CHAPITRE IT
TOXICITÉ DES CORPS MICROBIENS
Pour toutes les expériences qui vont suivre j'ai utilisé des corps microbiens obtenus par la méthode de M. Maurice Nicolle (1), qui permet d'obtenir « rapidement des récoltes abondantes de corps bacillaires ne contenant que leur humidité normale et faciles à prélever sans entamer le support nutritif ». Toutefois je ne me suis pas servi des grandes boîtes de Pétri employées par cet auteur au cours de ses recherches sur la morve et j'ai donné la préférence aux grandes cuvettes métalliques dont il a établi le modèle avec la collaboration d’Alilaire ; elles m'ont donné toute satisfaction et ne mont jamais causé d'ennui au point de vue de la pureté des cultures.
Lors de mes premiers essais J'ai également employé la gélose à la viande et à la pomme de terre préconisée par M. Nicolle, mais dans la suite je me suis servi exclusivement d'un milieu qui m'a donné de bons résultats, tout en étant plus économique, car il ne nécessite pas de peptone et n'exige que 200 grammes de viande par litre. Pour le préparer j'ai appliqué la méthode générale que j'ai publiée il y a trois ans et qui est basée sur l'hydrolyse alcaline ménagée des substances albuminoïdes naturelles (2). Voici la technique que je suivais :
1. M. Nicozze, « Etudes sur la morve expérimentale du cobaye », Ann. de l'Institut Pasteur, août 1906, p. 626.
M Nicoure et AuLaire, «Note sur la production en grand des corps bactériens et sur leur composition chimique », Ann. de l'Inst. Pasteur, juillet 1909, p. 947.
2. Azgerr BerrneLor, € Préparations des milieux de-culture par l'hydrolyse alcaline ménagée des substances albuminoïdes naturelles », C. À. de la Soc. de Biologie, t. LAVE, 30 avril 1910, p. 757.
Deux kilogrammes de viande de cheval hachée, bien maigre, étaient p'acés dans une marmite émaillée et mis en suspension dans la solution suivante :
PAU DONNE SO UN, » litres
Lessive de soude chimiquement pure à 36 Baumé... 135 ce.
Le tout était porté à l’autoclave et maintenu à 134 degrés pendant une heure et demie. Aussitôt le mélange sorti de l’autoclave je l’acidifiais très légèrement avec de l'acide chlorhydrique chimiquement pur, puis je l'abandonnais jusqu'au lendemain. Je le passais alors sur un tamis de crin de façon à séparer les débris de tendons et d’aponévroses ainsi que de petites masses d'acides gras ; j'avais ainsi une solution renfermant tous les proétiques de la viande à l’état de deutéroprotéoses, c’est-à-dire au stade de désintégration de la molécule albuminoïde le plus rapproché des peptones de Kühne.
J'ajoutais à ces cinq litres de solution le même volume d'une bouillietrès fluide, passée au tamis, obtenue en délayant dans cinq litres d’eau, deux kilogrammes de pommes de terre pelées, découpées en petits fragments et cuites 30° à l’autoclave à 120°.
Je neutralisais ce mélange, qui contenait alors une proportion de chlorure de sodium voisine de la teneur habituelle des milieux deculture, puis jy introduisais 300 grammes de gélose. Je portais le tout à 1200 pendant une heure et enfin je répartissais le milieu dans des fioles à fond plat d'un litre que je stérilisais à 1200. Dans chaque fiole je mettais environ 650 cc., c’est-à-dire le volume convenable pour une cuvette.
Le dépôt abondant que contenait ce milieu imposait naturellement la précaution de le couler très chaud dans les boîtes, en agitant le mieux possible les fioles qui le renfermaient ; mais après refroidissement sa surface était aussi solide et aussi unie que celle du milieu de M. Nicolle. De même que cette gélose il m'a constamment donné, par cuvette, un rendement moyen de 5 grammes de corps microbiens humides ; la toxicité de ceux-ci était la même avec les deux milieux.
Ces résultats concernant le Proteus, c'est-à-dire un microbe très facile à cultiver et possédant même d’après les travaux de certains auteurs une affinité marquée pour les protéoses, il serait prudent de faire un essai en petit avant d'utiliser ce milieu pour la culture en grand d’une autre bactérie.
Quoi qu'il en soit, on ne saurait trop insister sur les avantages de la méthode de Nicolle-Alilaire ; 1l n’en est pas d'autre, en effet, qui m'aurait permis de récolter en moins de 24 heures /rente-trois grammes de corps microbiens n'ayant pour toute humidité que leur eau de constitution. [1 va sans dire, d’ailleurs, que j'aurais pu recueillir, dans le même temps, une quantité de microbes beaucoup plus considérable si j'avais possédé un plus grand nombre de boites.
Dans toutes mes expériences j'ai récolté les corps microbiens après 18 à 20 heures de culture à 37°; j'y ai plusieurs fois dosé l'humidité et j'ai toujours trouvé, à quelques décigrammes près, une teneur en eau de 80 0/0, très voisine par conséquent du chiffre donné par MM. Nicolle et Alilaire pour le Proteus vulgaris.
Les essais suivants ont tous été exécutés avec des corps microbiens desséchés représentant par conséquent cinq fois leur poids de bacilles frais, mais j'exprimerai tous les résultats en milligrammes de microbes humides, J'ai toujours injecté ceux-ci à l’état de suspension dans l’eau physiologique, à une dilution telle que 1 ce. correspondait à 20 milligrammes de microbes secs, c'est-à-dire à 100 milligrammes de microbes frais. Je préparais cette émulsion 48 heures à l'avance et je la traitais par l’éther de la mème façon que les cultures totales, afin de me trouver dans des conditions analogues à celles de mes premières expériences et d'assurer pratiquement la stérilité de la dilution microbienne (1).
1° Toxicité des corps microbiens desséchés à 3T° (Proteus Tr).
Les bacilles utilisés pour cette détermination avaient été obtenus en étendant en couche mince sur des plaques de verre stériles Les corps microbiens d'une culture de 20 heures et en les abandonnant à eux-mêmes à 37° jusqu'à dessication. Bien entendu, cette opération avait été conduite de manière à éviter autant que possible toute contamination.
Cobaye (Poids moyen : 500 gr.).
Voie intra-péritonéale. — Dose mortelle : 100 milligrammes de corps bacillaires humides. Mort en moins de 18 heures ; exsudat péritonéal stérile.
Voie intra-veineuse. — Vose mortelle : 50 milligrammes ; mort en 20 heures.
2° Toxicité des corps microbiens légèrement autolysés et desséchés dans le vide. |
Pour cette expérience les bacilles humides ont été abandonnés à
>. Pour les injections dans le péritoine j'injectais cette émulsion telle quelle, mais pour les injections intraveineuses la dose employée était diluée dans l'eau physiologique de manière à toujours injecter 3 ce. de liquide.
pre
eux-mêmes à la température du laboratoire pendant 48 heures, puis desséchés rapidement dans Le vide sur l'acide sulfurique. Cobaye (Poids moyen : 500 gr.).
Voie intra-péritonéale. — Dose mortelle : 300 milligranimes b. humides ; mort en 18 heures.
Voie intra-veineuse. — Dose mortelle : 50 milligrammes ; mort
en 15 heures.
3° Toxicité des corps maicrobiens plasmolysés par le chlorure de calcium.
Cet essai portait sur un produit obtenu en mélangeant la récolte de 2 cuvettes avec son poids de chlorure de calcium cristallisé, préalablement stérilisé. La bouillie résultant de cette opération avait été abandonnée à elle-même 24 heures à la température du laboratoire, puis dialysée en sac de collodion sur eau distillée stérile jusqu'à presque complète élimination des chlorures. Le contenu des dialyseurs avait alors été évaporé dans le vide, sur l'acide sulfurique, à Ja température ordinaire ; ce sont les bacilles ainsi plasmolysés et desséchés que j'ai utilisés.
Cobaye (Poids moyen : 500 gr.).
Voie intra-périlonéale. — Dose mortelle : 50 milligrammes b. humides ; mort en moins de 18 heures.
Voie intra-veineuse. — Dose mortelle : 50 milligrammes ; mort
en 19 heures.
4° Toxicité des corps microbiens tués par l'acétone.
J'ai employé pour cette expérience des corps microbiens résultant du traitement de 30 grammes de bacilles frais par 600 ce. d'acétone. Après contact de quatre heures j'avais essoré les microbes sur un entonnoir de Büchner garni d’une rondelle de papier durci, je les avais desséchés à 40°, puis dans le vide à la température ordinaire.
Cobave (Poids moyen : 500 grammes).
Voie intra-péritonéale. — Dose mortelle : 100 milligrammes b. humides; mort en 24 heures.
Voie intra-veineusé. — Dose mortelle : 10 milligrammes; mort
en 20 heures.
Re
5 Toxicité des corps nnicrohiens lués par l'alcool.
Corps bacillaires préparés de la mème façon que dans lexpérience précédente, mais en employant de l'alcool absolu.
Cobaye (Poids moyen : 500 gr.).
Voie intra-péritonéale. — Dose mortelle : 150 milligrammes bacilles humides ; mort en moins de 18 heures.
Voie intra-veineuse. — Dose mortelle : 25 milligramimes ; mort en 20 heures.
6° T'oricité des corps microbiens épuisés par une solution faible de carbonate de sodium.
J'ai délayé 30 gr. de microbes humides dans 500 ce. d’une solution stérile, à 5 pour 1.000, de COSNa? pur: j'ai laissé en contact pendant trois heures puis J'ai centrifugé. J'ai repris les microbes ainsi traités par le même volume de solution alcaline et j'ai répété encore deux fois la première opération. Après la dernière centrifugation j'ai desséché dans le vide sur l'acide sulfurique les corps microbiens épuisés, ce sont eux que jai employés pour cette expérience.
D'autre part, j'ai rassemblé les deux litres de solution alcaline ayant servi à l'épuisement et, après filtration sur bougie Berkefeld, j'y ai ajouté peu à peu de l'acide acétique jusqu à réaction très faiblement acide. Il s'est séparé un très faible précipité albuminoïdique que J'ai recueilli et desséché dans le vide ; il pesait alors cinq centigrammes, à quelques milligrammes près.
Cobaye (poids moyen : 500 gr.).
Voie intra-péritonéale. — Dose mortelle : 23 milligrammes b. humides ; mort en moins de 18 heures.
Voie intra-veineuse. — Dose mortelle : 25 milligrammes; mort
en 15 heures.
J'ai également recherché si la substance protéique extraite par les alealis avait des propriétés toxiques ; pour cela je l'ai mise en suspension dans l’eau physiologique, stérilisée comme de coutume par l'éther et éprouvée sous la peau et dans le péritoine du cobaye. Les résultats ont été les suivants :
Voie sous-cutanée. — À la dose de 6 milligrammes de substance sèche pas de réaction générale ; localement : après 48 heu-
res gros noyau induré, au bout de quatre jours escarre brunätre de la grandeur d'une pièce de 50 centimes avec induration très marquée des tissus voisins. Au cinquième jour chute de l’escarre : dès le sixième la plaie commençait à se cicatriser, pas de suppuration. Au neuvième jour cicatrisation complète.
Voie intra-péritonéale. — À la dose de 12 milligrammes de substance sèche mort de l'animal (410 gr.) en moins de 18 heures ; péritonite, exsudat louche très abondant mais stérile.
7° Toxicité des corps nncrohens épuisés par l'alcool, l'acétone, l'éther et le chloroforme.
J'ai tué des bacilles humides par l'alcool comme dans lexpérience n° 5, mais au lieu de les dessécher, je les ai épuisés par ce dissolvant dans l'appareil de Soxhlet pendant 8 heures; puis J'ai continué l'épuisement successivement avec l’éther, l’acétone et le chloroforme. L'action de chacun de ces solvants fut prolongée pendant huit heures ; finalement j'ai chassé le chloroforme par chauffage à 50° sous pression réduite.
Pour 30 grammes de bacilles humides le poids des produits d’extraction obtenus par évaporation des dissolvants était de :
Extrait alcooliques, 2 2e PLU. 0,75 AN ON CU RS Cr 0,10 HIVER TEE SPA Perte, 2.0 0,02 Extrait chloroformique: 5 . . . 0,05
J’ai injecté dans le péritoime de quatre gros cobayes 150 et 300 milligrammes de l'extrait alcoolique ainsi que 20 et 40 milligrammes de l'extrait acétonique en suspension dans 1 ou 2 ce. d'eau physiologique ; aucun des animaux n'a succombé. Je n'ai pas expérimenté les extraits éthéré et chloroformique à cause de leur insolubilité dans l'eau.
Quant aux corps microbiens épuisés 1ls m'ont donné les résultats suivants :
Cobaye (Poids moyen : 500 gr.).
Voie intra-péritonéale. — Dose mortelle : 150 milligrammes de b. humides ; mort en 18 à 24 heures.
Voie intra-veineuse. — Dose mortelle : 10 milligrammes ; mort
en 20 heures.
Berthelot
rs
Comme on le voit par ces diverses expériences, les corps microbiens du Proteus que j'ai étudié possèdent une toxicité propre assez élevée, particulièrement lorsqu'ils ont été traités par l'alcool, l'acétone ou une solution faiblement alcaline (1).
4. La toxicité des corps microbiens tués se manifestait également bien chez le lapin ; en effet, 300 nulligrammes de bacilles humides (traités par l'acétone) suffisaient pour tuer en moins de 48 heures un animal de 2.500 grammes injecté dans le péritoine. Par voie intra-veineuse 25 milligrammes ont tué en 20 heures un lapin de 2.535 grammes.
