C. Réaction des immunisines

D. Séro-diagnostic par agglutination .

En présence d’un malade suspect de spirochétose ictérohémorragique, voici notre conduite : 1° quelle que soit l’époque de la maladie, nous prélevons du sang pour le séro-diagnostic ; si ce dernier est négatif, nous renouvelons cette épreuve de 2 en 2 ou de 3 en 3 jours, jusqu’à la fin du troisième septénaire; 2° si l’infection n’a pas dépassé la première semaine, nous inoculons du sang au Cobaye ; 3° du début du deuxième septénaire à la fin du quatrième, nous inoculons les urines au même animal; 4° pendant le même laps de temps, mais plus spécialement du 13e au 23e jour de la maladie, nous recherchons extemporanément le Sp. icterohemorragiæ dans les urines ; 5° à partir du 15e jour et indéfiniment ensuite, à titre de contrôle, nous pratiquons, en outre, la réaction des immunisines; 6° dans le cas de réaction méningée, nous recherchons le parasite dans le liquide céphalo-rachidien à l’ultramicroscope et sur frottis, ainsi que par inoculation au Cobaye (3).

A. Mise en évidence extemporanée des Spirochètes soit dans Vitrine , soit dans le liquide céphalo-rachidien (4). — Dès les premiers cas observés, nous avons montré qu’il était possible, dans la pratique médicale, de déceler la présence du microorganisme d’Inada et Ido dans les urines des

(1) Nous avons déjà indiqué, p. 56 et 191, les raisons pour lesquelles la réaction de fixation du complément n’est guère utilisable en clinique.

(2) Pour ces diverses opérations, voir, en outre, p. 17, 56, 99 et 191.

(3) Voir ci-dessus, p. 147, les recherches de S. Costa et J. Troisier.

(4) Dans le sang, les Spirochètes sont trop rares pour que l’examen extemporané puisse fournir des résultats utilisables en clinique.

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malades. A la suite de celte constatation, M. Favre et N. Fiessinger ont généralisé la méthode et en ont réglé minutieusement la technique. Renvoyant, pour divers détails, le lecteur à la première parlie, p. 22, nous indiquerons simplement ici le procédé qui nous paraît le mieux adapté aux besoins de la clinique.

Aux moments opportuns, burine est prélevée le plus proprement possible, de façon à éviter, dans la mesure possible,

(Cliché communiqué par le Dr N. Fiessinger.)

Fig. 26. — Spirochètes saprophytes du méat de l’Homme.

les souillures par les Bactéries banales et par les Spirochètes du gland et de l’urètre antérieur : le sondage est avantageux: 250 cm3, 500 cm3 si c’est nécessaire, sont centrifugés à grande vitesse, en additionnant les culots (1).

(1) En l’absence de centrifugeuse, et dans ce cas seulement, on recourra au procédé à la ligroïne de P. -P. Lévy et J. de Léobardy : - Concentration des Spirochètes. — Utiliser de grands et longs tubes, qui

permettent d agir sur une centaine de centimètres cubes d’urine, h oi moler celle-ci à 1 avance, pour éviter la fragmentation des Spirochètes pendant la manipulation. Verser dans l’urine fraîchement recueillie du formol à 40 °/0, dans la proportion de 5 à 6 cm3 pour 100 cm3 d’urine. Agiter, attendre ensuite deux à cinq minutes. Verser dans le fond du tube environ 6 cm3 d’alcool à 95°, puis 40 à 50 cm3 d’urine formolée, renverser trois fois pour mélanger. Verser, à la surlace du tube, la ligroïne sur une épaisseur de 2 à 3 millimètres; bouc ici arec un bouchon de liège. Il doit rester un espace d’air d’environ Y1 * ? centimètres de hauteur. Agiter violemment, pendant une minute,

*'t abandonner le tube verticalement, sur la table. Tl v a avants à l’v

t relèvement de l émulsion. — Le mieux est d’opérer avec une pipette 4 ^ros calll,re> sectionnée franchement, montée sur un tube de

— Le mieux est d’opérer avec une pipette e franchement, montée sur un tube de

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Les examens se pratiquent soit entre lame et lamelle à l ultj-amicroscope, soit sur frottis traités par les méthodes de Fontana-Tribondeau ou de Ravaut-Ponselle, exposées antérieurement.

En raison de son peu d’abondance habituelle, la recherche du Sp. icterohemorragiæ , sur fond noir et surtout sur préparations nitratées, est en général longue et fastidieuse et un résultat négatif ne comporte guère de signification. D’autre part, à l’ultramicroscope des images artificielles peuvent, à première vue tout au moins, en imposer pour le microorganisme d’Inada et Ido ; certaines urines sanglantes fourmillent de filaments spiralés, mobiles, offrant une ressemblance

(Cliché communiqué par le Dr N. Fiessinger.)

Fig. 27. — Spirochètes saprophytes dans Furine.

frappante avec des Spirochètes. Cependant, l’abondance de ces formations, leurs relations avec les hématies, certains détails de structure empêchent d’assimiler ces images à des microbes véritables et les épreuves de contrôle (nitration notamment) établissent finalement que ces figures sont simplement le résultat de l’hémolyse des hématies par l’urine.

caoutchouc muni d’un embout de verre, qu’on tient entre les dents. Procéder par aspirations mesurées, faibles et courtes, de l’émulsion, le tube étant bien vertical et la pointe de la pipette en contact avec la surface interne du tube. Sous le contrôle de l’œil, avec un peu d habitude, on arrivera très vite à saisir l’émulsion, et l’émulsion seulement, alors qu’au début on attire toujours dans l’effilure un peu du liquide sous-jacent, faute à éviter. L’émulsion recueillie est versée dans un verre de montre.

Étalements. — Les étalements seront pratiquée sur des lames dont la surface aura été flambée à haute température et refroidie. On y dépose III gouttes de l’émulsion sur lesquelles on verse II à III gouttes d’alcool absolu. Avec la partie effilée de la pipette, posée à plat sur la lame perpendiculairement à l’axe de celle-ci, par vaœt-vient, on étale régulièrement ce mélange, où se détruisent, en un clin d œil, lessphérules de l’émulsion. On dessèche ensuite la lame à 37° et on la traite par le procédé de Fontana-Tribondeau.

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D’autre part, la morphologie des microorganismes en question n’est pas assez tranchée pour permettre une identification rigoureuse de diverses espèces saprophytes (fig. 26 et 27) et de certaines formes pathogènes.

Le sondage, après lavage soigneux du méat et de la région avoisinante et miction partielle préalable, permet d’éliminer

Fig. 28. — Sp. icierohemorragiæ dans le culot de centrifugation de l’urine.

(Méthode de Fontana-Tribondeau.)

la majeure partie des germes banaux; cependant, en dépit de ces précautions, un examen soigné et prolongé peut en déceler quelques -uns. La différenciation du Sp. icterohemorragiæ et du Sp. pettiti Fiessinger (1) est plus délicate encore. Bien que la conformation ne soit pas identique, les caractères morphologiques sont insuffisants pour résoudre la

(i) ^°lr à ce sujet les publications de Manine, Cristau et Plazv, de A. Netter et M. Salanier, de N. Fiessinger et de A. Pettit.

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question (comparer les figures 28 et 29, exécutées exactement dans les mêmes conditions à tous points de vue) : le Sp. pettiti est plus long, moins trapu, ses ondulations sont plus irrégulières, plus accusées et plus lâches. En revanche, le Cobaye est pratiquement réfractaire vis-à-vis de ce microorganisme et le sérum des malades qui le présentent ne ren-

Fig. 29. — Sp. pettiti dans le culot de centrifugation de l’urine. (Méthode de Fontana-Tribondeau.)

ferme ni immunisine, ni agglutinine, ni lysine pour le Sp. icterohemorragiæ .

La recherche du Spirochète dans le liquide céphalo-rachidien se pratique dans les mêmes conditions que pour l'urine mais avec plus de facilité, en raison de la pureté de cette sécrétion.

En résumé, dans certains cas, l’examen sur fond noir et l’observation des frottis permettent de déceler des Spi-

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rochètes mais la spécification de ceux-ci est actuellement impossible ; pour combler cette lacune, il faut recourir à d’autres techniques, en particulier aux réactions du sérum.

Les résultats négatifs n’ont pas de portée.

B. Inoculation du sang , de V urine et du liquide céphalorachidien au Cobaye. — Suivant la phase de la maladie, deux Cobayes reçoivent chacun par voie sous-cutanée, soit 5 cm3 de sang, soit 0,5-1 cm3 du culot de centrifugation de l’urine en suspension dans 4 cm* de ce liquide.

Pour la sécrétion céphalo-rachidienne, on inocule, également sous la peau, la totalité des produits centrifugés, repris dans 4-5 cm3 de cette sécrétion.

Les animaux injectés sont, suivis pendant au moins un mois. Dans les cas positifs, ils succombent avec des lésions ictérohémorragiques. Les surrénales, le foie et les reins renferment des Spirochètes facilement constatables, en général, à Fultramicroscope. Si le parasite n’est pas décelable, on fait un nouveau passage par Cobaye. (Voir, en outre, la maladie chez le "Cobaye, p. 99 et suivantes).

C. Réaction des immunisines. — Cette réaction a une haute valeur démonstrative ; elle n’est applicable qu’à partir du quinzième jour de la spirochétose; on la pratique de la façon suivante (voir, en outre, p. 190) : mettre en contact, in vitro , pendant 15 minutes, une dose de virus un grand nombre de fois mortelle respectivement avec 1 et 2 cm3 du sérum à expérimenter; inoculer les deux mélanges à deux Cobayes et faire un témoin ; suivre les animaux pendant 20 jours au moins. Le témoin succombe ictérohémorragique ; dans le cas où Je sérum a été prélevé chez un sujet atteint de spirochétose ictérohémorragique, les animaux d’épreuve survivent.

D. Séro-diagnostic. — Après avoir mis en évidence les propriétés agglutinantes du sérum sanguin chez les sujets iniectés par le Sp. icterohemorragiæ , nous nous sommes préoccupés d appliquer la séro-réaction de F. Widal au diagnostic de la spirochétose humaine.

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Technique. — La conduite de l’opération est calquée sur le procédé actuellement classique dans les laboratoires (1). Dans une série de cinq petits tubes à essais, on dépose 1 cm3 d’une dilution dans l’eau physiologique à 1/25, 1/50, 1/125, 1/250, 1/500 du sérum à essayer. Ceci fait, on ajoute uniformément dans chaque tube 1 cm3 d’une culture de Sp. icterohemorragiæ ; un sixième tube témoin renferme un mélange de culture et d’eau physiologique.

Pour les cultures, on utilise le milieu sérum de Lapin-eau physiologique, dont l’ensemencement remonte à 6-8 jours environ; au moyen de l'ultramicroscope, on s’assure qu’elles sont suffisamment riches : plus les Spirochètes sont abondants, plus nets seront les résultats; d’autre part, on élimine autant que possible celles qui renferment des agglomérations de microorganismes, ce qui ne se produit, en général, qu’assez tardivement ; comme on le verra plus loin, la présence des amas en question ne peut d’ailleurs pas prêter à confusion.

L’agglutination se produit assezrapidement ; entre 15°et 18°, il convient de la rechercher au bout d’une heure et demie environ ; une température plus élevée (37° par exemple) l’active ; enfin, elle persiste pendant plusieurs heures. Exceptionnellement, lorsque les cultures sont extrêmement abondantes, l’agglutination est appréciable h l’œil nu ; dans la pratique, l’emploi de l’ultramicroscope est nécessaire pour juger des résultats ; l’examen s’effectue de la façon habituelle, entre lame et lamelle rigoureusement propres . Les cas positifs se reconnaissent aisément : au lieu de se trouver à peu près isolés, de se mouvoir plus ou moins librement, les Spirochètes sont agglomérés par faisceaux et par amas assez volumineux ; ces derniers sont particulièrement significatifs : ce sont de petits sphéroïdes irréguliers, d’aspect granuleux, desquels émergent des microorganismes plus ou moins altérés, présentant des contorsions. Il faut noter, en effet,

(1) Il va de soi que toutes les manipulations sont effectuées aseptiquement.

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que les sérums doués d’un pouvoir agglutinant jouissent en même temps de propriétés spirochétolytiques; il en résulte une action défavorable sur la vitalité des microorganismes, se traduisant par une atténuation de la réfringence, par un aspect blanchâtre et granuleux, par un effilochement de la forme et même par la fragmentation du filament spiralé en de minuscules globules. En d’autres termes, l’agglutination est doublée d’une lyse.

Ce dernier phénomène est important au point de vue du séro-diagnostic ; il permet, en effet, de différencier les agglomérations de Spirochètes, formées spontanément dans le milieu de culture, des amas provoqués par le sérum agglutinant. Dans les premières, les microorganismes sont normalement constitués et doués de mouvements actifs ; dans les seconds, Je noyau central est granuleux et les Spirochètes qui en émergent se meuvent plus ou moins lentement et sont le siège des altérations lyiiques sus-indiquées.

Résultats. — Autant qu’une expérience prolongée pendant un an permet d’en juger, les résultats fournis par la séroréaction appliquée à la spirochétose ictérohémorragique humaine peuvent être tenus comme concluants au point de vue clinique. Jusqu’à ce jour, nous n’avons pas observé de sérums humains normaux agglutinant le Sp. icterohemorra- (jiæ et les sérums syphilitiques ne se comportent pas différemment (1) ; d autre part, les séro-réactions positives ont toutes trouvé leur confirmation dans plusieurs des faits suivants : évolution clinique ultérieure, spirochéturie, inoculation au Cobaye, réaction des immunisines.

Chez les malades infectés par le microorganisme d’Inada et Ido depuis une dizaine de jours, le sérum renferme des agglutinines dont l’action, en général, est manifeste à la dilution de 1/500; fréquemment, le taux atteint le 1/1.000, hu ^ peut même dépasser. La période, au cours de laquelle

M ^ous n avons pas pu essayer, à ce point de vue, de sérums de malades atteints d’autres spirochétoses.

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ces phénomènes sont observables, mérite d’être précisée autant que faire se peut. En ce qui concerne l’apparition du pouvoir agglutinant nous nous bornerons, sans rien préjuger, à l’indication suivante : le séro-diagnostic positif le plus précoce, que nous avons effectué jusqu’à ce jour, est relatif à un malade du Dr Denéchau, parvenu au sixième jour de sa spirochétose; c’est en vain que jusqu’ici nous avons recherché à une date plus précoce cette réaction chez des sujets chez lesquels celle-ci est par la suite devenue positive. Au contraire, le laps de temps, pendant lequel les agglutinines persistent dans le sang des spirochétosiques, est très prolongé; nous ne saurions actuellement le limiter: nous devons nous contenter de citer le cas du Dr G. L... (1), dont le sérum est encore agglutinant à plus de 1/1.000 au bout de vingt-deux mois.

Dans la pratique, nous procédons de la façon suivante : nous recherchons la séro-réaction dès que la sémiologie en pose l’indication et, au cas de résultat négatif, nous renouvelons cette épreuve, à intervalles de 2 à 3 jours; il est inutile de dépasser le troisième septénaire à partir du début de la maladie; vers cette époque, en effet, les agglutinines ne semblent jamais faire défaut chez les patients atteints de spirochétose ictérohémorragique authentique.

En dépit du temps nécessaire à la constitution du pouvoir agglutinant, le séro-diagnostic nous apparaît actuellement comme le procédé réunissant, au point de vue clinique, le plus d’avantages : simplicité, rapidité, valeur probante. En •effet, la constatation de la spirochéturie est assez aléatoire ; en second lieu, elle est souvent assez tardive ; enfin, elle ne permet pas la détermination spécifique (forme pathogène ou saprophyte) du microorganisme observé. D’autre part, l’inoculation au Cobaye, dont la valeur démonstrative dans les cas positifs est incontestable, nécessite des animaux plus ou moins faciles à se procurer, et susceptibles de succomber à des infections banales ; en dehors du temps nécessaire à

(1) Voir son observation, p. 224.

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l’apparition des Spirochètes dans le sang, puis dans l’urine du malade, il faut tenir compte de la durée de l’évolution de la maladie (1) chez ce Rongeur (10 à 12 jours en moyenne, parfois quatre semaines) ; en outre, les conditions nécessaires à la transmission expérimentale du virus de l’homme au Cobaye sont loin de se trouver toujours réalisées (2). Enfin, la recherche des immunisines, dont la signification est indiscutable, n’est guère applicable qu’au delà du quinzième jour à partir du début de la maladie humaine et comporte plusieurs des inconvénients déjà signalés à propos de l’inoculation.

En somme, au point de vue pratique, le séro-diagnostic, malgré ses avantages sur les autres procédés, présente l’inconvénient d’être relativement tardif; en revanche, il est applicable aux convalescents de toute date et même aux anciens spirochétosiques guéris depuis un laps de temps considérable. Enfin, cette réaction peut être effectuée loin du malade, avec du sérum recueilli depuis plusieurs semaines, ainsi que le prouve, entre autres, l’observation suivante : des échantillons de sang sont prélevés, en Champagne, les 18 et 27 septembre 1917, sur deux spirochétosiques authentiques, par le D1 2’ Sacquépée ; le séro-diagnostic, pratiqué à Paris le 6 janvier 1918, est positif au delà du 1/500 pour les deux malades. '