DEUXIÈME PARTIE

A. — CHOIX DES MICROBES; VÉRIFICATION DE PURETÉ ET CONTROLE DES CULTURES

Pour établir d’une manière indiscutable les faits nouveaux annoncés, il était important de faire un choix judicieux des germes anaérobies soumis à l'expérience. Certains d'entre eux comme le bacillus ramosus jouent un rôle important dans la pathologie humaine, en particulier dans la gangrène pulmonaire (Guillemot); malheureusement leur étude biologique, trop récente encore et insuffisamment documentée au point de vue de la recherche des fermentations, n'aboutit pas à des constatations biologiques ou expérimentales d'une netteté suffisante pour que soit écartée l'hypothèse toujours troublante d'une contamination des tubes au cours des expériences : nous rappelons en effet toute la valeur des fermentations d'hydrate de carbone dans le déterminisme microbien. Nous nous sommes donc contenté au moins à titre provisoire d'une vérification générale de nos expériences pour le bacillus ramosus, le staphylococcus parvulus, le bacillus bifidus, dont l'étude présente cependant un grand intérêt. Nous avons peu insisté sur certains microbes comme le bacille gracile éthylogène dont nous avons donné avec Achalme la première description. Notre effort essentiel a porté sur des anaérobies à la fois hautement différenciées, et fréquemment étudiées. Le bacille d'Achalme ou bacillus perfringens, le vibrion septique dont l'étude remonte à

Pasteur même, le bacille du tétanos ont été suivis avec soin dans les différentes phases de leur aérobisation.

L'origine de nos cultures est double :

Pour le vibrion septique et le bacille du tétanos, nous avons utilisé des cultures initiales fournies avec beaucoup d'amabilité par la collection de l'Institut Pasteur et par notre collègue et ami Martin, médecin de l’hôpital Pasteur. Pour le bacille d’'Achalme, le vibrion septique et le bacille du tétanos, nous avons utilisé, en outre, des cultures mères sporulées données par Achalme que nous sommes heureux de remercier ici. Ces cultures provenaient de ses recherches sur le groupe tryptobutyrique des bactéries anaérobies, qu'il a décrit dans les Annales de l'Institut Pasteur, sept. 1902.

Quelle que soit leur origine nos cultures initiales ont toujours été soumises à un contrôle de pureté et d'identité.

a. Tout d’abord les repiquages abondants faits à la pipette sur gélose inclinée sont négatifs. Ces tubes de gélose sont conservés longtemps au laboratoire pour éliminer l'hypothèse d'une contamination d'une bactérie à développement tardif. Les repiquages sur gélose sucrée éliminaient l'hypothèse de l'introduction d’une levure.

b. D'autre part les cultures sont ensemencées en tube Liborius de gélose. Les colonies isolées développées de ce milieu sont vérifiées tant au point de vue de leur aspect extérieur qu'à celui de leur pature (examen au microscope avec ou sans coloration). Pour le bacille du tétanos, une de nos races Tm est née d’une culture en série de 8 tubes de Liborius repiqués de 3 en 3 jours avec une colonie isolée du tube précédent.

c. Enfin le contrôle d'identité était établi en vérifiant la morphologie, les fermentations, et le caractère pathogène tel qu'il est décrit dans les traités classiques.

Tous nos tubes étaient étiquetés de la façon suivante. Ils portaient une lettre, en général la première du nom du microbe, A pour le bacille d'Achalme, V pour le vibrion septique, quelquefois une double lettre pour indiquer la race ou l’origine; ainsi Tm veut dire tétanos dû à l’amabilité du D*' Martin. Après la lettre nous mettons soit un numéro d'ordre, soit plutôt le jour et le mois en chiffre, suivi d’un 3° chiffre indiquant quel rang occupe ce tube dans les cultures faites au jour indiqué. Ainsi Vass47 indique qu’il

s’agit de vibrion septique, que l'ensemencement a été fait le 23 mai, et que le tube est le 17° repiquage de ce germe fait ce jour-là.

Cette notation était reportée sur de grands tableaux synoptiques, qui donnent la filiation de nos cultures; si bien qu'en reprenant un tube de novembre 1906, par exemple, nous pouvons indiquer sa complète généalogie depuis le début de nos recherches.

Sur le tableau synoptique, nous marquons la nature du tube, puis les résultats de son examen, et les caractères relevés sur les lamelles.

Une telle technique est longue et fatigante, mais elle est sûre; elle ne permet pas de substituer à la vérité une conception fantaisiste; c'est pourquoi nous l’avons suivie.

B. — LE BACILLE D’ACHALME OU BACILLUS PERFRINGENS

Nous allons résumer les caractères classiques du bacille d'Achalme ou bacillus perfringens tels qu'ils résultent des travaux de Veillon et de ses élèves d’une part, et des recherches d'Achalme d'autre part. Nous rappelons que ce bacille fut découvert en 1891 par Achalme dans les lésions cardiaques d’un malade mort de rhumatisme articulaire aigu.

I. — Gros bâtonnet de la taille de la bactéridie charbonneuse à extrémités nettement limitées et carrées, s'entourant dans le pus et dans le corps des animaux d’une auréole ou même d’une capsule légèrement colorable. Le plus souvent les éléments sont isolés, parfois bout à bout en chaïnelte de bacilles. La longueur varie, elle est courte dans les milieux riches en hydrates de carbone, longue dans les milieux organiques. Le bacille perd sa capsule dans les cultures, se colore aisément par le Gram et le Claudius; mobile, il se déplace lentement sous le champ du microscope et n’a pas la vivacité du bacille d'Eberth ou du bactérium coli commune.

La culture en est facile, abondante; elle se fait aussi bien à la température du laboratoire qu'à l'étuve à 37°.

En gélose profonde glucosée à 37° la culture peut débuter après quelques heures. Bientôt la fermentation du glucose dégage une

odeur rance; après 24 heures, le tube est retrouvé débouché par l'expansion des gaz dégagés, contenant une colonne de gélose en miettes, d'où la recommandation faite par Achalme de ne pas cultiver son bacille en gélose glucosée mais en gélose mannitée, à cause de la non-fermentation de la mannite par ce microbe.

Un ensemencement pauvre fait développer dans la gélose des colonies qui apparaissent sous la forme de grands disques lenticulaires minces, réguliers, blanchâtres (Guillemot). « Sur la surface de la gélose anaérobie, les colonies forment de petits points blancs humides analogues aux colonies de streptocoques, mais moins opaques, bleutés par transparence. À un faible grossissement, les colonies sont jaunâtres, granuleuses, transparentes, à bords fins, réguliers, ou ondulés très flous. » Achalme, de même, note la production sur gélose inclinée anaérobie d'une couche à peine sensible.

Le bouillon ou la gélatine mis à l’étuve sont troublés abondamment et rapidement. Il se forme au fond du tube un dépôt d'apparition plus ou moins rapide d’après la richesse de la culture; à ce moment le bouillon s’éclaircit, mais incomplètement. La gélatine est liquéfiée tout en conservant sa limpidité et souvent sans donner de dépôt appréciable.

Les milieux organiques sanglants, eau peptonée ou sang hémoplase donnent lieu à des cultures très abondantes. D'après Achalme, le sérum liquide ne serait pas favorable à cause des propriétés antitryptiques du sérum.

En eau blanc d'œuf cacheté, culture abondante et rapide, très belle déjà après 24 heures. Les arêtes du cube de blanc d'œuf s’arrondissent, puis le cube devient transparent et disparait, digéré par la trypsine sécrétée par le germe; en même temps se développe un pigment noir décrit par Achalme. La membrane d’enveloppe de l'œuf n’est pas digérée.

En lait cacheté, milieu de choix (Achalme) on observe un double phénomène. Si le lait cacheté a été additionné de carbonate de chaux, malgré la fermentation de la lactose le milieu reste alcalin ; la trypsine agit et le lait est coagulé avec digestion consécutive de la caséine, d’où exsudation d'une grande quantité de sérum transparent ou légèrement trouble et formation d’un caillot assez peu considérable.

Si le milieu devient acide, la trypsine ne saurait aussi complète-

ment agir; le lait est simplement coagulé, la digestion de la caséine est entravée.

Le lait en 24 heures est donc transformé en un liquide absolument transparent, contenant un caillot blanc aréolaire très rétracté, plus ou moins considérable, qui occupe le fond du tube ou adhère à la paroi.

La sporulation se produit dans les cultures en milieux alcalins, surtout en eau blanc d'œuf. Cette condition sine qua non établie par Achalme explique la prétendue absence de sporulation signalée par Veillon et ses élèves.

Achalme a étudié attentivement la fermentation des hydrates de carbone produite par son bacille. Par un procédé élégant, il a montré que cette fermentation acidifiait le milieu, et entravait la digestion tryptique du blanc d'œuf; par conséquent on peut opposer un tube eau blanc d'œuf simple où l'albumine est dissoute, à un tube où l'albumine reste intacte par fermentation acidifiante d'un hydrate de carbone dissous dans le liquide. En utilisant la méthode de Duclaux, il a montré qu'une production régulière d'acide acétique et d'acide butyrique accompagnait la fermentation des hydrates de carbone suivants (voir Znstitut Pasteur, t. XVI, p. 659) : maltose, glucose, galactose, lactose, saccharose, inosite, glycérine, dextrine, amidon. Au contraire, le bacille d’'Achalme ne fait pas fermenter les produits suivants : mannite, dulcite, inuline, érythrite, amygdaline. Ces fermentations sont spécifiques, c'est-àdire caractéristiques des espèces (Grimbert, Achalme, etc.). Le bacille d'Achalme réduit les nitrates et ne forme pas d’indol.

C'est également à Achalme que l'on doit l'étude du pouvoir tryptique de ce microbe (Annales de l'Institut Pasteur, 97 : La bactériologie du rhumatisme articulaire aigu).

Inoculé au cobaye, sous la peau de laine, ce microbe tryptobutyrique produit soit un œdème infiltré et gélatiniforme riche en bactéries, soit un phlegmon gazeux avec décollement des muscles et du tissu cellulaire sous-cutané, d’autres fois une vaste poche séreuse avec nécrose ou infiltration hémorragique des fibres musculaires voisines. La sérosité elle-même prend souvent la teinte sanglante.

Le cobaye succombe en 48 heures à l’inoculation.

Injecté au lapin, le bacille d'Achalme produit localement un œdème séreux avec pullulation locale du bacille et développement

irrégulier de gaz. L'inoculation intraveineuse de fortes doses de culture donne au lapin une septicémie mortelle en une semaine environ; à l’autopsie on remarque la congestion très marquée des viscères.

Par une technique spéciale, Thiroloix a reproduit avec le bacille d'Achalme, extrait des cultures du sang des rhumatisants pendant la vie, les différentes lésions viscérales du rhumatisme articulaire aigu.

Les divergences de Veillon et d'Achalme sur ce bacille tiennent à la différence des techniques employées; leurs travaux fort beaux se complètent mutuellement.

IT. — Le bacille d’Achalme par sa haute différenciation chimique et biologique, par son rôle considérable dans la pathologie humaine, rhumatisme articulaire aigu [Achalme, Thiroloix, Triboulet, Carrière, etc. !], appendicite, otites graves [Veillon, Zuber, Guillemot, Rist, etc.], méritait d'attirer notre attention. De plus sa pullulation facile, sa vitalité considérable dans nos tubes cachetés, sa sporulation le désignaient comme microbe d’études.

4° Nous avons tout d'abord étudié la mensuration de l’anaérobiose de ce bacille.

… a. MENSURATION DE L'ANAÉROBIOSE PAR ÉCHELLE ASCENDANTE DE PRESSION.

— Si on ensemence à la pipette avec une culture bien développée en bouillon ou en lait cacheté des tubes de lait ou de bouillon contenant une colonne liquide de 5 à 6 centimètres, d’un centimètre et demi de diamètre; si dans un deuxième temps on les transforme en tubes d'Achalme avec les précautions indiquées au chapitre général de technique en ayant soin de les fermer à la lampe avec un vide de 10, 20, 30, etc., et 75 centimètres marqués au manomètre, on obtient les résultats suivants :

Tous les tubes dans lesquels la pression de l’air était au plus de 30 centimètres donnent en 24 heures une culture abondante. Tous les tubes à pression variant entre 30 et 45 centimètres poussent en 72 heures à 86 heures, et leur culture est d'autant

4. Voir Société Médicale des Hôpitaux (16 et 23 juillet 1907), les communications de Thiroloix et Georges Rosenthal.

plus intense que la pression y est plus faible. Tous les tubes où la pression dépassait 45 centimètres restent stériles, le bouillon clair, le lait intact. Il est évident, malgré l'exactitude de ces faits, qu'il faut admettre une certaine élasticité dans les résultats. Tous nos tubes sont ensemencés avec 7 à 10 gouttes de culture, des ensemencements plus abondants risqueraient de fausser les résultats ; des ensemencements pauvres au fil de platine par exemple pourraient ne pas permettre l’accoutumance des bactéries à la vie anaérobie atténuée.

b. MENSURATION DE L’ANAÉROBIOSE PAR CULTURE EN ÉCHELLE DE TUBES PROFONDS. — Si on ensemence à la pipette avec 7 à 40 gouttes de culture bien développée, des tubes profonds de lait très crémeux, tous les tubes, quel que soit leur diamètre, quelle que soit la hauteur de colonne de liquide, donnent en 24 heures une culture abondante avec liquéfaction de lait digéré, ce sont en somme de vraies cultures en tube cacheté.

Les résullats suivants ont été obtenus avec des laits écrémés du commerce. Après 24 heures, tous les tubes de 4 cm. 1/2 de diamètre ayant une colonne de liquide de hauteur supérieure ou égale à 12 centimètres ont abondamment proliféré. Les tubes dont la hauteur de lait varie de 12 à 9 cm. 1/2 se montrent successivement positifs dans un délai de 3 jours. Au-dessous de 9 centimètres, les tubes restent stériles, même avec un ensemencement considérable. Toutefois certains tubes de 9 centimètres et de 8 cm. 1/2 donnent dans un délai variable un développement de germes sans modification chimique du milieu. Ces cultures histologiques si différentes de la culture initiale méritent d'appeler l'attention, elles ont une grosse importance biologique.

Sur lait non crémeux coupé à moitié d'eau peptonée, les résultats presque identiques sont un peu moins favorables.

Sur bouillon et eau peptonée, les tubes profonds ayant une colonne de liquide supérieure à 15 centimètres poussent en 24 heures. De 12 à 15 centimètres, on obtient des cultures abondantes en 2 à 3 jours. Au-dessous de 12 centimètres, aucun développement.

En eau blanc d'œuf, c'est-à-dire dans des tubes contenant des cubes de blanc d'œuf plongés dans de l’eau, la cullure se fait abondamment et la sporulation s’accomplit si la hauteur du liquide

est supérieure à 15 centimètres. De 11 à 15 centimètres les résultats sont positifs, mais il peut se produire quelque échec. Les tubes de 9 centimètres et au-dessous restent stériles.

L'eau additionnée de fibrine en poudre donne des résultats inconstants. Souvent la fibrine forme au fond du tube un magma imperméable. L'ensemencement de ce magma n'est plus ni aérobie, ni anaérobie. Mieux vaut n'en pas tenir compte.

2° La mensuration de l’anaérobiose nous conduisait à l'adaptation progressive à la vie aérobie. Nous y avons été conduit par différentes voies.

&) ADAPTATION A LA VIE AÉROBIE PAR ÉCHELLE ASCENDANTE DE PRESSION. — Si on reprend les tubes de bouillon et de lait ayant servi à la mensuration de l’anaérobiose, on peut après quelques jours mesurer à nouveau l’anaérobiose du tube limite ayant supporté une pression de 45 centimètres. On obtiendra ainsi une culture de bacille d'Achalme supportant une pression de 50 centimètres. De mensuration en mensuration, on arrivera à obtenir une culture en bouillon aérobie de 6 centimètres de hauteur à la pression atmosphérique. Souvent les repiquages sur gélose inclinée resteront négatifs. Au chapitre général de technique, nous avons déjà dit que nous repoussions l'emploi du tube de pression maxima. Avec le bacille d’Achalme, qui supporte d'emblée une pression de 45 centimètres, il est préférable d'utiliser pour continuer la série d’aérobisation un tube fermé à une pression de 20 à 25 centimètres.

b) ADAPTATION A LA VIE AÉROBIE PAR ÉCHELLE DESCENDANTE DE TUBES PROFONDS. — Le lait écrémé donne les meilleurs résultats. En partant d’une culture de 12 centimètres de hauteur, car il est également indiqué de ne pas utiliser le tube de hauteur minima, on obtient facilement par des repiquages faits de 5 en 5 jours des cultures abondantes sur lait de 10,9, 8, 7, etc., 2 centimètres de hauteur.

Sur eau peptonée, la culture en échelle descendante est difficultueuse; elle échoue souvent si la culture initiale sur eau peptonée a été obtenue par repiquage d’une culture anaérobie; elle est possible si la culture sur eau peptonée glucose de 14 centimètres a été le repiquage d'une culture aérobisée sur lait de 2 centimètres. On peut alors, par des réensemencements assez larges, faits de préférence de 5 en 5 jours avec les parties superficielles de la culture

mère dans la partie profonde du nouveau tube, arriver au tube de culture ordinaire, tube d’eau peptonée de 4 cm. 1/2 de diamètre et de 3 à 4 centimètres de hauteur.

La culture en gélose inclinée s'obtient toujours difficultueusement. Sur gélose sérum, ou sur gélose hémoplase par notre procédé !, les résultats sont un peu plus favorables; on obtient ainsi des cultures étalées, blanchâtres, opalines ou opaques, peu saillantes, à bords irréguliers se fondant progressivement avec le milieu de culture, ayant de 1 à 3 millimètres environ de diamètre. Lorsque la gélose se dessèche, la colonie prend un aspect légèrement rugueux.

La vitalité de ces cultures sur gélose inclinée est des plus précaires. Souvent tous les repiquages échouent; en général, il est difficile d'obtenir en série des cultures sur gélose inclinée ; une nouvelle culture sur gélose ne s'obtient qu'après avoir rendu au bacille un peu de vitalité par un passage en lait écrémé de 6 à 10 centimètres de hauteur {voir fig. 6).

Dans celte série de passages où s’est effectuée l’aérobisation du bacille d’Achalme, ce germe n'a rien perdu de ses propriétés.

Morphologiquement, il est resté ce gros bâtonnet trapu ayant presque les dimensions de la bactéridie charbonneuse, à extrémités carrées. Quelquefois, lorsque le repiquage est hâtif, on trouve dans la nouvelle culture, mêlées aux formes habituelles, des formes courtes, des bacilles moniliformes, ou des bacilles allongés et fins, qui disparaissent après quelques jours. Ce sont probablement des formes d’involution, des éléments qui ont été incapables de s'adapter aux nouvelles conditions d'existence. Quelquefois les lamelles faites avec les parties superficielles de la culture sont pauvres en bactéries; elles forment alors un dépôt abondant au fond du tube. Sur gélose inclinée, les colonies comprennent une majorité de formes normales trapues, saines, prenant le Gram et le Claudius, mêlées à un nombre assez considérable de formes irrégulières, massuées, moniliformes, à des bacilles minces et ténus, des filaments allongés, à des éléments se colorant mal ou incapables

1. L’hémoplase, milieu sanglant en bactériologie. Soc. Biologie, 23 juin 1906.

de résister à la décoloration par l'alcool après mordançage à l'eau iodo-iodurée : toutes variations de formes que l’on retrouve dans les vieilles cultures anaérobies.

Mais le fait important et capital de l’aérobisation est la conservaton absolue de toutes les fonctions fermentatives, pathogènes, biologiques du germe.

Conservation absolue des propriétés fermentatives, car le cube de blanc d'œuf est digéré par la trypsine du germe aérobisé, la gélatine est liquéfiée, car l’amidon est saccharifié, la lactose est digérée avec un dégagement d'acide acétique et butyrique dont l'odeur n’est que trop facile à reconnaître. Conservation des fonctions pathogènes, car la culture jeune sur gélose émulsionnée dans du bouillon et inoculée au pli de l’aine du cobaye le tuera de toxhémie avec phlegmon gazeux et infiltration hémorragique au point inoculé {toutefois il y a rapidement une légère atténuation); les modifications morphologiques sont transitoires et légères; la culture en eau blanc d'œuf aérobie nous donnera une sporulation aérobie, comme la culture en eau blanc d’œuf cacheté nous donnait une sporulation anaérobie. Nous précisons plus loin les conséquences de cette sporulation aérobie.

Achalme, comme nous l'avons dit, a signalé dans ces cultures en eau blanc d'œuf anaérobie la formation en quantité variable et jamais très abondante d’un pigment noir, insoluble dans l’eau, l'alcool et les alcalis concentrés, soluble dans l’acide sulfurique, qui présente de grandes analogies avec la mélanine. Ce pigment se retrouve dans les cultures sur fibrine et en solution concentrée de peptone. Sa formation est commune aux microbes du groupe trypto-butyrique. Les cultures aérobisées du bacille d’Achalme fabriquent ce pigment qui est identique en quantité, propriétés physiques et chimiques au pigment original.

Mais cette conservation des fonctions fermentatives et pathogènes n’est que provisoire. Elle présente un intérêt biologique général; nous aurons dans la troisième partie de ce travail à y revenir. Si on continue à cultiver le bacille d’Achalme soit en série de gélose inclinée (en alternant, ce qui nous a paru indis-

pensable, la culture en gélose inclinée et la culture sur lait de 4 cm. 1/2 diam. et de 5 cm. haut), soit même en tubes bas de lait ou bouillon, la biologie du germe se modifie rapidement; c'est la deuxième étape de l’aérobisation, étape dela discordance aéro-anaérobie. En culture aérobie le blanc d'œuf résiste aux sécrétions microbiennes; d'abord la digestion malgré la pullulation du germe en est tardive, plus tard elle reste incomplète, puis le cube de blanc d'œuf a simplement ses arêtes vives arrondies; enfin il reste intact. De même pour le lait, on voit de repiquage en repiquage succéder à la digestion rapide une digestion retardée, une coagulation et digestion incomplète, puis à peine ébauchée, une coagulation sans digeslion, ou une liquéfaction tardive sans coagulation. La gélatine (nous y reviendrons plus loin) au lieu d'être liquéfiée est transformée en une gelée visqueuse par un début de digestion. Le pouvoir pathogène s'atténue également. Au début le cobaye inoculé mourra de cachexie toxique avec un phlegmon gazeux à peine marqué; puis il résistera à l'infection, fera au point inoculé un simple abcès avec pus louable, épais et concret, riche en polynucléaires, indiquant la réaction favorable de l'organisme et la variation de la chimiotaxie devenue positive: enfin un simple amaigrissement consécutif à l'inoculation disparaîtra spontanément en quelques jours. Cependant ce bacille qui paraît si différent de son origine revient rapidement à son type primitif si on le cultive à nouveau en anaérobiose. Dès la première culture cachetée, plus tard à la seconde ou à la troisième faite en série le bacille d'Achalme redevient trypto-butyrique et gangrénigène, il a récupéré ses propriétés initiales sans exception. Nous appelons anaérobie de reconstitution les cultures anaérobies obtenues à ce moment précis par repiquage de cultures aérobies ayant perdu leur différenciation. Cette double orientation des repiquages aérobie et anaérobie d’une même culture montre assez quelle est la puissance considérable de l'adaptation au milieu. Elle n'est d’ailleurs possible que pendant cette période, pendant cette deuxième étape de l’aérobisation.

Si avec beaucoup de précautions, la culture en série du germe se prolonge, elle atteindra le 3° stade, caractérisé par la perte absolue des fonctions fermentatives et pathogènes. Même en culture anaérobie la culture sur lait donne un pullulement considérable, sans qu'il s'y produise ni coagulation, ni liquéfaction. Le blanc

d'œuf est intact, la gélatine sous les réserves faites plus loin n’est pas liquéfiée, le cobaye inoculé maigrit à peine, etsupporte des doses de 3 à 4 centimètres de culture. C'est à peine si par exception une inoculation massive peut le tuer avec un phlegmon gazeux, plus souvent avec un abcès local où se régénérera le bacille.

Le bacille perfringens privé de toutes fonctions est devenu le bacillogène perfringens, bactérie légèrement mobile, sans fonction. Nous aurons à discuter plus tard les rapports du bacille et de son bacillogène.

Il nous reste à indiquer la valeur de la sporulation aérobie et celle de l’anaérobie de reconstitution.

L'anaérobie de reconstitution fait retour au type anaérobie. En se régénérant, en reprenant sa force pathogène, son chimisme, il perd d’une façon complète son adaptation à la vie aérienne. Quelques précautions sont nécessaires dans la conduite des expériences; leur méconnaissance amènerait à des erreurs évitables ceux qui voudraient répéter nos recherches sur ce point : il faut éviter de repiquer dans un délai de temps trop court la culture anaérobie de reconstitution; car dans les premiers jours, la culture peut avoir conservé des éléments de la culture aérobisée mère; un repiquage positif n'aurait donc aucune valeur. De même, il faut autant que possible éviter de partir d'une culture aérobisée sporulant, de peur que ces spores ne deviennent une cause d'erreur, comme nous le verrons plus loin en indiquant la valeur de la sporulation aérobie. Nous avons pris soin d'utiliser une culture anaérobie de reconstitution en eau blanc d'œuf cacheté, donc sporulante, née du repiquage d’une culture asporogène sur gélose inclinée. Nous avons fait des expériences à longue échéance, 3 mois, 6 mois et À an.

Voici maintenant un exemple type :

Le tube A,..., est un tube eau œuf anaérobie de reconstitution né le 13 mai 1906 du repiquage anaérobie d’un tube de gélose inclinée A,,, du 11 mai 1906. Les repiquages aérobies de ce dernier tube ont donné des cultures maigres peu vivaces, sans action chimique. En 3 jours, au contraire, la culture de À,,;., était superbe et bientôt les cubes de blanc d'œuf étaient digérés.

Le 30 avril 1907, cette culture est repiquéesur les tubes A, gélose inclinée, A,, lait aérobie de 1 1/2 diamètre 8 hauteur; À,, eau œuf

aérobie de 4 1/2 diamètre et 5 1/2 hauteur. Tous ces tubes restent stériles. Par contre les tubes cachetés de repiquage donnent d'abondantes cultures. Le 5 mai, un tube cacheté en plein développement est repiqué sur laits aérobies en gamme de hauteur; seuls les laits de 1 c. 4/2 diamètre 9 c. hauteur ont permis la pullulation du germe. L'anaérobie de reconstitution a donc la même mensuration que l’anaérobie initiale. La sporulation aérobie, par contre, peut donner naissance à des races nouvelles : mais les résultats ne sont pas constants; parfois ils sont négatifs, parfois même les cultures nouvelles ne donnent pas de repiquage de deuxième génération; le plus souvent est créée une race nouvelle, ayant les propriétés du bacille anaérobie, mais supportant le contact de l’air; nous disons alors que le bacille d'Achalme est devenu l'aérobacille d'Achalme. Nous allons donner trois exemples d’études de sporulation aérobie ; l'un d'échec complet, l’autre d'obtention de culture de faible vitalité à repiquages négatifs, le troisième de création de race incomplètement aérobisée puisque les cultures sur gélose inclinée ont échoué.

Le tube AÀ,,, du 12 mai 1906 est un tube eau œuf 1 c. 1/2 diamètre 9 c. hauteur bien digéré. Le 25 mai 1906, un ensemencement sur gélose inclinée est négatif. Le 26 avril 1907, ce tube est repiqué avec succès sur lait cacheté et sur laits profonds 1 1/2-18 et à 1/2-12. Un tube de lait A, de 41/2 8 1/2 donnelieu à un développement tardif, Tous les repiquages en lait bas, bouillon gélatine bas échouent. De plus, le lait cacheté est repiqué sans succès le 5 mai 1907 sur des laits de 1 cm. 1/2 de diamètre ayant 3,6 et 8 centimètres de hauteur de colonne. De même le tube profond de lait 4 1/2-12 est repiqué sans succès le 30 avril sur gélose inclinée, eau œuf aérobie 1 1/2 diamètre 4 hauteur, laits aérobies 4 1/2-5 et 6 4/2.

C'est un cas d'échec. Voici un cas de transition :

Le tube A;, du 26 avril 1906 est un tube eau blanc d'œuf de sporulation aérobie par repiquage d’une culture du premier stade. I est repiqué avec succès le 26 avril 1907 sur lait profond 1 1/2-46, lait cacheté et sans succès sur des tubes de lait 1 1/2-8, 1 1/2-6, et sur gélose inclinée. Toutefois un tube eau blanc d'œuf 1 1/2-5 cultive abondamment, mais tous les repiquages en tubes bas resteront négatifs. Le lait cacheté est repiqué le 5 mai 1907 sur laits bas de L em.1/2avec des hauteurs de 3, 5 et 8 centimètres. Tous ces tubes

donnent tardivement une culture faible avec digestion du lait. Les repiquages ont une vitalité médiocre.

Enfin voici deux exemples d'obtention de l'aérobacille d'Achalme.

Le tube À,,; de sporulation aérobie est repiqué sur lait cacheté le 9 mai 1907. Le 17 mai, sont repiqués avec succès par ce tube cacheté des tubes de lait, bouillon, et eau œuf aérobie 1 1/2-7. Les ensemencements directs des spores aérobies étaient restés négatifs en tubes bas.

Le tube À,, du 14 avril 1906, tube de sporulation aérobie sur eau blanc d'œuf est repiqué directement avec succès le 9 mai 1907 sur lait cacheté, eau œuf aérobie 1 1/2-6 1/2, bouillon gélatiné 4 1/2-61/2, lait 1 1/2-4, et lait 1-5. Toutefois la gélose inclinée reste négative. Mais nous nous souvenons combien il est difficile d'obtenir des cultures sur gélose inclinée du bacillus perfringens (bacille d'Achalme).

3° A la fin de cette étude de l’aérobisation du bacille d'Achalme, nous voulons revenir sur quelques points dignes de retenir l’attention, ce sont les résultats obtenus en tube étroit, l'évolution des cultures de gélatine, l'étude de l’expérimentation sur les animaux, qui nous mènera à l’immunisation et peut-être à la sérothérapie.

Enfin nous nous demanderons s’il existe un quatrième stade de l’aérobisation.

Tout d'abord donnons quelques expériences concernant le tube étroit. Elles confirment la loi générale du rapport inverse du diamètre et de la hauteur de colonne dans l'obtention des cultures en tube profond.

Le 13 septembre nous repiquons une culture en laitcacheté de bacille d'Achalme sur des tubes de diamètre différent contenant des hauteurs de liquide variables et nous notons les résultats suivants :

Nos tubes de contrôle reproduisent les aspects caractéristiques, éclatement de la gélose profonde, liquéfaction du blanc d'œuf, absence de culture en gélose inclinée.

Tubes de lait de 4 centimètres de diamètre contenant une colonne de liquide de 12, 10, 9 et 8 centimètres. Pas de culture.

Tubes de lait de 2 cm. 1/2 de diamètre. — Culture positive dans le

tube ayant une colonne de lait de 8 centimètres et au-dessus.

Tubes de lait de 2 centimètres de diamètre. — Hauteur nécessaire : 7 centimètres.

Tubes de lait de À cm. 1/2 de diamètre. — Hauteur exigée : 6 centimètres.

Tubes de lait de 1 centimètre. — Hauteur nécessaire : 4 centimètres.

Tubes de lait de 1/2 centimètre. — Hauteur indispensable : 3 centimètres.

Pipette. — Toutes cultures positives.

La comparaison de ces chiffres avec ceux donnés plus haut surprend par une notable différence. La plus grande facilité de culture dans l'expérience ci-dessus citée provient de l'emploi d'un lait autoclavé deux jours seulement avant l'expérience.

Voici les résultats obtenus le 18 septembre, sur lait.

Pour le diamètre 2 cm. 1/2, hauteur minima : 12 centimètres.

= 4 em. 1/2. — 9 — — 1 cm. — 6 et 5 1/2 — 1/2 cm. — 4 cm.

Quant au bouillon, voici les chiffres. Pour un diamètre de 4 cm. 1/2, il faut une colonne de 12 centimètres; le diamètre de 1 centimètre se contente d’une colonne de 8 centimètres, le diamètre de 1/2 centimètre n’exige plus qu'une colonne de 6 et même 5 centimètres.

D'ailleurs le degré de l’aérobisation est fonction à la fois du diamètre et de la hauteur. Un tube de 1 centimètre de diamètre et de 6 centimètres de hauteur ne correspond point à un tube de même hauteur de colonne, mais à plus grand diamètre. L'expérience suivante le démontre :

Le 26 septembre 1906 nous repiquons sur différents milieux un tube de bacille d'Achalme en lait aérobie de 1 centimètre de diamètre et 6 centimètres de hauteur. Sont positifs les repiquages sur lait aérobie de 1 centimètre de diamètre avec hauteur de 6, 5 et 4 cm. 1/2. — Au contraire avec un diamètre de 1 em. 1/2 il fallut une colonne de 8 centimètres pour avoir une culture positive. Le réensemencement était fait comme d'ordinaire à la pipette avec 7 à 10 gouttes de culture bien développée. La culture est d'autant plus abondante que le milieu est plus abondant — tant il est vrai

que la richesse du réensemencement, si elle est utile, n’est qu'une condition adjuvante de nos expériences.

4° La culture sur gélatine nous présente à étudier deux phénomènes spéciaux, qui sont l’aérobisation spontanée par vieillissement ou culture en série et d'autre part la dissociation de la perte du chimisme. Voici les exemples démonstratifs :

Un tube de gélatine Liborius (1 cm. 1/2 de diamètre et 7 centimètres de hauteur) est ensemencé le 12 septembre 1906 avec une culture cachetée de bacille d'Achalme. Le 18 septembre, toute la gélatine est liquéfiée et le tube forme une culture pseudo-aérobie; à ce moment les repiquages sur lait ne sont positifs qu’en tubes de 4 cm. 1/2 de diamètre et9 centimètres de hauteur, conformément à la règle antérieurement établie. Le 8 octobreles repiquages sont positifs sur lait en tubes (1 1/2 diamètre, 3 hauteur), mais les essais sur gélose inclinée restent sans résultat. Le 22 octobre, nous avons obtenu sur gélose inclinée deux colonies blanchâtres aplaties, peu saillantes, dont les repiquages ont été négatifs; le bacille avait perdu sa vitalité dans son effort d'adaptation au milieu; tous les repiquages de la gélatine en lait et bouillon étaient à ce moment positifs.

Si le simple vieillissement suffit, à plus forte raison la culture en série de tubes Liborius de gélatine. Ainsi un tube de Liborius de gélatine du 12 septembre 1906 a uneanaérobiose normale, c’est-à-dire que les tubes de lait (4 1/2-9) donnent des repiquages positifs. Le 2 octobre, ce tube est repiqué sur un tube Liborius de gélatine contenant une colonne de 3 cm. 1/2 de ce milieu, et le 5 octobre ce nouveau tube peut être repiqué avec succès en lait de 1 1/2 diamètre, 3 hauteur.

Le phénomène de la dissociation de la perte du chimisme consiste essentiellement dans ce fait que le bacille d’Achalme, au cours de son aérobisation, peut encore digérer la gélatine, après avoir perdu le pouvoir de digérer le blanc d'œuf et la caséine du lait. Ce fait mérite quelques commentaires.

Les cultures sur gélatine de bacilles d'Achalme obéissent à la loi de l’évolution en trois slades que nous avons établie. Au début, dans la première phase d'aérobisation, les réensemencements en tubes Liborius liquéfient la gélatine, et à la fin de cette phase, des cultures liquéfiantes s’obtiennent en gélatine inclinée à la tempéra-

ture de la chambre. La strie d'ensemencement creuse un sillon comparable au sillon du staphylocoque doré; au sein de la gélatine liquéfiée, l'examen sur lamelles montre le bacille avec ses propriétés morphologiques et sa mobilité ordinaire. Souvent on ne voit pas à l'œil nu de culture apparente, et la culture est identique à la culture anaérobie sur gélatine inclinée; quelquefois la culture se développe sous l'aspect d’une bande blanchätre légère à limites indécises, La culture en série fait passer au deuxième stade, stade où la gélatine n'est plus liquéfiée en culture aérobie, mais peut encore être digérée dans les tubes anaérobies. Enfin arrive le troisième stade où le germe a acquis sa neutralité chimique sur tous milieux et toute culture. Ici, comme dans la série d’aérobi

sation sur gélose, il sera souvent utile pour éviter l'arrêt de la culture en série de redonner de temps en temps une certaine vitalité au germe, en intercalant entre les séries de tube de gélatine inclinée quelques cultures en lait de 1 1/2 diamètre, 5 hauteur, par exemple.

Le fait important est l’absence de concordance entre le deuxième stade étudié sur gélatine et le deuxième stade étudié sur eau blanc d'œuf ou lait. Comme nous le disions plus haut, le pouvoir de digérer la gélatine se garde plus longtemps quele pouvoir tryptique de digestion du blanc d'œuf et de la caséine. En voici un exemple. Un tube de gélose inclinée contenant une culture de bacille d'Achalme obtenue le 9 juin 1906 est repiqué sur gélatine inclinée. En 48 heures, liquéfaction totale de la gélatine. Après régénération en lait bas, un deuxième tube de culture en gélose inclinée donne des cultures filles aérobies qui liquéfient la gélatine, mais laissent intacts le lait ou le blanc d'œuf malgré leur pullulation. Le 2 septembre 1906 nous repiquons sur gélatine inclinée en tube eau blanc d'œuf aérobie (1 1/2 diam., 7 haut.) non digéré. La gélatine est liquéfiée en 48 heures. Mais ce tube eau blane d'œuf aérobie est repiqué sur des laits aérobies de 4 1/2 diamètre 5 à T hauteur, où le bacille pullule sans modification apparente du milieu. Les repiquages de ces nouveaux tubes sur gélatine inclinée n ont pas liquéfié.

D'ailleurs si curieux que soit ce phénomène, il ne faudrait pas croire qu'il se produise toujours dans le même sens. Il peut arriver que le pouvoir de digestion de la gélatine disparaisse en premier.

Aïnsi le 13 juin 1906 nous repiquons un tube de lait aérobie de 1 centimètres hauteur à digestion tardive sur gélatine inclinée. La gélatine n’est pas liquéfiée, Le 15 juin, nous repiquons sur gélatine inclinée un tube de lait cacheté anaérobie de reconstitution complètement digéré; la gélatine n'est pas liquéfiée; la culture est d’ailleurs misérable (voir plus haut l'étude de l’anaérobie de reconstitution).

En somme, qu'il y ait perte précoce, fait rare, ou perte tardive de la digestibilité de la gélatine, il semble en tout cas, qu’il y ait dissociauon entre la perte de cette fonction et la disparition du pouvoir tryptique vis-à-vis le blanc d'œufou Ja caséine. Au contraire, il nous a semblé toujours y avoir concordance pour la liquéfaction de ces deux substances.

Il est donc probable que la gélatine n’est pas liquéfiée par la diastase qui digère la caséine, la fibrine, et l’albumine de l’œuf. Le bacille sécréterait un double ferment. Ce point appellerait peut-être de nouvelles recherches, car Achalme dans l'étude très attentive qu'il a faite de la sécrétion de trypsine par son bacille conclut à l'unité du ferment, qui est identique à la trypsine du pancréas. « Cette diastase (Annales de l’Institut Pasteur, 1892, p. 650, 2° al.) agit puissamment sur la gélatine qu'elle liquéfie, la caséine, la fibrine, la syntonine, l’albumine de l’œuf qu’elle peptonise. Elle se rapproche de la trypsine du pancréas par l'influence qu’exerce sur elle la réaction du milieu : elle a son maximum d'activité en présence de l’alcalinité au tournesol, bien avant l’alcalinité à la phtaléine du phénol. »

5° L'évolution du pouvoir pathogène appelle des considérations analogues.

Sa conservation intégrale pendant le premier stade n'est pas . absolue. A la vérité, la variation du pouvoir pathogène, sa diminution et sa modification débutent bien avant la perte du chimisme. Après 4 ou 5 générations de culture en lait profond, le cobaye si sensible au germe anaérobie, dont il est pourrait-on dire le réactif, ne réagit plus à l'inoculation que par une cachexie avec escarre nécrotique sans fermentation gangréneuse; le lapin fait un abcès à pus louable et maigrit progressivement. A la fin du premier slade, les animaux inoculés meurent simplement de cachexie

ou même se cachectisent et guérissent s'ils ne sont pas rémoculés et vivent dans de bonnes conditions. La dose inoculée joue également un rôle des plus importants. Au troisième stade de l’aérobisation, une inoculation massive peut parfois régénérer le microbe et lui rendre sa valeur initiale. Par contre une inoculation d'une culture en lait profond digéré (1°* stade) de troisième génération pourra à la dose d’une goutte cachectiser le cobaye, de 7 à 10 gouttes donner un abcès à pus louable, à 2 centimètres cubes tuer de phlegmon gazeux; fidèle image sur l'animal des variations innombrables des maladies humaines.

Voici quelques exemples de ces variations d'action; ils sont emyruntés à nos expériences d'inoculation de cobayes : Le cobaye 69 est inoculé le 11 juin 1906 avec 5 centimètres cubes du tube À 22 mai n° 1, lait profond digéré du stade 1; il meurt 48 heures après, mais au lieu d'un phlegmon gazeux, ne présente qu’une nécrose sèche et non putride de la paroi abdominale.

Le bouillon profond est peu pathogène. Le cobaye 53 reçoit les injections suivantes d’un bouillon profond de 24 heures du stade premier : le 23 juin-4 cc.; le 27, 4; le 30, 5 cc:; le 4 juillet 8; le 9 juillet 8; ce n’est qu'après cette dernière dose qu'il se cachectise rapidement et meurt le 13 juillet.

Le cobaye 60 reçoit le 12 juillet un 1/2 ce. d’une culture en gélatine liquéfiée basse du 9 juin. Le 16 juillet nouvelle inoculation de 1 ce.; mort le 21 juillet avec un abcès au point d'inoculation à pus louable contenant le bacille d'Achalme.

Le cobaye 33 reçoit le 16 juillet 1 ce. d'un tube de lait profond digéré du 23 juin; le 21 juillet 2 cc. d'un tube du 27 juin, le 98 juillet 3 ce. d'un tube de bouillon profond du 8 juillet. Il meurt au milieu d'août de cachexie progressive sans abcès.

Le cobaye 62 reçoit les inoculations suivantes : Bouillon profond bouilli, le 1* juin 1906, 1 centimètre; le 4, 5 ce.; le 7, 10; le 11, 10; le 23, 8; le 27, 8. Bouillon profond vivant, le 4 juillet, 2 cc.; le 9 juillet, 5 cc. Le 16 juillet, il reçoit 2 cc. de bouillon profond et 1 cc. de lait aérobie digéré bouilli. De même le 21 et le 28 juillet. En septembre il reçoit des inoculations de lait aérobie digéré bouilli, le 45, 2 cc. ; le 26, 3; puis le 2 octobre, 4; le 6, 5; le 13, 1 cc. de lait anaérobie bouilli; le 20, 2 cc. du même tube;

le 26 octobre 1 ce. de bouillon gélatiné profond. Le 3 novembre 2 ce. de ce bouillon.

Le 13 novembre, 1 cc. de lait profond digéré. Le 23 novembre, léger abcès abdominal à pus louable. Le 30 novembre, 2 ce. de lait profond digéré. Le 7 décembre 1/2 cc. de bouillon cacheté. Mort par cachexie rapide le 12 décembre.

6° Existe-t-il une quatrième étape dans l’aérobisation du bacille d'Achalme? — Le bacille ayant tout perdu de ses propriétés primitives, sauf la morphologie, va-t-il perdre cette morphologie et prendre l'aspect et les caractères d’un autre germe? Voilà une question passionnante que nos expériences n'ont pu encore élucider. Toutefois dans une culture sur bouillon gélatiné du 3° stade en tube 1 1/2-4, nous avons observé une fois sur lamelles le fait suivant. Les bacilles s'étranglaient en leur milieu, et prenaient une forme de sablier, de plus en plus accentuée, jusqu'à produire la transformation du bacille en un diplocoque. Les repiquages devinrent en culture pure de l’entérocoque de Thiercelin. Il nous sembla alors que le bacillogène d'Achalme était devenu l’entérobacille de Thiercelin, puis l’entérocoque. C'était la démonstration du transformisme microbien. Mais le fait est resté unique; la seule conclusion à en tirer est la nécessité de faire sur ce point de nouvelles recherches. Nous ne voulons pas tirer parti d’une expérience que nous n’avons pu jusqu'à présent reproduire à volonté.

III. — Identité du bacille d'Achalme et du bacille de Thiroloix. — L'aérobisation du bacille d'Achalme nous conduit à étudier à la fin de ce chapitre une question intéressante de Bactériologie médicale, celle de l'identité du bacille d’Achalme et du bacille trouvé par Thiroloix, pendant la vie, dans le sang de 5 rhumatisants. Achalme avait trouvé son bacille à l’autopsie dans le myocarde et les valvules de rhumatisants.

Or en reprenant les 3 notes de Thiroloiïx à la Société de Biologie (1897, 43 mai, 9 octobre, 6 nov.) on relève les points suivants sur lesquels va porter la discussion. Dans la première note Thiroloix conclut à l'identité des deux germes et propose, à juste titre, de donner le nom de bacille d’Achalme à ce germe. Dans

la deuxième note, l'étude plus approfondie qu'il en fait établit certaines différences. Nous ne parlons point des résultats expérimentaux, Un microbe au sortir de l'organisme peut avoir conservé certaines propriétés d'adaptation; d’ailleurs, l’auteur emploie une technique spéciale (inoculation hypodermique au lapin de 1 à 2 cc. de la sérosité du phlegmon gazeux du cobaye). Laissons de côté également, pour la même raison, le développement formidable de gaz qui fait éclater le tube d’'Achalme dans l’étuve.

L'absence de culture sur gélatine de 18-20° nous étonne davantage, ainsi que la conclusion de Thiroloix : « Il ne cultive pas à la température ordinaire ».

Ici encore on peut invoquer l'adaptation considérable à la vie parasitaire de ce germe, et supposer que des tentatives tardives de culture sur gélatine auraient réussi.

L'absence de fétidité des cultures, qui dégagent une odeur butyrique franche, peut s'expliquer par l'intensité du pouvoir fermentatif des hydrates de carbone avec production rapide d’acidité entravant l’action et la sécrétion de la trypsine. D'ailleurs Thiroloix note lui-même l'hyperacidité des cultures.

Enfin Thiroloix écrit : « Après 3 ou 4 passages sur lait ou bouillon, ce bacille qui végète si difficilement alors qu'il provient de l’homme ou du lapin, cultive aérobie sur lait, bouillon ou sérum humain liquide, conservant sa puissance pathogène. » Ce fait restait inexplicable avant nos recherches.

N'est-ce pas là un simple fait d’aérobisation spontanée de cet échantillon si spécial? Nos recherches en permettant de comprendre ce fait bien particulier observé par Thiroloix nous amèneront donc à conclure à l'identité probable du bacille d'Achalme et du bacille trouvé par Thiroloix. D'ailleurs, un certain nombre d'auteurs, ont retrouvé dans les cas compliqués de rhumatisme articulaire aigu (Carrière, Triboulet, Zadok et Coyon en France, etc.) un bacille anaérobie rigoureusement identique au bacille d'Achalme. Ce fait vient à l'appui de l'interprétation d'identité.

1. Au cours de recherches récentes (Soc. médicale des Hôpitaux, juillet 1907) sur le rhumatisme articulaire aigu nous avons pu démontrer, avec la collaboration

de Thiroloix, l’identité des deux germes. Les variations des deux races tiennent à l’adaptation de la vie parasitaire,