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matine acide et à l’état de cyanohémoglobine en utilisant comme étalon une solution titrée de ces mêmes composés.

4° Celle de Joyer et LAFFONT [61], rappelant la première, sauf par l’étalon qui n’est plus une solution d’oxyhémoglobine, mais une lame de verre coloré à faces parallèles de teinte et d'épaisseur appropriées.

5° Les deux méthodes de MaLAssez: la première [81], simple amélioration pratique de celle de JoLyET et LAFFONT réalisée par l’utilisation d’un appareïllage adapté, la seconde [82], copie de la précédente dont elle ne diffère que par l'adoption comme étalon d’un verre coloré prismatique, donc d’épaisseur variable.

6° Celle de FLEIscHL-MIESCHER, analogue à la première méthode de MArassez, mais dans laquelle lhémoglobine est dosée à l’état d’hématine alcaline dont la teinte rouge est plus intense que celle de l’oxyhémoglobine, les dilutions du sang s’y faisant non plus avec de l’eau distillée mais avec une solution de carbonate de sodium à 1 pour mille. :

7° Enfin, celle de NEWCOMER [91], du même type que celle de FLEISCHL-MIESCHER, l’hémoglobine étant ici dosée par l'intermédiaire de l’hématine acide.

De toutes ces méthodes, seules les premières remplissent la condition théorique dont la satisfaction est indispensable à l'emploi correct de la colorimétrie. En effet, dans les suivantes, on se sert comme étalon de verres colorés (15), alors qu’il s’agit de doser des solutions d’oxyhémoglobine, d’hématine alcaline, ou d’hématine acide; dans ces condi-

(5) Verres dont la correspondance en oxyhémoglobine, en hématine alcaline, ou en hématine acide a été établie au préalable empiriquement.

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ions, on ne peut rien présumer de l'importance des erreurs relatives correspondant à l'utilisation, parfaitement arbitraire, de tels étalons, et en fait, ces erreurs sont souvent assez notables surtout lorsqu'on a affaire à des verres prismatiques, donc intervenant sous une épaisseur variable.

Au contraire, avec les premières méthodes — dans lesquelles l’étalon et le liquide coloré étudié sont des solutions d’un même dérivé de l’hémoglobine dans un même solvant (16) — on peut satisfaire à toutes les conditions du dosage colorimétrique parfait. Ces méthodes ne sont cependant pas meilleures que les autres, car la rapidité d’altération tant des solutions d’oxyhémoglobine (17), que des soluticns de carboxyhémoglobine, d’hématine alcaline, ou de cyanohémoglobine, ne permet pas d'obtenir constamment des résultats précis. Il en serait autrement si l’on préparait extemporanément la solution titrée étalon du dérivé de l’hémoglobine utilisé avant chaque série de mesures; malheureusement, la préparation de ces solutions titrées est longue et comporte d’ailleurs l’étalonnage de chacune d’elles au moyen d’une autre méthode de dosage du chromoprotéide sanguin; quant à l’obtention directe de telles solutions, elle serait encore plus ardue et ne pourrait se faire aisément qu’en hiver, notamment dans le cas de l’oxyhémoglobine (LAMBLING [70 |) ; aussi, cette dernière façon d’opérer est très difficilement réalisable.

Pour toutes ces raisons, les méthodes colorimétriques de dosage de l’hémoglobine sont, comme les chromoscopiques, à délaisser chaque fois qu’une certaine précision devient nécessaire.

(16) Les dilutions de sang employées pouvant largement être assimilées à des dilutions de son élément hémoglobinique seul. (17) Rapidité d’altération déjà rappelée page 22.

es

Ces méthodes sont basées sur les propriétés du spectre

Méthodes spectroscopiques.

d'absorption de l’oxyhémoglobine.

Les principales sont:

1° La méthode de PREYER [104], dans laquelle on examine d’abord le spectre du sang étudié sur une dilution dans l’eau distillée telle que toutes les raditions du spectre, sauf une partie des radiations rouges, soient encore absorbées; on poursuit ensuite la dilution, sans interrompre lexamen spectroscopique, jusqu’au moment où le spectre s’enrichit de quelques radiations vertes, moment où l’on note dans quelles proportions le sang se trouve étendu. Ceci fait, on répète ces observations, toutes choses égales, avec une solution titrée étalon d’oxyhémoglobine; la concentration en (HbO?)* des diverses dilutions correspondant à Fapparition du vert étant la même, il est facile d’en déduire l’hémoglobinémie cherchée.

2° La méthode de LESSER [75], dans laquelle on produit simultanément et selon des conditions identiques deux spectres superposés, le premier correspondant à une solution titrée étalon d’oxyhémoglobine, et le second, à une dilution du sang étudié dans l’eau distillée; ici encore, cette dilution, d’abord peu poussée, est poursuivie jusqu’à ce que la largeur des bandes d'absorption homonymes des deux spectres devienne identique; la dilution sanguine et la solution étalon ont alors même titre en oxyhémoglobine, d’où les résultats. |

3° Enfin, la méthode de HENOCQUE [48], qui consiste à déterminer l’épaisseur sous laquelle le sang étudié donne, dans des conditions bien fixées, le spectre de l’oxyhémoglobine dent les deux bandes d’absorption et la bande intermédiaire sont égales. De la valeur obtenue, on déduit

immédiatement l’hémoglobinémie cherchée grâce à une table empirique dressée une fois pour toutes par l'examen, daus les mêmes conditions et surtout avec la même intensité lumineuse, d’une série de solutions titrées d’oxyhémoglobine.

L'observation des divers indices sur lesquels reposent les methodes ci-dessus est très sujette à erreur, qu’il s’agisse de l'apparition du vert dans un spectre ou de la formation de bandes d'absorption, bandes dont les bords sont toujours confus; on ne peut par conséquent songer à obtenir une grande précision lorsqu'on dose spectroscopiquement l’hé- .moglobine.

Ces dosages présentent d’ailleurs une autre cause d’erreur qui suffirait déjà à leur enlever toute exactitude ; en effet, les uns (PREYER et LESSER) nécessitent une comparaison à une solution étalon d’oxyhémoglobine, comparaison dont nous avons déjà rappelé l'inconvénient (18), tandis que les autres (HENOCQUE) ont recours à une intensité lumineuse bien définie qu’il est, en pratique, toujours difficile de réaliser.

En résumé, les méthodes spectroscopiques de dosage de l’hémoglobine sont encore des méthodes peu précises, leur précision ne dépassant pas, notamment, celle des méthodes chromoscopiques; aussi, leur importance est bien minime, et leur emploi se limite, presque à celui de la plus simple d’entre elles, celle de HENOCQUE.

(18) Pages 22 et 27.

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D. -— Méthodes spectrophotométriques.

Imaginées par BUuNSEN et Roscoë [15], puis élevées au rang de méthodes générales d’analyse par VIERORDT [138] qui le premier les utilisa, les méthodes de ce groupe ont depuis été très souvent employées dans le dosage des corps colorés en solution.

Ces méthodes sont basées sur les mêmes lois que les colorimétriques et s’appliquent pareillement à des solutions de corps colorés dans un solvant incolore identique. Par suite, on a, ici encore, la relation de BEER-LAMBERT (19) :

il 3 NUIIC

Les dosages spectrophotométriques proprement dits consistent à établir la concentration c des solutions étudiées à l’aide de cette relation en opérant sous une épaisseur 1 constante (20). Dans ce but, on place ces solutions dans des cuves de largeur égale à 1 et l’on détermine une fois pour toutes les coefficients K relatifs à la longueur d’onde À de la radiation utilisée et aux divers corps colorés à doser; il suffit

(19) Dans laquelle, nous l’avons vu (page 23), I et I représentent les intensités incidente et réfractée d’une radiation de longueur d’onde À traversant une solution d’un corps coloré d’épaisseur 1, c étant la concentration du corps dissous et K le coefficient d'absorption caractéristique de ce corps et de À.

(20) Les concentrations c peuvent encore s'établir en opérant à extinction constante et sous une épaisseur variable, ce qui constitue la spectrocolorimétrie. Les méthodes de dosage correspondantes n’ayant pas été appliquées au chromoprotéide sanguin, il n’en sera pas question dans ce travail; ces méthodes n’ont d’ailleurs aucune supériorité sur les colorimétriques (BAUDOUIN et BE- NARD [6]), surtout dans le rouge et le violet (CANALS et (CABA- NES [191]).

alors de mesurer la valeur des rapports —, ce qui constitue

de simples mesures photométriques, pour pouvoir calculer

les concentrations ec cherchées. Quant à la détermination des coefficients K, on la fait en appliquant l'équation (1) à des solutions de concentration € connue de chacun des corps colorés considérés, ce qui revient aussi à mesurer la

valeur de rapports —

PE Comme en colorimétrie, la relation (1) n’est exacte que

dans le cas d’une lumière incidente [, monochromatique ; mais, alors que pratiquement les mesures colorimétriques pouvaient être faites en lumière blanche, il importe, au contraire, ici d'adopter une longueur d’onde À convenable (21) et de s’en tenir toujours exactement à cette longueur d’onde car les coefficients K diffèrent généralement beaucoup selon les À. C’est d’ailleurs pour pouvoir faire aisément les déterminations photométriques dans une plage spectrale très limitée et de longueur d’onde moyenne égale à la longueur d'onde voulue que l’on a recouru à la spectrophotométrie dans la présente application des lois de LAMBERT et de BEER.

Pour réaliser une mesure spectrophotométrique, on disperse un faisceau dé iumière blanche par réfraction à travers un prisme et l’on fait traverser à une moitié du fais-

(21) Une valeur élevée du rapport d'absorption facilitant les mesures spectrophotométriques, cette longueur d’onde est toujours celle qui correspond au plus élevé des coefficients K relatifs au corps coloré à doser.

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éeau réfracté l’épaisseur 1 employée (22) de la solution étudiée: on obtient ainsi deux demi-spectres S et S, (juxtaposés ou superposés selon les spectrophotomètres) qui ont, dans la région correspondant à la longueur d’onde À adoptée, I et I, comme intensités lumineuses respectives; dès lors, la comparaison photométrique de S et S, dans cette région

: I donne la valeur du rapport — cherchée. Pour faire cette Lo

comparaison photométrique, on atténue l'intensité I, jusqu’à ce qu’elle égale I et l’on établit l'expression de I en fonction de I, d’après la grandeur de cette atténuation. C’est par les moyens imaginés pour réaliser latténuation de I, que diffèrent surtout les méthodes de dosage spectrophotométriques et les spectrophotomètres qu’elles utilisent. Dans les plus anciennes, et notamment dans celle de VIE- RORDT [138], on a recours au rétrécissement de la demi-fente du collimateur dont S, dérive; mais, cette façon de faire est peu recommandable car elle donne deux demi-spectres de pureté différente, d’où difficilement comparables; aussi, certains appareils permettent de substituer à ce rétrécissement un réglage par volets mobiles, bien préférable. Dans quelques méthodes postérieures, comme celle de Govi, on opère simplement selon la loi fondamentale de la photométrie (23), ce qui aboutit à des appareils peu pratiques. Enfin, dans les autres méthodes et,en particulier,dans celles

(22) Cette épaisseur est souvent de 1 em.; il est toutefois préférable, dans chaque catégorie de dosages, de choisir pour 1 une valeur telle que les intensités transmises, I, au cours des diverses mesures (la mesure d’étallonnage y compris) ne varient si possible qu'entre 0,15 et 0,6 I (selon les observations de MOREL) [85]).

(23) C'est-à-dire, d’après la loi suivante: Les intensités lumineuses varient en raison inverse du carré de la distance.

de HürnER [55], Crova [22], TRaunIN [130], Gouy [39], BranLy [12], etc. I, est atténuée par polarisation, moyen de beaucoup le meilleur.

L'emploi de la spectrophotométrie a depuis longtemps été étendu au dosage du chromoprotéide sanguin, notamment par VIERORDT [138], BrRanzy [13], de SAINT-MARTIN [115], WiczramMson [141], PoNDER [103], DENES [23], etc.

Pratiquement, c’est toujours sur l’oxyhémoglobine que portent ici les dosages, les liquides soumis aux mesures étant des solutions des sangs étudiés dans l’eau distillée (24) ; aussi, on utilise de préférence une longueur d’onde À comprise entre 5770 et 5890 À, ces deux valeurs délimitant la plus forte bande d'absorption du spectre de l’oxyhémoglobine.

Les dosages spectrophotométriques de l’oxyhémoglobine nécessitent au préalable un étalonnage et un réglage minutieux du spectrophotomètre utilisé, ainsi que la détermination précise du coefficient K correspondant à l’oxyhémoglobine et à la longueur d’onde À choisie (25). Pour déterminer ces coefficients, il faut disposer d’une solution d’oxyhémoglobine de titre convenable et exactement connu, solution dont la préparation s'impose, par conséquent, en premier lieu; ici, pour plus de précision, ces solutions sont toujours directement réalisées à partir d’oxyhémoglobine cristallisée, ce qui est, nous l’avons vu (page 27), très ardu.

En définitive, on ne peut donc doser spectrophotométriquement l’oxyhémoglobine qu'après avoir effectué une série

(24) Solutions dont le taux de dilution se situe vers 1/175, valeur la plus appropriée (LAMBLING [70)]).

(25) Plus exactement, il est évident que c’est seulement du coefficient moyen correspondant à la plage spectrale À + d x qu'il s’agit ici.