I. — BIOLOGIE GÉNÉRALE

Un microbe spécial présentant dans ses allures, ses aspects, ses conditions de culture, des caractères qui l’individualisent nettement a été décrit par Pfeiffer dans trois mémoires consécutifs. |

a) RECHERCHES DE PrEIFFER. — Le premier, paru dans la Deutsche medic. Wochenschrift, est de 1892. Un article paru dans la même revue, la même année, est l’annonce du grand mémoire de 1893 paru dans le Zeitschrift für Hygiène. Il sera intéressant à plus d’un point de vue de rappeler au cours de cette étude les affirmations contradictoires de Pfeiffer. elles nous montrent combien est difficile même pour les Maîtres l’observation fine et l'interprétation exacte des phénomènes bactériologiques et combien il faut être réservé avant de démembrer une espèce de microorganismes.

L'histoire de la découverte du cocco-bacille de Pfeiffer est extrêmement intéressante, car c’est un modèle de travail scientifique et les déductions que l’illustre élève de Koch tire de chacune de ses expériences sont un exemple à suivre pour ceux qui s'occupent de questions de laboratoire.

() Pour la bibliographie, consulter VeiLron. Le catarrhe suffocant. Thèse 1897.

Nous allons exposer les recherches consignées je Prerirer dans son mémoire de 1803.

Les recherches entreprises par Pfeiffer en l’année 1889-90, au moment où l’influenza s’imposa à l'attention des médecins, restèrent sans résultat, et l’auteur en conclut qu'elles présentaient une difficulté particulière. Mais dès 1800, en examinant des préparations de crachats que Kirchner lui avait envoyées, Pfeiffer remarque qu’en colorant avec la fuchsine phéniquée diluée, on y trouve une quantité énorme de petits bacilles, que jamais on ne rencontre dans les autres crachats. La photographie d’une préparation a été publiée dans le travail deKirchner (Zeitschrift, IX, p. 520) et Pfeiffer fait remarquer que l’augmentation des dimensions du bacille est due à ce que la préparation était montée à l’eau, au moment où elle fut photographiée.

En novembre 1891, nouvelle apparition de l’influenza, et dans les préparations de crachats Pfeiffer trouve à nouveau cette quantité considérable de petits bacilles. [l est d'autant plus porté à y attacher de l’importance, que, si l’influenza est une maladie microbienne et contagieuse, il est probable que son agent se trouve en énorme quantité, vu l'extension rapide de la maladie ; et où pourrait-il se trouver, sinon dans les sécrétions catarrhales si fréquentes dans la grippe ? Ces considérations théoriques amenèrent Pfeiffer à considérer que peut-être le petit bacille était a priori le bacille de l’influenza.

La recherche d’un bacille spécifique eût été trop difficile en prenant comme point de départ les sécrétions nasales ou bronchiques, où nombre de microbes et même des espèces pathogènes abondent ; mais lorsque la grippe pénètre profondément dans l’arbre respiratoire, on trouve des parcelles compactes dans les crachats, parcelles qui viennent de la profondeur du poumon où il n'existe ordinairement aucun microorganisme. Ces amas concrets sont lavés dans de l’eau stérile, et on prend en leur milieu une parcelle bien purulente. On examine sur lamelles; on colore soit avec le bleu de méthylène, dit bleu de Lôffler qui donne de bons résultats, soit avec une solution étendue

d’eau de fuchsine phéniquée que l’on laisse agir cinq à dix minutes. Les préparations ainsi faites montrent les noyaux des cellules et les bactéries teintés d’une façon intense, tandis que le fond de la préparation n’est pas coloré et que le protoplasma cellulaire présente une légère teinte rosée.

Dans toute préparation ainsi faite, lorsqu'il s’agit de cas d’influenza sans complication, on trouve une seule espèce bactérienne, en culture presque pure et en abondance extraordinaire. Les bacilles se trouvent surtout dans les parcelles purulentes; ils abondent dansle protoplasma des cellules du pus, sans jamais pénétrer dans leur noyau.

Le bacille d’influenza n’atteint pas tout à fait les dimensions du microbe de la septicémie des souris ; il est le plus souvent deux à trois fois plus long que large, mais dans presque tous les cas on trouve des formes longues qui prennent l'aspect de petits filaments, premières apparences des formes d’involution. Leurs extrémités sont arrondies. Souvent deux petits bacilles sont situés l’un à la suite de l’autre, de façon à prendre l'aspect d’un diplocoque et à amener une confusion qui a dû se produire fréquemment. [ls n’ont pas de capsule et sont immobiles en goutte suspendue ; ils se décolorent par le Gram. Dans les préparations faites avec les colorants faibles, on voit souvent les extrémités plus colorées que le milieu, de façon à donner l’aspect d’un faux diplocoque.

Ce qui met Pfeiffer sur la voie du procédé à employer pour obtenir des cultures, c’est l'opposition entre les deux expériences suivantes. Toutensemencementsur les milieux ordinairesaérobie ou anaérobie reste stérile. Mais l’ensemencement fait avec le crachat ou le pus du poumon donne sur agar un semis de colonies visibles seulement à la loupe, transparentes comme du verre, qui couvrent la superficie du milieu nutritif et sont constituées par le bacille. Toutefois tout repiquage fait sur gélatine, agar, sérum, agar-sérum, reste stérile.

C'est ici qu’ apparaissent toutes les qualités du Maître. Il se dit que cet échec ne peut correspondre qu'à deux possibilités :

ou bien l'énergie vitale du microbe s’épuise dès la première culture, et il ne peut être repiqué ; ou bien l’ensemencement fait avec le pus bronchique ou le suc pulmonaire ajoute au milieu nutritif un élément indispensable à la croissance du bacille. Cette deuxième hypothèse devint probable lorsque Pfeiffer eut constaté que les ensemencements échouaient lorsqu'on diluait dans du bouillon ou dans de l’eau stérilisée, selon la méthode de Kitasato, la prise qui servait aux ensemencements.

Après des essais de vérification, Pfeiffer trouva que l’élément indispensable était le sang humain, et il eut la clef de tous ces phénomènes.

En ajoutant à des tubes de sérum du sang pris aseptiquement, Pfeiffer put ainsi obtenir une belle culture abondante de bacilles de l’influenza; les repiquages furent positifs pendant huit mois, mais le bacille garda toujours son caractère distinctif de pousser exclusivement sur de l’agar-sang.

Mais Pfeiffer veut aller plus loin, il se dit que le sang n'est pas une substance homogène, il est formé de globules et de plasma qui se décompose lui-même en sérum et en plasma. Le fait que le sérum seul ne favorise pas la croissance, sauf quand il y reste une quantité notable de globules, reporte l'attention sur les globules. Le rôle des globules sanguins fut démontré, lorsque Pfeiffer obtint, grâce à eux, des cultures abondantes après les avoir séparés du sérum en traitant le sang par une solution de sel de cuisine.

Pour aller encore plus avant, et rechercher dans le globule rouge quel était le principe nécessaire, Pfeiffer traita les globules rouges par des congélations répétées ou par le lavage à Péther. Il sépara ainsi le plasma de l’hémoglobine, et la solu+ tion d’hémoglobine lui permit d'obtenir des colonies de bacille d'influenza aussi abondantes que le sang tout entier.

Ainsi, dit Pfeiffer, l'hémoglobineest la partie du sang indispensable à la croissance du bacille de l’influenza, et en revenant en arrière il comprit pourquoi le lavage à l’eau bouillie ou la

dilution dans le bouillon qui séparait l’hémoglobine rendaient les ensemencements stériles. |

La facile diffusion de l’hémoglobine expliquait aussi pourquoi lors des premiers ensemencements les plus belles colonies avaient pu se trouver à quelque distance du sang surajouté.

Enfin Pfei ffer sé demande si l’hémoglobine agit par sa propriété d’absorber l'oxygène et de l'abandonner au milieu ambiant ou si elle agit comme un corps contenant du fer, substance qui est indispensable au développement du crenothry x polyspora. Des expériences très rigoureuses lui montrèrent que l’hémoglobine n’agissait pas comme corps apportant de l'oxygène. Il lui suffit pour cela d'obtenir des cultures dans un milieu de culture où l'air était remplacé par un mélange d’air et d'acide carbonique en telle proportion que toute l’hémoglobine fut combinée.

Il est juste de dire que les essais faits avec les préparations ferrugineuses ne lui donnèrent aucun résultat.

A la place du sang humain, l’auteur se servit ensuite de sang de lapin, de cobayes, de pigeon et même de poisson. Tous lui donnèrent de bons résultats, le sang de pigeon, particulièrement riche en hémoglobine et très rapidement altérable, donne des résultats plus rapides ; le sang de l’homme donne, à cause de la résistance de ses globules, des colonies moins riches au début, mais cependant plus durables.

Voici alors la technique recommandée par Pfeiffer: Le suc pulmonaire ou le pus des bronches est dilué avec un ou deux centimètres cubes de bouillon de manière à en faireune émulsion légèrement trouble. Cette dilution a l’avantage de diminuer le le nombre des germes et de supprimer pour les cultures de contrôle l’apport d'hémoglobine. On ensemence ensuite sur agarsang, agar ordinaire ou agar glycériné. Après vingt-quatre heures, on constate que les tubes de contrôle sont stériles, ou ne contiennent que quelques colonies d’autres microbes comme le streptocoque ou le pneumocoque.

Sur les tubes d’agar-sang, on trouve au contraire un développement considérable de colonies visibles à la loupe, transpa-

rentes, formées du petit bacille. Ces colonies n’ont aucune tendance à se réunir les unes aux autres et lorsque leur abondance les rend confluentes, on voit encore les limites qui séparent les différentes colonies d’un même groupe.

Lorsque l’ensemencementest pauvre, les colonies bien isolées peuvent atteindre le diamètre d’une petite tête d’épingle tout en gardant une transparence absolue. Au microscope n'apparaît aucun détail de structure.

Le liquide de condensation des tubes de culture reste ordinairement clair, seulement lorsque le sang y a pénétré, il s'y développe des flocons petits et blanchâtres formés de bacilles.

Sur bouillon mélangé de sang, Pfeiffer a obtenu de belles cultures.

Le bacille d’influenza est rigoureusement aérobie. Dans un milieu où l'hydrogène a remplacé l'oxygène, on n'obtient qu’une culture pauvre où apparaissent les formes les plus anormales ; et sans doute si la culture n’est pas stérile comme en présence de l’acide carbonique, cela est dû aux traces d'oxygène qui peuvent rester.

La vitalité du bacille disparaît à 43°, mais il ne meurt pas, car il suffit de remettre les tubes à 37° pour obtenir de belles colonies.

La limite inférieure est entre 26° et 27°, températures qui sont rarement atteintes dans nos climats et qui empêchent tout développement et toute vie non parasitaire du bacille.

Pfeiffer est alors conduit à étudier ce que devient le microbe dans l’eau; il montre que dans l’eau le bacille meurt vers la 32e heure. Dans le bouillon, après quatorze ou dix-huit jours, le bacille meurt, que les tubes soient conservés à la température de la chambre, ou à l’étuve à 37°.

Le bacille de l’influenza est très sensible à la dessiccation, peutêtre encore davantage que le vibrion cholérique. Déjà au bout de cinq à dix minutes la vitalité est diminuée, et dans la règle après huit heures elle était anéantie; — jamais après vingt heures

Pfeiffer ne put obtenir de cultures, il s'agissait de bacilles mélangés à du sang. Quant aux crachats desséchés après trentesix à quarante heures, ils restaient entièrement stériles. En outre, il existait pas de spores. De cela résultent pour Pfeiffer les conclusions suivantes :

1° Un développement du bacille de l’influenza hors du corps humain dans le sol ou l’eau est absolument impossible.

2° L’extension de l’influenza par les crachats séchés ne peut se faire que dans des limites très restreintes.

3° En règle générale, la contagion se fait par les sécrétions nasales ou bronchiques.

Le mémoire de Pfeiffer se continue par une étude du bacille de l’influenza dans les crachats des grippés. Il y montre qu'au début de la maladie le bacille se trouve surtout en dehors des leucocytes; qu’au moment de la convalescence le bacille est englobé dans les phagocytes et y présente alors toutes les formes anormales que l’on retrouve dans les cultures au moment où meurt le bacille. Il appelle l'attention sur la présence prolongée du bacille dans les crachats pendant des semaines après la guérison, ce qui explique la longueur de la convalescence, et sur sa persistance au niveau des lésions chroniques du poumon, ce qui explique la mortalité considérable des phtisiques au moment ou après les épidémies d’influenza.

Le bacille de l’influenza pénètre-t-il dans le sang? On sait que divers auteurs ont trouvé dans le sang des grippés des organismes divers, surtout le pneumocoque. Weichselbaum, Kowalski, Fridrich, Bouchard n'ont rien trouvé.

Pfeiffer n'a eu que des résultats négatifs. Il a cultivé en série le sang de ses grippés et jamais il n’a obtenu le moindre résultat. Les coupes sont également restées négatives et deux fois seulement l’auteur vit à l’intérieur des petites veines des petits bacilles situés à côté ou à l’intérieur de globules blancs. Cependant le sang peut être un milieu de transport pour le bacille, comme cela se voit dans toutes les maladies microbiennes et

comme le prouvent des cultures positives: faites avec la rate et les reins.

Aussi Pfeiffer critique-t-il très vivement le travail de Canon qui n’aurait pas pris, dans ses recherches, toutes les précautions nécessaires.

En se reportant au mémoire de Canon on ne peut que constater qu’il s’est contenté de faire des examens sur lamelles sans culture, ce qui a toujours été insuffisant pour s'assurer de l’identité d’un microorganisme.

b) Mémoire DE MEUNIER. — Meunier, dansles Archives genérales de médecine de février et de mars 1897, a étudié 10 cas de broncho-pneumonie infantile due au bacille de Pfeiffer, eta donné de ce microbe une bonne description qui rappelle celle de Pfeiffer,la préciseet la complète sur plus d’un point. Nous analyserons très complètement ce travail en citant au besoin les plus intéressants paragraphes.

Tout d’abord notons que Meunier a trouvé 4 fois sur 8 le

bacille de Pfeiffer dans le sang pendant la vie, ce qui est un

peu différent des résultats de Pfeiffer et cadre bien avec nos recherches qui nous ont montré constamment la présence du bacille de Pfeiffer dans le sang du cœur vingt-quatre heures après la mort.

Voici la description qu’en donne Meunier ; on verra combien elle se rapproche de celle de Pfeiffer:

« Morphologie. — Semblable en cela à beaucoup d'autres bactéries, le cocco-bacille de Pfeiffer, qui à l’état naturel se présente toujours avec la même forme, devient au contraire assez polymorphe lorsqu'il est obtenu artificiellement ou cultivé en série.

1° À l’état naturel, le cocco-bacille s’est montré à nous sous plusieurs circonstances, grâce à nos examens directs faits immédiatement sur lames avec des liquides extraits de nos sujets. Nous avons ainsi pu le colorer dans le mucus pharyngé, dans le suc pulmonaire d’une ponction, dans le sang du cœur et surtout

dans un exsudat pleural où il était en telle abondance qu'on eût dit une culture pure du microbe. De même chez deux lapins qui succombèrent à une toxi-infection consécutive à une injection de culture fraîche de bactérie, nous avons retrouvé celle-ci en grande abondance dans les préparations du sang et dans les coupes du rein.

Ainsi examiné dans les humeurs et dans les tissus de l’organisme vivant, le cocco-bacille présente les caractères morphologiques suivants : bactérie extrêmement petite, plus petite que toutes les espèces microbiennes communément rencontrées, n’ayant d’analogie comme dimensions que le microbe de la septicémie de la souris, nécessitant, par conséquent, pour être nettement apérçue, un bon objectif à immersion ; revêtant, le plus souvent, la forme cocco-bacillaire, c'est-à-dire la forme d’un bacille très court, à peine plus long que large, les éléments sont tantôt indépendants, par exemple dans les coupes de rein de lapin infecté, tantôt et le plus souvent, réunis par deux, rappelant alors d’une façon frappante, mais aux dimensions près, le pneumocoque de Talamon ; tantôt enfin assemblés en amas enchevêtrés, comme par exemple dans la salive et le pus bronchique. Quelle que soit sa forme, cocco-bacille, diplocoque ou diplobacille, son caractère le plus frappant est son extrême ténuité. »

Du reste, Meunier a nettement vu les formes d'involution : « Lorsque la culture vieillit, dit-il, c’est-à-dire à partir du deuxième ou troisième jour, les formes allongées apparaissent et se multiplient ; bientôt même on trouve çà et là de véritables filaments longs et ténus, sinueux, scindés parfois en plusieurs segments ; ces filaments se disposent quelquefois en amas, simulant l'enchevêtrement. Ces formes filamenteuses ont été déjà signalées par Pielicke et Klein. »

Meunier insiste ensuite sur l’immobilité du bacille, la difficulté de sa coloration, les milieux de culture, le caractère aérobie des cultures.

PCT Cu

Nous voulons encore donner les résultats de ses recherches sur la vitalité de ses échantillons.

« Les intervalles des repiquages sériés, comptés en jours, ont été les suivants :

I. — Échantillon V.12..... — 6. 3. 2. 11-14. 12 (mort). Il. — — — 693322 mort).

Ii. — Échantillon,. VI. 14... = 2.5. 10. 3. 2. 7 (mort. IV. — Échantillon VIL 16... = 4. 7.2. 1.6. 8 (mort). V. — Échantillon VIII. 18... = 2-23 (mort).

VI. — Échantillon IX. 20..... 7I20101.2:3. 08-1012 (MOrt). La vitalité s'est donc épuisée du septième au douzième jour. Une série qui dure encore nous prouve au moins jusqu'ici qu’en répétant les ensemencements assez fréquemment, le coccobacille est indéfiniment repiquable. »

Voici les résultats des recherches de Meunier sur l’agglutination :

« Agglutination. -— Ayant à notre disposition, d’une part, les cultures pures et repiquables du cocco-bacille, d’autre , part, des malades et des animaux atteints d'infection grave relevant de ce microbe, nous avons cherché si le sérum de ces sujets présentait des propriétés agglutinantes ; nos résultats ont toujours été négatifs... »

€) POLYMORPHISME DU MICROBE, D'APRÈS GRASSBERGER. — [] est une question sur laquelle Grassberger est revenu avec insistance : c’est celle des formes anormales d’involution. On verra plus loin qu’il a cherché de ce fait à rompre l'unité du bacille de Pfeiffer. |

A la fin de son article sur la question des filaments dans les cultures d’influenza, article que nous analyserons plus loin, cet auteur insiste sur les formes involutives.

Certains milieux, par exemple le sérum-sang, font apparaître au bout de quatre à cinq jours de semblables formes. Dans ce .cas, il se montre de petites colonies transparentes comme sur l’agar-sang; mais,même avec l'espèce A (voir le chapitre, L'unité

du bacille de Pfeiffer), on obtient des formes longues de 10 # et plus, et qui, à un examen superficiel, paraissent formées de cocci en chaînettes ; autrement dit, il y a là un aspect streptococcique. À un examen plus attentif on reconnaît qu’il s’agit de filaments renflés inégalement de place en place, mais partout continus et dont les extrémités sont effilées ; les parties renflées . ont la forme de fuseau. Ces éléments se colorent, du reste, d’une façon plus intense que les autres microbes de la préparation.

Dans les colonies de son espèce B, sur sérum-sang, Grassberger décrit des formes bien plus irrégulières, renflées en leur extrémités ou à un point quelconque, renflements qui ont la forme de crosse, de poire ou de fuseau. Il trouve également des formes constituées par deux renflements en fuseau réunis par un unique fil, et des formes en rosettes formées de trois éléments en fuseau réunis par leur pointe.

Ces formes en rosette ont ceci d’intéressant qu’elles méritent d'être rapprochées des formes ramifiées que Zuber et Motte ont décrites dans le bacillus ramosus.

Sur les cultures sur agar-sang, Grassberger a trouvé des formes anormales qui étaient identiques à celles que nous venons de signaler ou devaient être considérées commes des formes de transition. Ces formes ne se voient pas en général dans les crachats des grippés.

d) RECHERCHES PERSONNELLES. — Daus nos recherches sur le bacille de Pfeiffer nous avons été amené à vérifier, d’une part, les détails décrits par les auteurs que nous venons de citer ; d'autre part, notre attention a été appelée sur un certain nombre de points spéciaux.

Tout d’abord dans tous les cas à bacille de Pfeiffer terminés par la mort, nous avons, à l’autopsie, trouvé le microbe dans le sang du cœur, en grande abondance. Ceci nous rapproche des recherches de Meunier, de Bruschettini et de Bouchard qui ont soit isolé, soit trouvé sur lamelles le microbe dans le sang.

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Nous voulons insister aussi sur la faible colorabilité du bacille (1).

La thionine le colore mal, comme Meunier l’a déjà constaté, le vioiet de gentiane donne des colorations ternes et dans les cultures impures, ou dans l'examen des produits organiques, il y a là un indice digne d’être signalé. Si on trouve sur lamelles un petit bacille qui se colore faiblement et sensiblement moins bien que les autres microorganismes, il y a là une piste à suivre si On ne veut pas continuer à passer à côté du cocco-bacille de Pfeiffer. Il sera même utile de prolonger la coloration ou de chauffer le violet de gentiane, ce qui donne alors de très bons résultats, ou d'employer le Ziehl dilué pendant dix minutes. Il faut s’attendre à trouver la recherche du bacille remplie de difficultés ; il faut une technique spéciale d’un bout à l’autre, mais les précautions sont simples, bien connues et feront de ce bacille jusqu'ici peu étudié un microbe aussi répandu que le pneumocoque ou le streptocoque. Nous voulons seulement signaler ce fait, que les préparations chauffées se prêtent moins bien à la décoloration par la méthode de Gram, qui est absolue pour le bacille dans les conditions ordinaires ; on verra plus loin l'importance de ce point.

Quant à l’aspect ordinaire sur lamelles, il est tel que Pfeiffer et Meunier l'ont décrit plus haut ; on aura une bonne idée de sa petitesse en sachant que le cocco-bacille n’est pas plus grand qu’un grain de pneumocoque, Mais je dois dire que si dans les cultures jeunes domine la forme en cocco-bacille, j'ai souvent constaté dès le début des formes cocciennes ou ovalaires, même avant l'apparition de toutes formes d’involution.

Les formes en diplocoque, ou en pseudo-diplocoque, sont fréquentes, en désignant sous ce nom les formes bacillaires présentant un espace clair en leur milieu.

(1) Nastikow aurait obtenu de belles,colorations en se servant du mélange suivant : 4 DHDIIDI ER AIUELIS CUIIÈNE 2. see semer -svleres MONC,<C: Solution alcaline à 1/10 de violet de méthylène ou de. RUCRS ICS NE Ne Te edpaele sans sea s nee rene r ser la is

Quant aux formes d’involution, elles apparaissent dès que la culture vieillit, dans presque tous les cas; elles apparaissent aussi dès que le microbe est cultivé sur un milieu non favorable comme le sérum-sang, l’agar-sang mal préparé, etc.; elles présentent une colorabilité spéciale tantôt plus, tantôt moins intense que celle des autres éléments, ce qui n’a rien de surprenant, étant donné qu’à l’état normal les éléments du bacille de Pfeiffer se colorent différemment dans la même préparation.

Alors apparaissent les formes signalées par Grassberger et d’autres que nous avons souvent constatées, formes renflées, ovalaires, formes en massue, formes noueuses en bâtonnets difformes. A côté des formes renflées, se présentent les formes fillamenteuses, filaments droits, courbes, en d, recourbés en un ® formé d’un ou de plusieurs éléments ; puis viennent souvent des formes en chaînettes de cocco-bacilles ou en pseudo-chaînettes formées d'éléments fusiformes retenus par leurs extrémités efflées. :

Le microbe est, examiné en goutte suspendue, absolument immobile. «

Pour le cultiver, il faut employer les milieux ensanglantés. Sur agar-hydrocèle ou agar-ascite,on obtient des résultats inconstants, souvent nuls, qui ont fait dire à Pfeiffer, Meunieret à nous-même,que le bacille ne poussait que sur milieux à hémoglobine. La proposition doit être légèrement corrigée (1).

Dans les cultures sur milieux sanglants, on peut employer tous les milieux solides. Mais le sérum-sang et la pomme de terre-sang donnent de mauvais résultats ; le milieu de choix est l’agar-sang préparé comme nous l’avons indiqué dans notre chapitre de technique. Or il est ici un détail à mentionner : comme nous puisions le sang dans nos tubes de réserve avec des pipettes qui venaient d'être retirées, ou que nous flambions avant de nous en servir, nous avons craint que les cultures ne pussent en souffrir; il n’en est rien, et pourvu que l’hémoglobine

(1) Voir plus loin l'unité du cocco-bacille hémophile.

ne soit pas altérée, il semble que les résultats soient meilleurs avec l’hémoglobine bien chauffée. Ceci est d'accord avec les recherches de Pfeiffer qui affirme qu’une température de 70° maintenue pendant une heure n’altère pas la qualité de l’hémoglobine, et de Grassberger qui insiste même sur l'utilité qu’il y a à employer l’hémoglobine chauffée à 50°.

La vitalité de nos cultures nous a paru considérable; par des repiquages faits tous les 4 à 5 jours, surtout en transformant la culture en culture mixte, comme nous le dirons plus loin, on garde aisément les échantillons vivants trois et quatre mois; et il semble évident qu'avec des repiquages attentifs on pourrait le garder indéfiniment.

Cependant un tube de gélose ensemencé richement et mis’à l’étuve reste stérile même si après quarante-huit heures on ajoute de l’hémoglobine et qu’on repique au staphylocoque. Cela prouve la faible résistance du microbe, et démontre mieux que les expériences de Pfeiffer, impossibilité d’une végétation indépendante du microbe.

Toute culture faite à la température de la chambre échoue ; toute culture faite à 50° est nulle. Les tubes de cultures qui après un séjour de deux ou trois jours à 37 degrés sont gardés à la température de la chambre, perdent rapidement, surtout en culture pure, leur vitalité. Même en culture mixte, les repiquages restent en général négatifs après quatre à six jours; il y a là du reste quelques variations selon les échantillons.

Dujardin-Beaumetz, en sac de collodion dans le péritoine de lapin, a pu conserver le microbe vivant près de deux mois (1).

(x) Voici la technique de la préparation des sacs de collodion, telle que nous l’a enseignée notre ami Cantacuzène et qu’elle se pratique à l’Institut Pasteur. ;

Préparer :

a) du collodion concentré au degré suffisant;

b) des morceaux de tube de verre;

c) des bouchons coniques en caoutchouc;

d) du fil de soie ;

e) un tube à essai de 40 centimètres servant de moule et bien calibré.

Incliner la nappe de collodion, et promener tranquillement à la surface

LA Er

Tizzoni, cité par Meunier, prétend que le bacille de Pfeiffer est tué par la lumière solaire en un temps qui varie de 96 à 144 heures.

Nous avons pu par le procédé de Zuber-Veillon adapté par nous à la culture pure ou après piqûre centrale au staphylocoque, constater que le bacille de Pfeiffer est rigoureusement aérobie.

Il est relativement facile d'obtenir des cultures en milieux liquides. Pfeiffer et Meunier ont employé le bouillon sanglant; il nous a donné de mauvais résultats. Nous avons employé les deux procédés suivants :

Lorsqu'une culture sur agar-sang est positive, on voit souvent se produire la décoloration rapide du liquide de condensation fortement teintée par l’hémoglobine au moment de l’ensemencement, et ce liquide abonde en microorganismes. Cette décoloration peut être assez intense pour qu'on soit obligé de vérifier l'étiquette du tube qui peut sembler alors un tube de gélose simple. Il suffit de rajouter à volonté une quantité de solution d’hémoglobine pour transformer la culture en milieu liquide.

Dans notre technique nous avons mentionné la redissolution de l’hémoglobine dans le sérum de lapin ; ce sérum-hémoglo-

le moule en verre bien sec et tourné d’une façon régulière. Retirer doucement sans cesser de tourner (1 min.) en le maintenant horizontal.

Plonger dans l’eau pure, 1 minute environ, pour laisser diffuser l’alcool et l’éther.

Polir la surface avec les doigts, replonger dans l’eau.

Dévaginer lentement la capote, la distendre par insufflation et la remplir d’eau.

Fixer à l’orifice (ayant une section perpendiculaire à l'axe) le petit tube en verre à l’aide d’une ligature bien serrée au fil.

Stériliser à l’autoclave un bocal contenant sacs, bouchons et pince.

Retirer le sac et l’introduire dans un verre stérile recouvert d’un papier (four Pasteur).

Aspirer toute l’eau et remplacer par un bouillon de culture. Remplir le sac jusqu’à la partie inférieure du tube de verre.

Fermer au bouchon de caoutchouc et le couper au ras du tube.

Déshydrater le bouchon à l'alcool absolu et recouvrir de collodion en couches successives qu’on laisse sécher chaque fois.

bine est un excellent milieu de culture pour le bacille de Pfeiffer et donne des cultures liquides abondantes.

Nous ne voulons pas insister sur les différents milieux employés par quelques bactériologistes. Richter aurait employé le pus.

Dans un mémoire russe analysé dans le Centralblatt für Bacteriologie, 1896, XIX, p. 474, Nasstinkoff, d'après Macé, a remplacé l’hémoglobine par le jaune d'œuf, qu’il emploie de la manière suivante. Le jaune d'œuf est mélangé à une solution de chlorure de sodium à 10 p. 100 etune petite quantité du mélange est additionnée à de la gélose fondue et refroidie à 50 degrés.

Quant à l’hémoglobine du commerce, les auteurs qui l’ont utilisée déclarent que les résultats sont inférieurs à ceux obtenus par les autres procédés, nous en prenons acte. Grassberger dit même n'avoir eu de résultats positifs que dans les cultures mixtes.

Les caractères des cultures pures du bacille de Pfeiffer montrent bien qu'il faut pour le trouver une attention spéciale.

Tout d’abord,souvent le cocco-bacille de P feilfer se développe tard et un observateur qui se contenterait d’un seul examen après vingt-quatre heures, risquerait souvent de le méconnaître. C’est souvent après deux et trois jours que la culture existe, et encore est-elle invisible à l'œil nu. Ce n'est qu’à la loupe, comme le recommande Pfeiffer, ou mieux au microscope (Meunier) en se servant de l’objectif II et de l’oculaire I que l’on voit les colonies. Cette recherche, difficile lorsqu'on n'y est pas accoutumé, devient aisée lorsqu'on prend la précaution de tracer à la surface de l’agar avec Le fil de platine une strie légère qui sert de point de repère.

Quelquefois en faisant miroiter devant l’œil le tube de culture, on à pu constater un léger dépoli. Au microscope on voit alors fourmiller des colonies bombées, hémisphériques, clairescomme de l'eau, transparentes comme du verre, sans structure apparente, colonies qui n’ont aucune tendance à la confluence, et dont les plus grandes, comme l’a noté Pfeiffer, sont les plus isolées.

Leur limpidité est telle, que les colonies de pneumocoque paraissent opaques auprès d’elles ; et si on veut continuer à dire que le microbe de Talamon Fraenkeldonne des cultures en gouttelettes de rosée, il faut dire que le cocco-bacille'de Pfeiffer présente des colonies en gouttelettes de buée.

Il en est tout autrement dans les cultures impures ou mixtes.

II. — LES CULTURES MIXTES DE COCCO-BACILLE DE PFEIFFER (Cocco-bacille hémophile).

Un phénomène particulièrement intéressant et donnant au cocco-bacille de Pfeiffer un caractère biologique différentiel bien spécifique a été décritpar Grassberger dansle Zeitschrift für Hygiene, 1897; Meunier a repris l'étude de ces phénomènes et en a fait le sujetd’une communication à la Société de Biologie, le 11 juin 1898. Après avoir analysé et étudié les résultats de ces deux auteurs, nous indiquerons les vérifications que nous avons faites, quelques modifications de détails techniques que nous y avons apportées et nous essaierons de montrer comment la connaissance de ces faits doit permettre à tous les observateurs de trouver le cocco-bacille de Pfeiffer aussi aisément que les autres microbes pathogènes, streptocoque ou pneumocoque par exemple.

a) Les recherches de Grassberger ont porté sur 30 cas, 14 étudiés en l’année 1896, 16 étudiés dans l’année 1897. De ces trente cas, il n’y en eut que six où le bacille de l’influenza ne fut pas associé à d’autres germes.

Les ensemencements étaient faits pendant la vie avec les crachats recueillis après nettoyage de la bouche à l’eau bouillie, après la mort avec le suc pulmonaire et le pus des bronches. Le sang employé était prélevé sur les caillots résultant de la préparation du sérum antidiphtérique.

Les lamelles étaient colorées soit simplement avec de la solution phéniquée de fuchsine, soit avec la même solution employée à chaud. Dans ce cas on décolorait ensuite la préparation avec

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de l’alcool légèrement acidulé selon le procédéde P feiffer. Le point de départ du travail de Grassberger fut l'étude de certaines plaques qui, ensemencées avec des crachats, montrèrent des grandes colonies d’influenza à côté de colonies de staphy-: locoques.

Il obtint alors, après vingt-quatre heures d'étuves, à côté des colonies d’influenza typiques, toutes petites, transparentes, des colonies qui après vingt-quatre heures étaient déjà visibles à l'œil nu, tout en gardant la même transparence et une convexité identique. Dans les endroits où ces colonies étaient nombreuses, elles devenaient confluentes ; maïs elles restaient distinctes malgré la communauté de leurs bords.

En leur centre, ces colonies possédaient, comme on pouvait le voir à un grossissement de 40 diamètres, une granulation qui ressemblait à un bouton central.

De telles colonies se trouvaient uniquement dans le voisinage des colonies de staphylocoques, et souvent elles formaient des colonies jumelles, qui étaient formées de deux parties : l’une blanche, saillante, avait tous les caractères des colonies de staphylocoques; l'autre avait tous les caractères de la colonie géante du bacille d’influenza. Toujours en repiquant sur agar-sang ces colonies géantes, on retrouvait les aspects typiques des colonies de bacille d’influenza en culture pure ; impossible de distinguer des repiquages des cultures pures gardées comme témoins.

Frappé de ce caractère accidentel, Grassberger cherche la raison particulière de ce phénomène, la trouve dans l'influence du staphylocoque sur le développement dubacille de l'influenza et crée alors une méthode qui lui donne des résultats vraiment utilisables.

Tout d’abord avec du pus de diverses provenances, il prépare dix cultures pures de staphylocoques dont cinq étaient du staphylocoque doré, quatre du staphylocoque blanc, une du staphylocoque citrin, et il vérifie leur pureté. D'autre part, il prépare

un mélange de colonies d’influenza et de sang et l’ensemence sur des plaques d’agar. Ensuite il repique en leur centre, les

plaques de culture d’influenza avec les colonies de staphylocoques et ilexamine les résultats après un séjour de vingt-quatre heures à létuve.

A ce moment la colonie centrale de staphylocoque a déjà plusieurs millimètres de diamètre ; elle est entourée, comme on peut le constater à l'œil nu, mais surtout avec la loupe, d'un cercle ayantde 1 à plusieurs centimètres, riche en colonies transparentes en gouttelettes de rosée. Les plus centrales présentent en leur milieu une légère granulation ; les périphériques se rapprochent du type classique des colonies d'influenza décrit par Pferffer:

Après quarante-huit heures, la zone de colonies s'étend vers le bord de la plaque.

Quelquefois, la plaque ayant été maintenue obliquement, la colonie de staphylocoque s’est continuée en une bande blanchâtre qui s’entoure de colonies géantes de bacilles d’influenza.

En examinant à la loupe le bord des colonies de staphylocoques, Grassberger peut voir que dans les anfractuosités se sont développées des colonies de bacille d’influenza. Les deux microbes sont alors presque réunis dans la même colonie, point sur lequel nous reviendrons un peu plus loin.

Les résultats sont les mêmes quelle que soit la variété de staphylocoque employée.

Partant de ce point de vue, qu’il a observé des colonies géantes dans les cultures faites avec les crachats, cultures où se trouvaient d’autres microbes que le staphylocoque, Grassberger essaie les cultures mixtes avec les plus différentes bactéries ; il constate que c’est le staphylocoque qui donne les meilleurs résultats, sans doute à cause de sa croissance abondante et rapide; il ne repousse que les espèces qui diffusent rapidement loin du point et de la strie d’inoculation de manière à couvrir la superficie du tube d’agar.

Ainsi que Grassberger, nous nous sommes servi de staphylocoque à cause de la facilité de sa culture, de la grandeur de ses éléments et de sa réaction au Gram qui permet toujours