IV. — Développement des cultures

§ 1. Ensemencement des cultures . — L’isolement du Sp . icterohemorragiæ est, en général, assez aisé : dans une vingtaine de tubes renfermant 10 cm3 du mélange sérum de Lapin- eau physiologique sous couche d’huile de vaseline, on dépose des fragments de surrénale et de foie de Cohaye ictérique ; au bout de quelques jours, on obtient ainsi un nombre variable de cultures. Avec le sang prélevé 24-48 heures avant la mort de l’animal, les résultats positifs sont encore plus constants : 2 à 4 tuhes, ensemencés avec quelques gouttes, suffisent dans la majorité des cas. En procédant de cette manière, quelques tubes deviennent le siège d’une multiplication assez abondante; les microorganismes isolés survivent plus ou moins longtemps, mais, dans quelques cas seulement, ils peuvent être repiqués avec succès. A ce propos, il importe de noter que les cultures de Spirochètes ne se comportent pas comme celles des Bactériacées ; les réensemencements exigent une quantité notable de culture et, pour un tube renfermant 10 cm3 du mélange sérum de Lapin-eau physiologique, nous employons plusieurs grosses gouttes; on échouerait fréquemment si on se bornait à réensemencer avec une anse de culture. Une fois les microorganismes habitués au milieu, les repiquages se font aisément et, cela pendant des mois, peut-être même pendant des années. A 29°-30°, les souches entraînées fournissent très rapidement des cultures. Dès le 4e jour, parfois même dès le 2e, on y voit apparaître quelques rares Spirochètes, qui augmentent rapidement en nombre de façon à atteindre la densité maxima, vers le 10e ou le 12° jour ; évidemment, il ne s’agit là que de dates approximatives, variables suivant une foule de facteurs, notamment la température, l'importance de la masse d’ensemencement, etc. Dans le milieu sérum de Lapin-eau physiologique, maintenu à 29°, les cultures persistent en bonne condition pendant une vingtaine de jours; au bout d’un mois, elles tendent vers la terminaison.

LE PARASITE

§ 2. Morphologie des Spirochètes des cultures. — A. D'une façon générale, les microorganismes des cultures reproduisent la morphologie de ceux observés dans les humeurs et tissus des animaux sensibles au virus. Nous avons donc encore affaire à des organismes constitués par un filament très finement spiralé, dont l’agencement n’est bien mis en évidence que par un ultramicroscope puissant (pi. I, 1 et 2). Contrairement à l’affirmation d’un petit nombre d’auteurs, dès leur apparition dans le milieu de culture, les Spirochètes (1) nous ont toujours apparu comme des éléments hélicoïdaux; par conséquent, nous nous refusons à considérer l’aspect spiralé comme un signe de dégénérescence ; c’est pour nous, au contraire, la caractéristique structurale du Sp. icterohemorragiæ aussi bien dans les cultures que dans les parenchymes organiques. Si on tenait à établir une différence entre ces deux espèces de formes, peut-être conviendrait-il de la chercher dans l’activité et la mobilité qui nous ont paru moindres in vitro que dans l’organisme animal. Mais nous devons noter que, pour Cesa- Bianchi les Spirochètes des cultures sont animés de mouvements plus rapides que ceux qu’on observe in vivo. Ces divergences tiennent peut-être à certaines conditions de cultures, à leur âge notamment.

B. En dehors de la forme spiralée qui nous est bien connue, les cultures ne tardent pas à présenter de nouveaux éléments : a , des formes longues ; h , des amas sphéroïdaux; c, des formes à spires relâchées (fig. 4) ; c/, des corpuscules globuleux.

a. Sous le terme de formes longues, nous désignons des Spirochètes dont la taille atteint couramment le double des dimensions habituelles ; parfois, ceux-ci présentent en leur milieu l’image d’une sphère réfringente (pl. Il); nous ne saurions affirmer qu’il s’agit d’une formation réelle et non point d’un simple jeu de lumière; nous nous bornerons à

(1) Il s’agit ici, bien entendu, des formes jeunes et non point des anciens éléments qui ont servi à l’ensemencement.

LA SPIROCHÉTOSE

indiquer que la microphotographie corrobore l’impression visuelle directe et que les images ultramicroscopiques concordent avec celles fourniespar les frottis colorés ou nitrates. Quelle que soit la signification à attribuer définitivement à la sphérule en question, un fait est certain, c’est que celle-ci figure une sorte d'axe autour de laquelle les deux segments décrivent des mouvements indépendants. Pendant fort longtemps, nous avons suivi à l’ultramicroscope les formes longues dans l'espoir de surprendre la division transversale du parasite, mais, malgré des examens répétés, notre attente fut déçue. Nous avions à peu près renoncé à constater le phénomène en question lorsque, inopinément, il se réalisa devant nous ; depuis lors nous l’observons avec une grande fréquence ; le tout est d examiner les tubes au moment favorable, cette scission paraissant s’opérer par poussées.

b. Les amas, dont il a été fait mention précédemment, sont irrégulièrement sphériques ; ils peuvent atteindre des dimensions assez considérables que nous ne saurions préciser faute d’appareil de mensuration applicable à l’ultra microscope ; pour fixer les idées nous admettrons que leur diamètre peut atteindre une cinquantaine de \x ; ils sont constitués (pl. I, 2) par des Spirochètes si étroitement enchevêtrés qu’ils se confondent en une masse compacte dans laquelle on ne saurait plus discerner les filaments spiralés caractéristiques; mais, à la périphérie, un certain nombre de microorganismes émergent du noyau et sont animés de mouvements actifs : ils sont très facilement reconnaissables à leur structure.

Pendant une quinzaine de jours au moins, souvent pendant un laps de temps plus considérable, on est assuré de retrouver dans les cultures des formes spiralées répondant au schéma précédent. Mais, à certains moments, on y constate la présence de deux sortes d’éléments qui restent à décrire.

c. La première catégorie est représentée par des filaments encore spiralés, mais qui diffèrent nettement de la forme

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habituelle (fig. 4) : la spirale fine et serrée, qui est l’attribut essenliel de cette dernière, s’est détendue et revêt l’aspect d’un grossier ressort dont le pas s’est considérablement accru; dans quelques cas même, l’apparence est celle d’une

Fig. 4. — Formes diverses du Sp. icterohemorragiæ observées dans une culture âgée. (Dessin légèrement schématisé, à l’ultramicroscope, par le Dr J. Bablet.)

étroile bande de papier qu’on aurait frisée au couteau. Il est à noter que ces deux dernières figures ne s’observent que dans les cultures âgées; il est donc à supposer qu'il s’agit d'une forme de dégénérescence, que des transitions insensibles relient, d’ailleurs, au type normal. Plus ou moins longtemps

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après l’apparition de ces Spirochètes à spires relâchées, les cultures commencent à s’appauvrir progressivement : les microorganismes deviennent moins mobiles, granuleux; ils se pelotonnent sur eux-mêmes, se fragmentent et finalement disparaissent. C’est la mort par sénescence; ultérieurement, nous apprendrons à connaître un autre mode de destruction, la lyse (p. 47).

cl. La dernière catégorie d’éléments est de beaucoup plus énigmatique et, sans préjuger de leur signification, nous devons nous borner à quelques faits d’observation; ceux-ci peuvent se résumer brièvement : à certaines phases de la culture, en particulier, au début, avant l’apparition des formes typiques et, à la fin, postérieurement à la disparition de ces dernières, le milieu renferme des corpuscules arrondis, approximativement de la taille d’un Staphylocoque, par conséquent plus volumineux que les globules en suspension dans tous les sérums; jusqu’à présent, nous n’avons pu constater aucune relation entre ces formations (1) et les Spirochètes proprement dits; mais, étant donnée notre ignorance complète de leur nature, nous signalerons ici les faits suivants bien qu’ils ne soient point démonstratifs : si, avec un milieu de culture renfermant uniquement des corpuscules globoïdes, on ensemence un nouveau tube, on peut y voir apparaître des formes spiralées ; d’autre part, soumettons à 37° une culture riche en Spirochètes typiques, obtenue à 29-30°; au bout d’un certain nombre de jours, ces derniers disparaissent et on n’observe plus que des corpuscules globuleux; si on maintient ensuite la culture à la température de + 29-30°, au bout de quelques jours, on assiste à la réapparition des formes à hélice. Si nous rappelons ces constatations, ce n’est pas que nous nous méprenons sur leur manque de .valeur probante : en effet, on ne saurait affirmer que quel-

(1) La destruction des Spirochètes peut aboutir également à la formation des corpuscules arrondis; mais on ne saurait les confondre avec les globules envisagés ici.

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ques rares Spirochètes spiralés, échappés à un examen ultramicroscopique môme attentif, ne suffisent pas pour perpétuer la souche. Mais nos observations complètent celles effectuées par H. Reiter et Ranime. Suivant ces auteurs, l’épanouissement des cultures se produit entre la deuxième et la troisième semaine; le déclin ne tarde guère; alors apparaissent des corpuscules arrondis, colorables pour le mélange de Giemsa, dérivés des nodosités ou des bourgeons que présenteraient certains Spirochètes et qui seraient peut-être assimilables à des formes latentes, à des spores. Enfin, H. Huebener et Reiter retrouveraient ces dernières dans les cadavres des animaux spirochétosiques et se demandent si elles ne représenteraient pas alors des formes sexuelles (?).

§ 3. Virulence des cultures. — En somme, les cultures permettent la conservation d’une forme principale qui, morphologiquement, ne diffère pas de celle qui vit au sein des parenchymes organiques. Mais alors qu’au point de vue structural, le Spirochète ne présente pas de modifications sensibles, sa virulence subit le plus souvent des variations manifestes. Tous les auteurs, qui ont entretenu des cultures pendant quelque temps, déclarent que celles-ci deviennent progressivement de moins en moins nocives pour le Cobaye; toutefois, les chiffres ne concordent pas.

Pour notre part, voici ce que nous avons constaté : au début, 0,5 cm3 de culture infectait à coup sur le Cobaye; après un certain nombre de réensemencemenls, pour obtenir ce résultat, il fallait inoculer 1 cm3; au bout de quatre à cinq mois, nombre de Cobayes résistaient à 1 et 2 cm3 ; enfin, 5 cm3 d’une culture provenant d’une souche isolée depuis un an tuaient la plupart des Cobayes, mais la mort survenait au bout d’une quinzaine de jours et, à la nécropsie, on ne constatait ni parasite ni ictère, mais simplement quelques hémorragies discrètes au niveau de l’épididyme et des ganglions cruraux.

§ 4. Résultats fournis par les cultures. — De l’ensemble des faits relatifs à la culture du Sp. icterohemorragiæ se

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dégagent plusieurs notions : au cours de son évolution, ce microorganisme revêt probablement diverses formes; dans certaines conditions, il paraît se réduire à des corpuscules sphériques; sous son aspect typique, il est constitué par une hélice, surtout appréciable sur l’organisme vivant, exempt des déformations et des empâtements que provoquent les étalements et les réactifs. Au début, les spires sont remarquablement serrées; par conséquent, la structure hélicoïdale est plus difficilement perceptible et c’est vraisemblablement la raison qui la fait nier par certains auteurs; au fur et à mesure que les générations se succèdent, le pas de l’hélice s’accroît progressivement; celle-ci devient donc plus apparente et elle est alors admise par presque tous les auteurs. D’autre part, la virulence du Sp. icterohemorragiæ , cultivé dans le milieu de sérum de Lapin-eau physiologique, s’atténue dans un laps de temps qu’on ne saurait préciser, mais qui est assez court.

SECTION III