits par la chaleur propagée de la partie haute à la partie basse du liquide.

B. — TECHNIQUE SPÉCIALE DE L'AÉROBISATION DES ANAÉROBIES

I. La première manœuvre de l’aérobisation est la vérification de la fonction anaérobie par l’épreuve que nous avons dénommée la mensuration de l’anaérobiose; elle se pratique essentiellement de deux façons par la culture à des pressions graduées, et par la culture dans des tubes à diamètre variable contenant une colonne de liquide de hauteur plus ou moins grande.

1. Mensuration de l’anaérobiose. — 1° Par variation de la pression supportée par le liquide. -— L’étuve à anaérobies de Roux serait applicable à cette recherche puisqu'il serait simple d'y graduer le vide; mais il faudrait avoir une série d’étuves, chose peu pratique, ou faire l'expérience en modifiant sans cesse la pression, ce qui allongerait indéfiniment la recherche, et immobiliserait cet

appareil. Il faut donc utiliser le tube d'Achalme. Voici notre dispositif (voir figure 4).

Une trompe à eau permet de faire le vide dans un tuyau métallique fermé à ses extrémités par deux robinets; un manomètre indicateur du vide est branché sur ce tuyau. Le tube métallique se continue par un tube de caoutchouc à parois épaisses, capable de résister à la pression atmosphérique. C’est à ce tube de caoutchouc que sera adapté le tube achalmisé où on fera le vide. Il est facile de comprendre que nous pourrons obtenir un vide plus ou moins grand de deux façons différentes, soit en modérant le débit de l’eau aspiratrice, soiten modérant l'aspiration par l'ouverture incomplète du robinet situé à l’origine de notre tube métallique. Les deux procédés sont également simples, pratiques et faciles à réaliser.

Voulons-nous obtenir une culture avec un vide de 76 centimètres, vide aussi complet que possible, anaérobiose relativement ‘ absolue ? Nous procéderons ainsi : un tube ordinaire de culture ensemencé est traité comme pour en faire un tube d'Achalme, mais on s'arrête au 4° temps, c'est-à-dire au moment de faire le vide. On ouvre au maximum le robinet de prise d’eau, auquel est adaptée la trompe à eau et on ferme le robinet sur lequel s'adapte le caoutchouc, c'est-à-dire le 2° robinet du tube métallique. Après 5 minutes le manomètre monte à 75° ou 76°, il suffit alors d'adapter le tube préparé à l'extrémité du caoutchouc, puis d'établir la communication entre le tube et la trompe, par ouverture du 2° robinet préalablement fermé. Pendant cette manœuvre, l'aiguille du manomètre a pu légèrement osciller ou descendre; elle est arrivée à 70 ou 68 par exemple. Rapidement elle revient à 75. Le tube sera pendant 5 à 10 minutes soumis à l'aspiration; le phénomène de l’ébullition dans le vide par dégagement des gaz dissous dans le milieu de culture sera constaté. Dans le cas présent, il sera permis de lécher légèrement le fond du tube avec la flamme d'un bec Bunsen, de façon à élever quelque peu la température du milieu et à favoriser l'extraction des gaz. Cette manœuvreintroduirait une cause d'erreur dans les cultures faites à de simples raréfactions de pression. Après 5 à 10 minutes, le bec Bunsen placé sous le rétrécisse-

1. L'anaérobiose absolue a été réalisée par Chamberland gràce a une combinaison de flacons communicants, dont l'un contient une culture de subtilis. Une telle rigueur est absolument inutile, quel que soit d’ailleurs l'intérêt de la recherche biologique.

ment fermera le tube pendant que le vide continue à se maintenir.

Voulons-nous faire une culture avec une pression de 25 centimètres par exemple? La trompe à eau est mise en fonctionnement, robinet externe fermé. Mais dès que l'aiguille du manomètre marque un vide de 40 centimètres à 45 centimètres, chiffre légèrement inférieur au chiffre recherché, on diminue l'aspiration par la fermeture incomplète du robinet d'écoulement de l’eau, ou par celle du 1% robinet de la canalisation. Il suffit alors d'adapter le tube préparé à la trompe et de manœuvrer le robinet de réglage pour laisser l'aiguille atteindre 50°. Après 10 minutes, on ferme au bec Bunsen comme il a été indiqué. Au cours de la manœuvre, fréquemment l'aiguille du manomètre reste immobile, c'estle cas le plus favorable. Si elle varie dans un sens ou dans un autre, il suffira de diminuer ou d'augmenter l'ouverture du robinet de réglage pour ramener l'aiguille au chiffre voulu. Il faut surtout se défier des ouvertures ou fermetures de robinets (prises d'eau ou ascenseur à eau, etc.) branchés sur la même canalisation et capables de produire de brusques modifications de débit. Le robinet de la trompe à eau dans une installation neuve sera, si possible, indépendant. Après leur préparation faite à la température moyenne du laboratoire, les tubes seront mis à l’étuve et laissés le temps nécessaire au développement des bactéries. Si par exemple tous les tubes fermés à un vide de 30 centimètres et plus ont poussé, on dira que le germe exige une anaérobiose de 30 centimètres, ou une pression de 46 centimètres, etc.

La question est souvent un peu plus complexe, car certains tubes donnent un développement du microbe, mais sans présenter les modifications spécifiques du milieu ; ainsi une bactérie coagulant le lait, exigeant une anaérobiose de 40 centimètres par exemple, pourra se développer dans un vide de 30 à 35 centimètres sans altération du liquide. Ce sont là les cultures que nous avons dénommées histologiquement positives.

2° Le deuxième procédé de mensuration de l'anaérobiose est la culture des anaérobies en tubes profonds. Sous ce nom nous avons dénommé des tubes de culture ordinaires ayant le diamètre habituel des tubes à essai, c'est-à-dire 15 millimètres, mais présentant une longueur de 22 à 25 centimètres; ils peuvent contenir une colonne de

liquide ayant jusqu’à 18 et 20 centimètres de hauteur (fig. 5). Tous les anaérobies stricts ensemencés non parcimonieusement à la pipette se développent abondamment dans le tube profond, à partir d’une certaine hauteur constante pour chaque germe et pour chaque milieu, hauteur d'autant plus faible que le milieu plus compact a moins de tendance à se laisser pénétrer par l’air atmosphérique, et qu'ilest plus favorable à la pullulation du germe étudié. Nous aurons à signaler plus loin l'importance du diamètre. Toutefois les spores exigent souvent pour germer d'être ensemencées en tube cacheté.

On rejettera dans ces expériences l'emploi du lait ordinaire, car le tube de lait passé à l'autoclave, se cachète véritablement grâce au bouchon de crème qui le surmonte. Si on employait du lait de bonne qualité, on serait surpris de voir les anaérobies pousser dans les tubes contenant une hauteur de liquide de 3 à 4 centimètres. Malheureusement le fait n'est pas assez constant pour entrer dans la culture pratique des germes anaérobies. Il faudra utiliser un lait soigneusement écrémé. Nous donnons la préférence à certains laits écrémés par des procédés spéciaux que fournit le commerce, car l'écrémage par ébullition préalable nous a paru insuffisant. Dans un mémoire intitulé : Bacillus Putrificus et Bacilles anaérobies, paru dans les Annales de l'Institut Pasteur, 1905, Antoine Rodella a confirmé le fait en écrivant que les bactéries anaérobies « se développent très bien dans le lait entier stérilisé, la matière grasse faisant une couche superficielle épaisse, suffisant à mettre les anaérobies à l'abri de l'air ».

Il faudra se garder aussi d'employer des milieux fraîchement autoclavés, ils seraient également trop favorables. Le milieu ayant expurgé l'air dissous donne une culture faussement aérobie. Un milieu sera utilisable de 8 à 30 jours après sa sortie de l’autoclave. Par principe nous ne nous servons d'aucun milieu ayant plus de deux mois de préparation.

L'étude du tube profond par la constatation nouvelle de l'importance capitale de la hauteur des milieux liquides appela notre attention sur la valeur du diamètre des tubes employés; d'où la description du tube étroit, dont le type est un tube de culture ayant un demi-centimètre de diamètre (figure 5). La hauteur du liquide nécessaire aux cultures est fonction du diamètre des tubes. Si un tube moins large que le tube ordinaire donne

des cultures avec une hauteur moindre, un tube de 2 cm. 1/2 de largeur nécessite une hauteur qui l’exclut de la bactériologie pratique. Nous n'avons pu établir aucune règle mathématique, aucun rapport précis entre la hauteur exigée et le diamètre des tubes. Aucune parücularité biologique différente des lois générales de l'aérobisation ne découle de l'étude du tube étroit. Quant au mécanisme du tube étroit, il résulte du moindre contact entre le liquide et l'air atmosphérique. Ainsi les tubes étranglés, les ballons étranglés se comportent comme des tubes étroits si le liquide arrive au niveau de l’étranglement. S'il arrive au-dessus ou au-dessous de l’étranglement, ils se comportent comme des tubes ayant uniformément le diamètre que présente le tube au niveau du liquide.

II. — De la technique générale de la mensuration de l’anaérobiose, résulte la technique de l’aérobisation des anaérobies, ou du moins les procédés essentiels de cette aérobisation.

4° Soit un microbe anaérobie qui s'est développé en tube d’Achalme à 30 centimètres de vide ! dans un tube de 1 cm. 1/2 de diamètre contenant une colonne de liquide de 5 centimètres. Une série de repiquages faite de 5 en 5 jours par exemple à des pressions de plus en plus fortes donnera des cultures exigeant un vide de moins en moins marqué; on arrivera ainsi par étapes à la culture pratiquée à la pression atmosphérique.

Dans cette aérobisation par gamme ascendante de pression, il faudra avoir soin de faire le réensemencement à la pipette, avec 7 à 10 gouttes de la culture primitive. Un réensemencement à l’üse ou à la pipette fermée introduirait trop peu de germes dans le nouveau tube de culture; un ensemencement trop riche serait une greffe. Lorsque l'aérobisation sera achevée, les repiquages se feront aisément par n'importe quel procédé.

Il est important de ne pas utiliser le tube ayant supporté la pression maxima; souvent les repiquages en sont négatifs même à une pression inférieure à la sienne. On prendra le tube de pression moyenne : par exemple soit un tube de culture anaérobie, dont

la mensuration donne des cultures positives jusqu'à un vide de