DANS LES HUMEURS ET PRODUITS D'EXCRÉTION

Par Ph. Pagniez.

La détermination exacte de la nature de taches suspectes d'être des taches de sang a, en médecine légale, une importance sur laquelle il n'y a pas besoin d'insister.

Aussi cette question a-t-elle longuement retenu l'attention des microbiologistes et des chimistes, et aujourd'hui le diagnostic des taches de sang peut-il être établi avec une certitude quasi absolue et par l'emploi de méthodes très différentes. Nous ne passerons en revue ici que les principales, renvoyant pour les détails et pour la discussion de la valeur médico-légale de ces méthodes à l'ouvrage de Dervieux et Leclercq qui nous servira de guide (1).

Quel que soit le procédé auquel on doive recourir, la première opération consiste à traiter la tache par un liquide, de façon à obtenir une solution, sur laquelle portera l'examen. Suivant qu'on se proposera de recourir à telle ou telle méthode, le liquide qu'on fera agir sur la tache sera différent.

Quand on voudra procéder à un examen microscopique il faudra faire agir sur la tache un liquide isotonique, soit une simple solution de chlorure de sodium, soit un liquide de dilution contenant un fixateur, tel le liquide de Marcano, le liquide d'Hayem, une solution oxalatée, ou citratée.

(1) Dervieux et Leclercq, le Diagnostic des taches en médecine légale. Paris, 1912.

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Examen microscopique. — La tache ayant été traitée par une solution isoto xique qu'on aura laissé agir pendant un temps suffisant, le liquide obtenu est porté sous le microscope. L'examen peut alors y déceler la présence de globules rouges, mais seulement si la tache n'a pas subi de phénomènes de putréfaction, car dans ce cas tous les globules ont été détruits. Même quand l'examen est positif, il peut être très délicat d'affirmer qu'on a affaire à des globules humains. En effet si les globules d'oiseaux, allongés et nucléés, sont faciles à distinguer, il n'en est pas de même des globules de mammifères, surtout quand les hématies, ce qui est très fréquent, sont par suite des manipulations plus ou moins déformées.

Les données purement morphologiques étant insuffisantes on avait essayé de préciser l'origine du sang par la mensuration des globules, technique délicate, aujourd'hui désuète et sur laquelle nous n'insisterons pas.

Examen spectroscopique. — Le liquide obtenu en traitant les taches par l'eau distillée est soumis à l'examen spectroscopique. Si l'on dispose d'une quantité suffisante, l'examen se fait dans une petite cuve à bords parallèles, soit avec le grand spectroscope de laboratoire, soit avec le petit spectroscope à main. On reconnaît ainsi le spectre caractéristique de l'oxyhémoglobine avec ses deux raies entre D et E du spectre. Pour éviter toute cause d'èrreur,on complète la détermination en traitant la solution par un réducteur, tel le sulfhydrate d'ammoniaque : l'oxyliémoglobine subit le phénomène de la réduction, se transforme en hémoglobine dont le spectre ne présente plus qu'une bande unique, occupant l'espace intermédiaire entre les deux bandes primitives de l'oxyhémoglobine.

Mais il arrive souvent que les taches ont subi plus ou moins la putréfaction et l'hémoglobine est transformée. Le spectroscope permet alors de reconnaître la présence de méthémoglobine.dont le spectre présente 3 bandes; puis, la putréfaction étant plus avancée, d'hématine.

Celle-ci a un spectre différent suivant qu'elle est en solution acide ou alcaline. Le dernier surtout est intéressant par la transformation que lui font subir les agents réducteurs. L'hématine réduite présente alors deux bandes, l'une entre les raies D et E, à peu près dans l'espace intermédiaire entre les deux bandes que produisait l'oxyhémoglobine, l'autre moins intense et plus mince située un peu au delà de la raie E.

Quand la quantité de sang est très minime on pourra être amené à faire la recherche par la spectromicroscopie. On emploiera alors un petit spectroscope spécial qui remplace l'oculaire du microscope

TACHES DE SANG 3ll

et permet de faire porter l'examen sur une simple goutte de liquide et même sur la tache elle-même, quand il s'agit de taches situées sur des tissus. On recherche alors pour caractériser la tache le spectre de l'hématine réduite dont on vient de parler et qui est particulièrement caractéristique du sang. Le fragment de tache ou de tissu est traité entre lame et lamelle d'abord par la potasse qui assure la transformation de l'hémoglobine en hématine alcaline, puis par le sulfhydrate d'ammoniaque qui donne l'hématine réduite en solution alcaline.

Examen chimique. — Le liquide obtenu en traitant les taches par l'eau distillée peut être soumis aux épreuves qu'on trouvera mentionnées dans le chapitre suivant et soumis aux réactions de Weber, de Meyer, etc. (voir p. 316).

Examen par les méthodes cristallographiques. — On se propose en suivant ces techniques de préciser la nature des taches par la mise en évidence de cristaux caractéristiques d'un dérivé de l'hémoglobine. Les cristaux d'hémine sont recherchés d'une façon presque exclusive. Pour les obtenir, on traite la tache par une très petite quantité d'eau distillée de façon à avoir une solution bien colorée. Celle-ci est évaporée sur une lame, en prenant la précaution, pour obtenir un résidu suffisant, de faire évaporer à la même place une série de gouttes de la solution. Puis on traite le résidu par l'acide acétique glacial dont on fait évaporer ég lement une série de gouttes à la même place. Quand l'opération est bien conduite on obtient des cristaux d'hémine qu'il faut chercher avec un fort grossissement au centre et à la périphérie de la préparation. Ce sont des cristaux translucides, dont la couleur varie du brun foncé au brun clair, ayant la forme de prismes allongés, rhombiques, et dont la taille varie de 1 à 20 ;^. Ces cristaux sont caractéristiques du sang.

Recherches par les méthodes biologiques. — Tous les procédés que nous venons de passer en revue ne peuvent donner de précisions sur la nature du sang auquel on a affaire. Jusqu'à l'apparition des méthodes dont il nous reste à parler, seul, l'examen microscopique, dont on a vu toutes les imperfections, pouvait essayer de donner une réponse à la question souvent posée à l'expert : s'agit-il de sang humain ?

Plusieurs méthodes biologiques se proposent aujourd'hui de le faire. Elles résultent de l'application à la médecine-légale de no ions acquises peu à peu dans le domaine de la sérologie et de l'immunité, et touchant

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les précipitines, les agglutinines, la méthode de déviation du complément, l'anaphylaxie.

Méthode des sérwns précipitants. — Un animal ayant reçu quelques injections de sérum d'un animal d'une autre espèce fournit un sérum précipitant pour le sérum qu'on lui a injecté. Tel est le fait qui sert de base à cette méthode dont on doit principalement la technique à Uhlenhut, celui-ci ayant réalisé l'application à la médecine légale de notions sur les précipitines, découvertes simultanément et indépendamment par Bordet et Tschistovitch.

L'ensemble de ces recherches a démontré qu'il y avait une spécificité relative importante dans ces réactions, c'est-à-dire que le sérum de l'animal préparé ne donne de précipité considérable qu'en présence du sérum d'un animal de l'espèce qui a fourni l'antigène.

Pratiquement, on utilise comme animal réactif le lapin. L'animal reçoit en 3 semaines de 20 à 30 centimètres cubes de sérum humain, aseptiquement recueilli. Les injections sont faites à intervalles variés : soit 3 injections de 10 centimètres cubes, soit 6 injections de 3 centimètres cubes. Les injections sont faites soit sous-cutanées, soit intrapéritonéales, soit même intra -veineuses en prenant soin pour les dernières de les faire en deux temps suivant la technique de Besredka pour éviter les accidents d'anaphylaxie.

Une semaine après la dernière injection l'animal est saigné et fournit un sérum actif, qu'on peut utiliser de suite ou conserver aseptiquement à la glacière.

Ce sérum de lapin antihumain, mélangé à du sérum d'homme, donne rapidement un précipité abondant. Il précipite aussi le sérum de singe, de bœuf, de cheval, de chien, de mouton, etc.. mais avec une intensité beaucoup moindre, qu'on mesure par des dilutions progressives. Cette différence dans le degré de sensibilité des sérums permet donc d'utiliser le sérum antihumain comme réactif pour déceler la présence de sang humain.

Dans l'étude des taches la recherche est conduite de la façon suivante: la tache e t imbibée, non pas d'eau distillée, mais d'eau physiologique et de façon à obtenir une solution de sang qui soit approximativement de 1 p. 500 à 1 p. 1.000. On clarifie la solution par centrifugation et filtration, et 1 on vérifie sa neutralité au papier de tournesol.

On met dans un tube 9 parties de la solution du sang et on laisse couler à sa surface une partie de sérum précipitant (soit 0 cmc. 9 et 0, 1, ou des quantités plus considérables) ; le mélange est mis à 37°. Au bout de 5 minutes un trouble se produit au point

de contact des deux liquides, qui s'accentue, devient floconn ux et aboutit à la constitution d'un véritable préoipité qui gagne le fond du tube. Après 20 minutes, le tube est retiré de l'étuve et conservé 24 heures à la température du laboratoire pour contrôler le résultat après ce temps.

Ce que nous avons dit sur l'absence de spécificité absolue de ces sérums précipitants implique qu'il est indispensable de contrôler la valeur du résultat obtenu par une série de témoins dans lesquels les proportions seront les mêmes et qui réaliseront la mise en présence du sérum précipitant avec de la solution physiologique, du sang humain de plusieurs provenances, du sang d'animal, des liquides de macération d'étoffe, ou de bois, pris en des points autres que la tache,etc. Bien entendu d'autres témoins seront faits avec un sérum de lapin non préparé et non précipitant.

Pour que la réaction soit admise comme valable, il faut que le sérum ne donne aucun précipité dans les mélanges qui ne contiennent pas de sang et témoigne d'une activité élective considérable pour le sang humain. Seul, en effet, le sang des singes supérieurs est susceptible de donner une réaction avec une sensibilité voisine de celle du sang humain.

Méthode anaphylactique. — Pour déterminer si les taches de sang auxquelles on a affaire sont des taches de sang humain on peut recourir à des techniques basées sur l'anaphylaxie. En voici le principe : un cobaye qui a reçu une injection intraveineuse d'une petite quantité de sang humain, frais ou vieux, altéré ou non, est, après un temps de 12 jours environ, sensibilisé pour le sang humain. Si, à cet animal en état d'anaphylaxie,on fait une injection, de préférence intra-cérébrale, ou intra-cardiaque de sang humain, il est pris aussitôt d'accidents anaphylactiques graves. Cette sensibilisation est assez étroitement spécifique et l'injection à l'animal de sangs d'autre provenance ne donne lieu à aucun accident. Dès lors on pourra recourir à deux procédés. Si l'on dispose d'une certaine quantité de sang relativement frais on pourra essayer l'action de ce sang en injection à la dose d'un centimètre cube environ chez un cobaye antérieurement préparé : s'il donne le choc anaphylactique on a affaire à du sang humain. Le plus souvent on devra se servir du produit de dilution de la tache pour sensibiliser les cobayes. La quantité nécessaire pour sensibiliser est très minime et il suffit en injection intra-cardiaque d'un centimètre cube d'une solution de sang au cinquantième (Leclercq et Minet). 15 à 20 jours après on éprouve les cobayes par injection intra-cardiaque ou intra-veineuse à l'un de 1 centimètre cube de sang humain et comparativement aux

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autres de 1 centimètre cube de sang de cheval ou de lapin. Si l'animal qui reçoit le sang humain présente et présente seul des accidents de choc anaphylactique, le liquide provenant des taches qui a servi à préparer les cobayes contenait du sang humain.

Cette méthode très sensible et très étroitement spécifique a fait, on le conçoit, l'objet de très nombreuses recherches pour en déterminer la technique et la valeur ; elles sont dues après les premiers travaux dans cette voie de Besredka, de Rosenau et Anderson, de Peiner, à Uhlenhuth, Thomsen, Leclercq et Minet, Parisot. Il est résulté de c s recherches que la méthode anaphylactique paraît au point de vue médico-légal avoir une valeur égale à celle de la réaction de précipitation. Celle-ci a une supériorité, c'est de pouvoir être utilisée extemporanément puisque, comme nous l'avons vu, il est facile de conserver pendant longtemps un sérum précipitant.

D'autres méthodes biologiques ont été proposées, basées sur l'érythroprécipitation, l'érythro-agglutination, la réaction de fixation de Bordet- Gengou. Elles peuvent également donner, le cas échéant, des résultats intéressants. On en comprend facilement le principe ; l'exposé de leur technique nous entraînerait trop loin.

Au résumé, les procédés actuels permettent de déterminer la nature d'une tache suspecte par la mise en œuvre de plusieurs techniques dont l'emploi simultané reste toujours indispensable. Le microscope, le spectroscope, les réactions chimiques et cristallographiques permettent d'affirmer qu'on est en présence de sang ; la recherche de la séroprécipitation de l'hémo-anaphylaxie ou d'une autre propriété biologique permet de dire que ce sang est du sang humain.

RECHERCHE DU SANG ET DE SES DERIVES DANS LES HUMEURS ET PRODUITS D'EXCRÉTION

La présence de sang même en quantités minimes dans des liquides de l'organisme ou dans des produits d'excrétion qui normalement n'en contiennent pas, peut avoir au point de vue de l'orientation d'un diagnostic une importance sur laquelle il serait superflu d'insister. Aussi est-il toujours important de procéder avec une bonne technique aux examens qui ont pour objet la constatation de sang.

Lorsque le sang paraît exister en nature dans un liquide (urines, liquide céphalo-rachidien, liquides de pleurésie, d'ascite, d'hydrocèle,

etc..) on procédera à l'examen direct portant soit sur le liquide te quel, soit sur le culot obtenu par centrifugation.

L'examen microscopique permet alors de reconnaître la présence des globules, normaux ou altérés suivant les conditions de milieu dans lesquelles se trouve le sang. Si le sang a été hémolyse et que l'examen microscopique soit dès lors impossible ou insuffisant, on recourra à l'examen spectroscopique qui permettra de reconnaître la présence d'oxyhémoglobine, ou de ses dérivés : hémoglobine réduite, méthémoglobine (voir p. 41 recherche de V hémoglobine par V examen spectroscopique).

Mais on peut avoir affaire à des liquides anciennement hémorragiques où l'hémoglobine a subi des transformations plus avancées et, surtout avec les produits d'excrétion du tube digestif par exemple, à des milieux dans lesquels l'examen microscopique ne peut donner de résultats satisfaisants et où l'examen spectroscopique perd tous ses droits. Le médecin dispose alors de plusieurs procédés permettant de déceler des quantités de sang, même minimes, mélangées à des produits de déchet les plus variés.

Nous retiendrons deux de ces procédés qui sont devenus d'un usage courant pour la mise en évidence de minimes quantités de sang, et tout spécialement dans le contenu de l'estomac et dans les fèces. Ce sont les réactions de Weber et de Meyer.

La réaction de Weber nécessite de l'acide acétique cristallisable, de l'eau oxygénée officinale fraîche à 12 volumes, de l'éther, une teinture de gaïac fraîchement préparée. Celle-ci devra donc être faite au moment de s'en servir en triturant dans un peu d'alcool à 90° un fragment de résine de gaïac.

Pour la recherche du sang dans l'urine ou un liquide organique on verse dans un tube environ 10 centimètres cubes de l'urine ou d.u liquide ; on ajoute 1 cmc. de la teinture de gaïac fraîche, puis, après agitation, quelques gouttes, 5 à 10, d'eau oxygénée. Si le liquide contenait du sang il se produit une coloration bleue d'intensité variable immédiatement ou quelques instants après l'agitation du tube. Si la réaction est faiblement positive, la coloration est vert \ La réaction est négative quand le mélange conserve sa couleur initiale.

Pour rechercher le sang dans les matières fécales, les vomissements, et en général les matières organiques solides, on opère de la façon suivante. Quelques grammes de la substance à examiner sont triturés dans un verre conique avec un peu d'eau, puis additionnés de 1 à 2 centimètres cubes d'acide acétique cristallisable pour mettre en liberté l'hémoglobine. On ajoute quelques centimètres cubes d'éther destiné

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à dissoudre l'hémoglobine ; on laisse reposer. L'éther est décanté dans un tube à essai ; la recherche s'effectue alors de la même façon que plus haut : addition d'environ 1 centimètre cube de teinture de gaïac et de quelques gouttes d'eau oxygénée; production de coloration bleue si la substance examinée contient du sang. Il faut noter que la coloration bleue est fugace et disparaît au bout de peu de temps.

La réaction de Kastle-Meyer est encore plus sensible que la réaction de Weber ; elle peut en effet déceler la présence de sang dans des dilutions au millionième alors que la réaction de Weber est sensible au dix-millième. Elle repose sur l'oxydation de la phtaléine du phénol par les oxydases du sang.

Elle nécessite de l'alcool acétique (2 d'acide acétique pour 100 d'alcool), de l'eau oxygénée ordinaire, le réactif de Meyer, dont la formule est :

Phénolphtaléine. . . 1 gr.

Potasse caustique . . . 1 0 gr.

Eau distillée 50 gr.

Poudre de zinc. ... 5 gr.

Porter le tout à l'ébullition qu'on maintiendra jusqu'à décoloration du liquide. Filtrer bouillant et conserver dans un flacon bouché à l'émeri, en présence de poudre de zin (Grimbert).

Pour la recherche du sang dans l'urine on ajoute dans un tube à 5 centimètres cubes d'urine une quantité égale d'alcool acétique, 2 centimètres cubes du réactif de Meyer et quelques gouttes d'eau oxygénée fraîche. S'il y a du sang l'urine se colore immédiatement en rouge carmin plus ou moins intense.

Pour la recherche du sang dans les vomissements, les liquides retirés de l'estomac et les selles, on triture dans un verre à expérience quelques centimètres cubes de matière avec de l'eau distillée additionnée d'alcool acétique. Le liquide filtré est additionné de quelques gouttes de réactif de Meyer et de quelques gouttes d'eau oxygénée. La présence de sang se traduit par une coloration rouge plus ou moins intense.

Pour avoir toute sa valeur il faut que la coloration soit franchement rouge et d'apparition immédiate ; il faut aussi que la réaction soit faite à la température moyenne du laboratoire, car au-dessus de 30° le réactif peut s'oxyder même en l'absence de sang et donner la coloration rouge .

Ces deux réactions sont très sensibles, surtout la réaction de Meyer

Elles ne sont pas absolument spécifiques, mais ont toutefois une valeur considérable .

La constatation d'une réaction positive permet de conclure à la présence de sang, il faut donc s'entourer, en particulier quand on opère sur les matières fécales, de précautions pour éviter l'introduction de sang dans le tube digestif avec les aliments et le malade devra être à la diète lactée depuis 48 heures. D'autre part le sang reconnu, il restera à établir son origine : helminthes , hémorroïdes, ulcération néoplasique ou autre, etc.