TECHNIQUES EMPLOYÉES

3. Purification des oxypurines. — [/hypoxanthine employée provenait pour la plus grande part d’un échantillon de ce corps préparé par E. FISCHER et dont une fraction avait servi à la détermination de la chaleur de combustion. J'ai également utilisé une certaine quantité d’hypoxanthine préparée par Mile LE BRETON.

La xanthine, du laboratoire Hoffmann Laroche, a été purifiée par la méthode indiquée par BiLrz et BECK.

Environ 20 grammes de xanthine sont dissous dans 300 cm* d’acide azotique à 30 %. La solution, après décoloration par du charbon, est laissée pendant 3-4 jours à la température de la chambre. Entre temps, la xanthine cristallise. On filtre et on lave bien les cristaux avec de l’eau.

L’acide urique, provenant de la même maison, a été dissous jusqu’à la saturation dans une solution 10-—%M de soude ; la solution a été décolorée complètement par du charbon et l’acide urique précipité avec l’acide chlorhydrique.

L’azote de l’hypoxanthine, de la xanthine et de l’acide urique, ainsi purifiés, a été dosé par micro-Dumas dans le laboratoire de M. le professeur NicLoux à Strasbourg.

Le tableau suivant indique les résultats obtenus :

Pourcentage Pourcentage Pourcentage de N pour de N pour théorique de N substance gardée la substance avant 24 heures à l’exsiccateur la dessiccation HYDOXADIDINES eee ete 41 ,1 | 40,5 40,6 DANS nee at 36,84 36,7 36,6 35,7 AO AUTIQUE RE 30,95 31,4 31,45 30,6 30,5

Les substances ont été séchées, dans l’exsiccateur, pendant 24 heures à la pression et à la température ordinaires.

4. La xanthinedéshydrase. —— La xanthinedéshydrase, grâce aux travaux de l’école de Hopkins et de WieLANpD, est la déshydrase la mieux étudiée. Elle a été découverte et extraite du lait pour la première fois par MoRGAN, StEWART et Hopxixs (1!) ; depuis lors diverses tentatives ont été faites pour la purifier.

Pour préparer la xanthinedeshydrase, j'ai utilisé la méthode de Dixon et THURLOW (5) modifiée par Dixon et Konama Ch: |

SUR L'ÉQUILBRE D'OXYDORÉDUCTION DES OXYPURINES 13

D’après cette méthode trois litres de lait frais sont chauffés à 380 C. et mélangés avec 15 à 20 cm° de présure. Le mélange est abandonné pendant 30 minutes environ dans un thermostat toujours à 380 C.; au bout de ce temps il se forme un coagulat ; on le divise avec une baguette et à l’aide d’une passoire on sépare le petit lait.

Le petit lait, ainsi obtenu, est mélangé avec un volume égal d’une solution saturée à 380 C. de sulfate d’ammonium.

Il se forme un précipité abondant et très léger, qui se rassemble rapidement en une couche superficielle. On siphonne le liquide et le précipité est transporté sur du papier filtre et séché aussi bien que possible ; le produit sec est mis dans une capsule et trituré avec de l’éther pour en extraire les graisses. On dessèche dans le vide. On obtient environ 15 grammes d’une poudre blanche.

Il est important de faire cette préparation rapidement et de sécher vite la déshydrase pour empêcher l’oxydation par lair.

Dixon et KopamaA purifient ensuite la déshydrase par des adsorptions successives sur du charbon et du kaolin. Nous n’avons pas eu recours à cette purification parce que l’activité et la pureté de notre première préparation s’est toujours montrée suffisante pour nos expériences.

5. Technique des déterminations des potentiels. — Les mesures électrométriques ont été effectuées dans deux types différents de cellules, les unes constituées par des tubes de Thunberg, modifiés pour servir à la mesure électrométrique, comme ont déjà fait

Borsook et ScHoTT (?), les autres par des piles à pont LL capillaire de WurMser et GELOso (*). | a) Tubes de Borsook. — Un tube à essai, muni

d’un diverticule, est fermé par un bouchon rodé et prolongé à sa partie inférieure par un capillaire. Le bouchon est traversé par deux tubes minces, dont les extrémités atteignent presque le fond du tube de Thunberg et portent des électrodes de platine. Le bouchon est, en outre, percé d’un trou communiquant

avec une tubulure latérale, par laquelle on peut effec-

tuer le vide. Quant au capillaire, il est rempli d’un mé- Fig: 2. lange d’agar à 3 % dans une solution de KCI saturée à Tube de Thunberg-Borsook.

400 C. et il est plongé dans un tube à essai, dont Île diamètre est environ deux fois plus grand que le diamètre extérieur du capillaire.rempli, lui aussi, avec le même mélange d’agar et de KCI (fig. 2).

Le remplissage du capillaire et du tube à essai est effectué à 959 C. Après refroidissement, l’agar du capillaire, protégé par l’agar du tube à essai, constitue un pont conducteur, suffisamment résistant à la pression extérieure. L'ensemble constitué par le capillaire et le tube à essai est alors plongé dans une solution de KCI, saturée, en communication avec une électrode de calomel saturée.

Les tubes sont maintenus dans un thermostat à eau à 380.

Les mesures de force électromotrice sont effectuées suivant la technique

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usuelle d'opposition, à l’aide d’un potentiomètre ‘et d'un électromètre eapillaire, permettant de mesurer une F. E. M. de 0,001 volt.

b) Puiles de Wurmser et Geloso. — Ges piles closes de WuRMSER et'GELOSO sont constituées de deux tubes en verre À et B, reliés par un capillaire (fig. 3).

Dans ces piles, les mélanges électroactifs ne viennent plus en contact avec de l’agar-agar. :

En eete’,il y a deux électrodes en platine. Dans'un de ces tubes À, on met le mélange dont on veut détermi ner le potentiel, dans l’autre tube B on introduit les constituants d’une électrode de référence de potentiel constant.

Le passage du courant est assuré par lélectrolyte fixé sur la surface interne du tube À «et du capillaire. Pour que la résistance de cette couche ne soit pas trop forte, il est nécessaire d'utiliser pour la construction de l'appareil ‘un cristal facilement attaquable. Le ‘cristal Martin donne les meilleurs résultats. Afin que le courant ne passe pas entre e ét e’ par l'extérieur du tube, on enduit l’appareil extérieurement, en f et g avec un iso- Jant comme le ciment de Khotinski.

Les mesures de potentiel sont effectuées entre e et e' au moyen d’un électromètre à ‘triode.

Fig. 3. — Pile de La résistance de ces piles a été mesurée par la mé- PHARES CUEUERES, thode très commode, indiquée par R. AUDUBERT (), ‘en comptant le nombre d’éclairs d’une lampe au néon reliée

aux bornes d’un condensateur. Lie condensateur est chargé à travers la résistance à mesurer R au moyen d’un potentiomètre. La période d’allumage T ‘est

reliée à la capacité C du condensateur par la relation :

nn. Vo —Y T = CR log pe V, étant le potentiel d'allumage de la lampe, V, celui d'extinction et V, le potentiel appliqué. La résistance de ces piles varie de 10 mégohms à 30 mégohms quand la molarité du tampon et du KCI de l'élément au calomel varie de 1 M à 0,05 M. |

Thermostais. — Toutes les expériences, sauf celles destinées à la mesure:du coefficient de température, ont été effectuées à 380 + 0,1. Le thermostat à ieau servant aux mesures en tubes de Borsook est constitué par une large cuve rectangulaire renfermant à chaque extrémité une résistance chauffante contenue dans une boîte métallique. L’agitation est réalisée au moyen d’un balancier muni à sa partie inférieure d'une large palette. On peut placer dans 6e ‘thermostat un grand nombre d’électrodes à la fois.

Les tubes Taunsera-Bonsook étaient plongés dans des gros tubes à essai fixés tout le long du thermostat et remplis avec une solution saturée de-chlorure

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de potassium. Un thermorégulateur à mercure et toluène maintient la température à 380 C + 0,1.

Pour les piles closes de Wurmser et GeLoso, on ne peut utiliser un thermostat à eau à cause de l'isolement nécessaire aux mesures d’éléments à très haute résistance. J’ai employé une étuve à air chauffée électriquement.

Les mesures de potentiel étaient faites dans l’étuve même qui était mise à la terre et dans laquelle on faisait pénétrer un fil sous plomb directement réuni à la grille de la lampe électrométrique.

©) Mesure du pH. — Le pH des solutions a été mesuré à la température de 380, avec l’électrode d'hydrogène à la fin de chaque expérience et dans les.

tubes mêmes qui ont servi aux mesures de Ex, afin d’éliminer le potentiel de:diffusion.