LE BACILLE DE LA DIPHTÉRIE

En 1883, Klebs (1) signala dans les fausses membranes des sujets atteints dë diphtérie un bacille spécial qu’il décrivit.

L année suivante, Lœffler (2) parvint à isoler à l’état de pureté Je bacille de Klebs. Il put reproduire des fausses membranes diphtériques chez certains animaux en badigeonnant leur muqueuse excoriée avec des cultures pures. Il constata son action pathogène ; mais, ne pouvant arriver à obtenir les paralysies caractéristiques qui accompagnent le plus souvent la diphtérie, il n’osa se prononcer sur sa spécificité.

Plus tard, G. von Hoffmann (3) rencontra dans un grand nombre d’observations le bacille de Klebs-Lœffler, accompagné souvent d’un autre bacille présentant les mêmes caractères que ni. mais dénué de toute virulence.

Ce sont les beaux travaux de Roux et Yersin (4) qui ont mis

ors de doute la spécificité du bacille découvert par Klebs et étudié par Lœffler.

Uos premiers, ils ont réussi à reproduire expérimentalement, à 1 aide de cultures pures, les paralysies typiques de la diphtérie, on même temps qu’ils démontraient dans les cultures l’existence ^ nn poison redoutable, de nature toute spéciale : la toxine

SÉRUMS ANTITOXIQUES

Caractères du bacille diphtérique.

Le bacille de Klebs-Lœfflec est de la longueur du bacille de la tuberculose, mais plus épais. Les extrémités arrondies prennent plus fortement la couleur que la partie moyenne. Il est immobile. 11 se colore bien par le bleu de méthylène alcalin de Lœffler et mieux encore par la solution de bleu composé proposée pai Roux (5). C’est un anaérobie facultatif.

Il ne donne pas de spores. Il meurt à partir de 58°; mais, s’il est desséché, il peut supporter une température de 96°-98° pendant 1 heure sans périr.

Il pousse très bien dans le bouillon peptonisé alcalin. 11 forme un voile à la surface du liquide et donne un léger dépôt adhérent au vase. Le houillon reste clair. La réaction du milieu, d’abord alcaline, devient peu à peu acide, puis finit par redevenir alcaline si le milieu est largement aéré.

Sur gélatine, il pousse mal ; ce n’est qu’au bout de 13 à 14 jours que les colonies apparaissent. Sur gélose, il donne une bonne culture, mais nullement caractéristique.

Son milieu de prédilection est le sérum sanguin solidifié. C’est grâce à ce milieu que Lœffler est arrivé à le séparer des espèces variées qui l’accompagnent dans les fausses membranes.

Sur sérum, les colonies du bacille diphtérique apparaissent avant toutes les autres. Elles se présentent sous la forme de petites taches arrondies d’un blanc grisâtre, dont le centre est plus opaque que la périphérie.

Cette rapidité de développement sur le sérum solidifié a été mise à profit pour le diagnostic rapide de la diphtérie. Douze heures après l’ensemencement, le médecin peut déjà être fixé sur la nature de l’angine suspecte.

Comme la préparation de ce sérum est longue et délicate, on a proposé de le remplacer par des milieux variés : sérum peptoné et sucré (Lœffler), sérum sucré alcalinisé fortement à la soude (Cobbett) (6), alcali albumine à la gélose, urine gélosée, blanc d’œuf coagulé (7), gélose au jaune d’œuf, etc.; mais aucune de ces préparations ne mérite de nous arrêter un instant. Le meil-r leur milieu de culture et de diagnostic est encore le sérum soU' difié ordinaire.

lA TOXINE DIPHTÉRIQUE

Inoculation aux animaux. — Les animaux inoculés avec des cultures virulentes du bacille de la diphtérie succombent rapidement avec tous les symptômes d’un empoisonnement aigu; l’autopsie révèle des lésions variables avec l’espèce animale éprouvée.

Les cobayes succombent avec de faibles doses en trente-six heures. On constate au point d’inoculation un œdème gélatineux plus ou moins étendu et une dilatation générale des vaisseaux, avec une congestion intense des capsules surrénales. Les plèvres sont le siège d’un épanchement séreux abondant, mais le foie reste intact.

Le lapin ne présente pas de rougeur des capsules surrénales, mais le foie subit la dégénérescence graisseuse; pas de pleurésie, mais congestion des poumons.

Le pigeon n’offre aucune lésion apparente des organes internes, mais une congestion généralisée avec dilatation des vaisseaux.

Dans le cas d’inoculation expérimentale, on ne peut retrouver e bacille qu’au point d’inoculation, ainsi que l’avait constaté i-iœtfler ; ce n’est qu’exceptionnellement qu’on a signalé sa présence dans le foie. Môme chez les animaux qui ont succombé à une injection intraveineuse de culture diphtérique, l’ensemen cernent des organes reste stérile (Roux et Yersin). Ces faits sont d accord avec les résultats que donne l’examen du sang et des organes des personnes mortes de la diphtérie.

Le bacille existe dans les fausses membranes, mais seulement dans les fausses membranes; il ne se généralise jamais.

LA TOXINE DIPHTÉRIQUE

Nous sommes donc ici en présence ji’un bacille qui, comme celui du tétanos, sécrète sur place un poison soluble, une toxine, d une activité redoutable agissant en dehors du microbe qui l’a

produite.

C'est ce que démontrèrent clairement Roux et Yersin (8) en reproduisant chez les animaux, avec les cultures filtrées sur

66 SÉRUMS ANTITOXIQUES

porcelaine, les mêmes accidents qui accompagnent l’inoculation ^ de cultures virulentes.

Ils firent voir les analogies nombreuses qui rapprochent le poi- v son diphtérique des diastases. ■

C’est d’abord l’action de la chaleur. A partir de 58”, le pouvoir toxique d'une culture filtrée baisse sensiblement; au-dessus de v 70% il est presque détruit ; à 100% il l’est tout à fait pour les petites doses; mais, si on inocule des doses massives de la toxine ainsi ^ modifiée, elle détermine chez l’animal un état cachectique qui s’accompagne de paralysies des membres et se termine ordinairement par la mort.

L’air et la lumière altèrent rapidement la toxine diphtérique et diminuent son activité.

Il en est de même de tous les oxydants, bichromate de potasse, . permanganate de potasse, eau oxygénée, iode, hypochlo- î rites, etc.

Elle est insoluble dans l’alcool, qui la précipite. On ne peut néanmoins, par ce procédé, espérer la séparer à l’état de pureté des milieux où elle existe, parce que, à chaque précipitation, elle perd de son activité.

Elle est entraînée mécaniquement par certains précipités, tels -, que le phosphate de chaux auquel elle adhère énergiquement. - Si l’on introduit une parcelle de ce précipité, préalablement lavé à l’eau stérilisée, sous la peau d’un cobaye, il meurt en trois % ou quatre jours, et l’autopsie montre les lésions caractéristiques de l’empoisonnement diphtérique. Les grains de phosphate de 4 chaux sont emprisonnés dans un réseau fibrineux mêlé de globules blancs formant une véritable fausse membrane.

Ce même précipité, desséché dans le vide, conserve longtemps ^ ses propriétés; il peut être chquffé à 100% ou être exposé à l’air sans cesser d’être actif. 4

La puissance toxique du poison diphtérique ne peut être com- ^ parée qu’à celle de la toxine tétanique. Un gramme de toxine ^ sèche, c’est-à-dire d’extrait sec de culture filtrée et dont la J majeure partie est constituée par des substances inertes, peut : faire périr 20.000 cobayes ou S. 000 lapins! /

Si certaines réactions la rapprochent des matières albumi-^: noïdes, d’autres au contraire l’en éloignent : telle est, par J exemple, l’expérience de Guinochet (9), qui, ensemençant le J

LA TOXINE DIPHTÉRIOÜE

bacille de Lœffler dans une urine normale, non albumineuse, obtint un liquide très riche en toxine dans lequel il lui fut impossible de déceler la moindre trace de matière albuminoïde par les réactifs ordinaires.

Essais de 'purification. — De nombreux essais ont été tentés pour isoler et purifier la toxine de la diphtérie.

L. Brieger et C. Fraenkel (10) font arriver goutte à goutte, dans un grand volume d’alcool glacé, la culture filtrée à la bougie et additionnée de quelques millièmes d’acide acétique qui favorise la précipitation. Après 12 heures, le précipité est séparé et redissous dans l’eau, puis précipité de nouveau par 1 alcool. Ils recommencent trois ou quatre fois cette opération qu ils terminent parla dialyse. Ils obtiennent, après dessiccation dans le vide, une substance blanche amorphe légère et grumeleuse qu’ils considèrent comme la toxine pure. Elle présente es caractères d’une matière albuminoïde, mais elle est SO fois moins active que la toxine de Roux et Yersin. C’est évidemment un mélange complexe. Ils n’en ont pas moins donné une anayse élémentaire 'que nous ne reproduisons pas ici.

Wassermam et Proskauer (11) font usage de sulfate d’ammouiaque à saturation. Le précipité dissous dans l’eau est dialysé, puis précipité par l’alcool. Le produit final renferme encore 20 % de cendres.

Brieger et Boer (12) ensemencent le bacille de Lœffler dans de 1 ui’ine préalablement dialysée. Ils précipitent la toxine par addition de chlorure de zinc et décomposent le précipité zincique par le phosphate de soude. Mais les toxines régénérées sont encore loin d’être pures.

Toxine des corps microbiens. —D’après Brieger, à côté de cette oxine soluble, le corps des bacilles diphtériques renfermerait ^ue toxine insoluble capable cependant d’agir sur les animaux, as microbes recueillis sür une bougie de porcelaine sont tués par la chaleur, puis mis à macérer dans une solution de chloï’hydrate d’ammoniaque pour les débarrasser de la toxine soluble qu’ils contiennent. Après lavage et dessiccation, ces cadavres de bactéries constituent une poudre blanche qui, inoculée à un cobaye, détermine de la nécrose au point d’inocu-

SÉRUMS ANTITOXIOUES

lation et peut tuer un animal de 500 gr. à la dose de 0,01 centigr. — Chauffée à 100®, elle reste active. Mais de nouvelles expériences n’ont pas confirmé ces résultats ; elles ont montré que la toxine qu’on obtient est tout simplement la toxine ordinaire un peu modifiée par les manipulations et bien moins active que ne le dit Brieger.

IMMUNISATION

Bien des essais furent tentés sans résultat, jusqu’au jour où G. Fraenkel (13) en 1890, après de nombreux tâtonnements, montra qu’on pouvait rendre des cobayes réfractaires à l’inoculation du virus vivant en leur injectant préalablement une culture filtrée sur porcelaine et chauffée pendant une heure entre 65 ’ et 70°.

Peu après, Behring (14) s’adressait dans le môme but au liquide pleurétique de cobayes morts de la diphtérie. L’exsudât pleural dans ce cas ne contient pas de bacilles, mais il est plus ou moins toxique pour le cobaye. Ceux qui ne succombaient pas à la suite d’une inoculation de 10 à 15 cent cubes restaient longtemps malades, mais une fois rétablis, ils supportaient des doses de virus vivant pouvant tuer un cobaye neuf en trois jours.

Il essaya aussi l’emploi de certains antiseptiques, tels que le trichlorure d’iode, l’acide trichloracétique, l’eau oxygénée, qu’il inoculait après l’injection du virus vivant, et il obtint quelques succès.

Mais c’est surtout en ajoutant le trichlorure d’iode à la culture même qu’il réussit le plus sûrement à conférer l’immunité aux animaux. Le trichlorure d’iode annihile les effets de la toxine, et la culture devient inoffensive. En diminuant pett à peu la dose de l’antiseptique, on habitue l’animal à rece-* voir des quantités croissantes de toxine, jusqu’au jour où il devient capable de résister à l’inoculation de cultures très virulentes et très toxiques.

Parallèlement à ces expériences, Behring et Kitasato (19)

l’antitoxine diphtérique 69

poursuivaient leurs recherches sur le tétanos. On sait comment ils découvrirent les propriétés antitoxiques du sérum des animaux immunisés contre cette maladie.

La toxine diphtérique est trop voisine de la toxine tétanique par ses propriétés générales pour ne pas donner des résultats analogues. Et en effet, comme pour le tétanos, le sérum des animaux immunisés contre la diphtérie acquiert la propriété de détruire la toxine in vitro et de préserver de ses effets les animaux auxquels on l’injecte préventivement. On peut aussi injecter d’abord la toxine, puis plusieurs heures après le sérum, 1 animal ne périt pas. Le sérum est donc préventif et thérapeutique même contre le virus vivant.

L’ANTITOXINE DIPHTÉRIQUE

Comme dans le tétanos, l’introduction dans l’organisme du poison diphtérique donne naissance à une antitoxine dont les propriétés générales sont calquées sur celles de l’antitoxine tétanique.

Gomme elle, elle e^t détruite par la chaleur, elle est précipitée par l’alcool et le sulfate d’ammoniaque. Elle s’atfaiblit peu à, peu par son exposition à l’air ou à la lumière. Comme oLe, elle conserve au contraire toute son activité dans le sérum desséché à basse température.

L antitoxine diphtérique existe surtout dans le sang et aussi dans le lait, comme l’a démontré Ehrlich.

Mais pas plus que pour l’antitoxine tétanique, nous ne sommes fixés sur sa nature intime.

Divers essais ont été tentés pour isoler cette antitoxine ou au ’^oins pour l’obtenir à un état de grande concentration : Wassermann (ifi) traite le lait des animaux immunisés par de la présure et, après coagulation, agite le sérum avec du chloroforme pour enlever la matière grasse. Le liquide clair, additionné de 33 % de sulfate d’ammoniaque, donne un précipité que l’on sèche dans le vide. Ce précipité renferme toute l'antitoxine wjélangée de substances albuminoïdes et de sulfate d’aramo-

70 SÉRUMS ANTITOXIOUES

niaque. Aronson (17) a publié un procédé assez compliqué qui consiste à précipiter le sérum sanguin dilué au moyen de sulfate d’alumine et d’ammoniaque.

En 1896, Brieger et Boer (12) indiquèrent une méthode qui élimine l’emploi de l’alcool et du sulfate d’ammoniaque et qui consiste à ajouter du chlorure de sodium et du chlorure de potassium à du sérum sanguin ou à du lait, et à maintenir pendant assez longtemps le mélange à la température de 30“ à 37°. L’antitoxine se précipite mélangée à de l’albumine et à des sels. On se débarrasse des sels par dialyse et de l’albumine par le sulfate de magnésie; 10““ de sérum ont donné ainsi 0«40 de produit brut.

Les mêmes auteurs ont aussi décrit un autre procédé qui consiste à ajouter à 10““ de sérum 20““ d’une solution de sulfate ou de chlorure de zinc à 1 %. Il se forme un dépôt que l’on recueille sur un filtre et que l’on lave avec précaution, puis on le dissout dans de l’eau très légèrement alcaline (1 goutte de solution normale de soude pour 20““ d’eau) et on précipite le zinc par l’acide carbonique'. Seulement, ce qu’il importe de retenir, c’est que si l’on s’est servi de sulfate de zinc, l’antitoxine sera entraînée dans le précipité de carbonate de zinc formé ; au contraire, avec le chlorure, elle restera en solution dans le liquide. 10““ de sérum ont donné ainsi O^'ilO d’une poudre facilement soluble dans l’eau et renfermant la totalité de l’antitoxine.

Toutes les méthodes de concentration de l’antitoxine sont certainement intéressantes au point de vue spéculatif, mais n’ont guère de chance de passer dans le domaine de la pratique, et nous dirons avec Roux : « Pourquoi toutes ces manipula- « tiens, quand il est si facile d’avoir un sérum qui sort des « vaisseaux plus actif que toutes les antitoxines prétendues « concentrées? »