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cipité laissé sur le filtre avec une solution saturée de sulfate d’ammoniaque.
re méthode. — Pour la suite des opérations, tant que j'ai employé le premier procédé pour la préparation du milieu de culture, j'ai dissous dans l’eau le précipité resté sur le filtre ; éliminé autant que possible le sulfate d’ammoniaque dans un courant d’eau pendant une quinzaine d'heures. Le liquide du dialyseur était ensuite concentré dans le vide en présence de l'acide sulfurique, puis précipité par l'alcool fort. Le précipité était lavé à l'alcool absolu, puis séché.
2e méthode. — Quand le milieu de culture a été préparé par le deuxième procédé, j'ai séparé la plus grande partie du sulfate d'ammoniaque du précipité resté sur le filtre, en le traitant par de la glycérine en quantité aussi faible que possible. Après deux jours de contact, le liquide glycérique était décanté, puis je remettais un peu de glycérine pour laver les corps non dissous et je décantais de nouveau. Il se dissout bien ainsi un peu de sulfate d’ammoniaque, mais en quantité minime; et les doses qu'on en inoculerait ainsi aux animaux ne sont nullement toxiques par elles-mêmes. On peut d’ailleurs diminuer encore cette quantité de sulfate en mettant la solution de glycérine pendant quelque temps dans un dialyseur. Ceci fait, la liqueur est mise au contact de #4 fois son volume d’alcool fort. Le précipité ainsi obtenu est filtré, lavé à l’alcool absolu, puis à l’éther, et enfin desséché dans le vide. On peut recommencer plusieurs fois cette suite d'opérations en redissolvant le précipité dans un peu de glycérine.
Cultures à 36°. — À cette température, la baciéridie pousse assez bien dans la solution de peptone. La culture y est abandonnée à elle-même pendant une dizaine de jours, puis elle sert à l'extraction de la toxine sèche.
J’ai finalement unejpoudre grisätre, assez soluble dans l’eau : la solution aqueuse est neutre aux réactifs colorés.
La solubilité dans l’eau de cette substance est beaucoup diminuée, si, lors de sa préparation, ce corps n’a pas été bien desséché par l'alcool, puis lavé à l’éther. On a alors une matière cornée assez adhérente au filtre et très peu soluble dans l’eau.
Qu'elle soit préparée par la première ou la seconde méthode, :
Parts.
la solution aqueuse de cette substance pulvéruleute, inoculée à des lapins, s’est montrée toxique à des doses supérieures à 80 milligrammes par kilogramme d'animal. Mais en l’employant, je n'ai pas pu réussir à immuniser, complètement, des animaux contre le charbon. .
En faisant la culture dans des ballons Fernbach, j'ai obtenu des cultures plus abondantes. Celles-ci, traitées de la même manière, ausbout de 6 jours donnaient une poudre d'aspect extérieur semblable à celui de l’autre substance, mais elle n’était pas toxique.
Dans ce même milieu de culture, j'ai aussi fait pousser à cette température de la bactéridie asporogène préparée par la méthode de M. le D' E. Roux ‘, rendue très virulente par des passages
successifs de lapin à lapin. Les ballons de culture étaient ense-
mencés avec le sang d’un animal que cette bactéridie venait de tuer en une trentaine d'heures. La culture de la variété asporôgène se fait également assez bien dans ce milieu et à cette température de 36°. On retire de ces cultures un corps ayant des propriétés semblables à celles de la substance fournie par les cultures du charbon à spores.
A cette température, la culture de la bactéridie, dans ce milieu, donne donc un produit ayant des propriétés Loxiques. Cette loxicilé n’est toutefois pas bien grande, et les résullats que j'ai obtenus ainsi ne m'ont pas semblé suffisamment nets.
Cultures à 20°. — Les ballons, étant remplis au tiers de leur volume avec la solution de peptone, sont ensemencés de la même façon avec du sang d’un lapin mort du charbon en moins de trente heures. Puis ils sont mis pendant deux jours à l’étuve à 36° pour hâter le début du développement de la culture. Après ce temps, ils sont portés dans une étuve dont la température est voisine de 20°. À cette température, la bactéridie pousse très lentement dans ce milieu, les cultures y sont toujours grêles, d'aspect chétif. Avec la bactéridie asporogène, les cultures y sont encore moins abondantes qu'avec le charbon à spores.
Étant donné ce peu de rapidité du développement, j'abandonnais la culture à elle-même environ quinze jours à cette
4.E. Roux, Bactéridie charbonneuse asporogène. (Annales Institut Pasteur, LIN, 1890, p. 25.)
température. Puis le liquide de culture filtré était traité pour en extraire la toxine sèche.
Finalement, on retire ainsi une substance amorphe pulvérulente de couleur brun foncé. L Elle renferme encore ume petite quantité de sulfate d’ammoniaque, mais les expériences que j'ai faites sur les animaux avec
des quantités plus grandes de ce sel m'ont montré que la présence … #
de ce sulfate ne pouvait pas changer les résultats. ‘
Le sulfate d'ammoniaque étant mis à part, cette poudre ne laisse par calcination qu'une quantité de cendres insignifiante, correspondant à moins de 0,2 pour cent.
Ainsi que cela a été fait pour des corps d’origine analogue, et pour ne rien préjuger sur la nature chimique de ce produit,
je lui donnerai dans la suite de ce travail le nom de toxine, nom.
qui est en rapport avec ses propriétés physiologiques comme on
le verra ultérieurement.
Cette toxine, bien desséchée par les opérations qui termine
sa préparation, est soluble dans l’eau. Elle est également soluble
dans l’eau phéniquée à 1 0/0. Elle est insoluble dans le chloroforme.
La solution aqueuse est neutre aux réactifs colorés. L'addition de sel marin, puis d’acide acétique, ne produit ni trouble, ni précipité d'aucune sorte dans la solution aqueuse. L'acide azotique, à froid ou à l’ébullition, étendu ou concentré, ne donne ni précipité ni coloration jauné.
Le ferrocyanure et l’acide acétique ne donnent pas davantage Fa
de précipité.
L’acide pyrogallique est également sans action.
Laréaction de Piotrowski, ou du biuret, donne une coloration nettement bleue, dès que l’on met dans la solution additionnée de potasse quelques gouttes de LA solution très étendue de sulfate de cuivre.
Avec l'acide chlorhydrique concentré et bouillant, on n'a aucune coloration violet bleu.
Mélangée avec une solution de chlorure d’or à 41/1000 et portée à l’ébullition, cette toxine ne donne, par l'addition de quelques gouttes d'acide formique, aucune des colorations rose puis rouge pourpre que donnent les substances albuminoïdes dans ces mêmes conditions.
Au contact du mélange d’un volume d'acide sulfurique concentré et de deux volumes d’acide acétique cristallisable, cette toxine ne donne pas de coloration violette, même si on chauffe: (Réaction d'Adamkiewiez.)
En faisant bouillir la solution de toxine avec le réactif de Millon, on n’a ni précipité rouge, ni coloration rouge du liquide.
L'iodure double de potassium et de mercure, l’iodure ioduré de potassium, l'acide picrique ne donnent pas de précipité.
Par ce qui précède, on voit que, sauf la réaction du biuret qui est identique à celle donnée par les substances albuminoïdes, cette toxine ne donne aucune des réactions Considérées comme caractéristiques des propeptones, peplones et matières albuminoïdes.
En outre, l'absence de réaction avec l’iodure double de potassium et de mercure, l'acide picrique, semble indiquer que cette substance ne contient pas non plus d’alcaloïde.
Le chlorure d’or à l’ébullition est en partie réduit par la toxine. L
Portée quelque temps à l’ébullition avec du chlorure de platine, la solution reste limpide; mais il se produit par refroidissement un léger précipité. Pour cette réaction, l’ammoniaque avait été soigneusement éliminée de la solution de toxine.
Le mode de préparation de cette substance étant le même que celui employé pour isoler les diastases excrétées par les cellules, j'ai recherché si la toxine avait quelque action diastasique, soit par elle-même, soit par un mélange avec une diastase entraînée avec elle.
On sait que la bactéridie pousse sur l’empois d’amidon en le saccharifiant. Dans ces conditions, il y a production d’amylase par le microbe. Mais ici, le phénomène ne s’arrête pas à la transformation de l’amidon en dextrine et en maltose. La bactéridie continue à se développer aux dépens des matériaux ainsi formés, donnant lieu à une production d’acides. Si la culture se fait dans un empois préalablement additionné de carbonate de chaux, les acides se combinent avec la chaux au fur et à mesure de leur production et on trouve finalement dans le milieu de culture de l’acétate de chaux.
J'ai mis la toxine au contact d’un empois d’amidon à 3 0/0 dans une étuve réglée à 60°. L’amidon n’était pas liquéfié après
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plusieurs heures, et cela avec des quantilés de toxine qui se sont élevées jusqu'à 50 milligrammes. Il en a été de même aux températures de 50° et de 38°.
Dans ces recherches sur les actions diastasiques de la toxine, je me servais de la substance extraite des cultures sans que celles-ci eussent été filtrées sur porcelaine. D'ailleurs, pour les cultures faites avec la bactéridie asporogène, cette filtration est inutile. Les microbes sont tués par l'addition de chloroforme ou d'essence de moutarde, puis les cultures sont filtrées sur papier.
Cette toxine a été mise aussi, à ces mêmes températures de 38°, 50° et. 60°, au contact de solutions de sucre de canne. Trois heures après le début de l'expérience, il n’y avait pas de changement dans la composition du liquide sucré.
La bactéridie pousse égalementbien dansles milieux glycogénés sans production de glucose, d’après M. Roger‘. Cette absence de glucose ou de sucre dans le milieu de culture tient à la faible quantité de glycogène employée par M. Roger dans ses milieux. On à, en effet, avec le glycogène, des faits analogues à ceux que l’on a avec l’empois d’amidon. Par suite du développement
de la bactéridie, au bout de très peu de temps les sucres primi-
tivement formés sont transformés en acides.
A ces mêmes températures de 38°, 50° et 60°, je mets, pendant des temps plus ou moins longs, le mélange des solutions de glycogène et de toxine. À la fin de l’opération, la quantité de glycogène n'avait pas varié.
Je n’ai pas réussi non plus à mettre en évidence, dans le sang des animaux meurant du charbon, quelque propriété saccharifiante sur l’empois d’amidon.
Le sang des animaux charbonneux ne contient pas davantage une substance capable de détruire le glycogène dans les solutions aqueuses de ce corps. Pour le montrer, je mets dans’ deux vases des volumes égaux d’une même solution de glycogène. Chacun d'eux reçoit ensuite des quantités égales du même sang charbonneux et quelques gouttes d'essence de moutarde. L'un de ces vases, le premier, est porté dans une étuve à 50°, pendant que je dose le glycogène contenu dans le second par le procédé de
1. H. Rocer, Sur les variations de la glycogénie dans l'infection charbonneuse (Compte rendu Acad. sciences, 9 octobre 1893, p. 489), — H. Rocer, Recherches sur les variations de la glycogénie dans l'infection charbonneuse (Archives de physiologie normale et pathologique, XXNI, 1894, p. 64).
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Landwehr :. Le même procédé de dosage appliqué à la fin de l'expérience au premier récipient donne pour celui-ci des quanütés de glycogène sensiblement égales à celles du second.
La disparition plus ou moins complète du glycogène dans le foie des animaux succombant à l'infection charbonneuse ne paraïlrait donc pas tenir à la présence dans leur sang d’une substance capable de tranformer le glycogène in vitro.
La toxine charbonneuse n’a aucune action liquéfiante sur la gélatine.
En résumé, j'ai obtenu un corps ne présentant aucune des réactions des matières albuminoïdes, peptones, propeptones, alcaloïdes. Ce corps n’exerce aucune action saccharifiante sur l’empois d’amidon et le glycogène. Il est sans action sur les solutions sucrées. Il ne liquéfie pas la gélatine. Par conséquent jusqu ici nous nous trouvons en présence d’une substance qui ne possède aucune des propriétés chimiques que peuvent présenter les produits microbiens analogues. Mais les animaux auxquels on l’inocule réagissent, et à ce point de vue cette toxine agit comme les corps similaires.
