CHAPITRE II

Dosage du sucre du sang.

On a proposé un grand nombre de méthodes de dosage du sucre dans le sang; nous ne citerons que les principales, et décrirons seulement d'une façon complète la méthode de Cl. Bernard, à laquelle nous proposons une modification.

La plus simple et la plus anciennement employée consiste à recevoir le sang dans de Teau bouillante acidifiée ; le coagulum est épuisé, puis exprimé dans un linge, ou sous une presse. Le liquide ainsi obtenu n^est jamais suf^samment clair pour permettre de doser de faibles quantités de sucre à Taide de la liqueur de Fehling. On ne doit pas le clarifier, comme l'ont fait Ambrosiani ainsi que Mac Grégor, avec du blanc d'œuf , celui-ci contenant du sucre; l'emploi du noir animal n"est pas meilleur,

— -2S — attendu qu'il retient un peu de glucose, comme l'a reconnu Cl. Bernard,

Le procédé qui consiste à traiter le sang par de Talcool est un des plus recommandés et des meilleurs ; mais, il se compose de manipulations longues et compliquées, qui rendent ce procédé très laborieux dès qu'il faut faire simultanément un grand nombre d'expériences comparatives.

Le dosage du sucre du sang par la fermentation alcoolique ne présente pas une précision suffisante ; déplus, on trouve toujours, comme l'a montré Seegen, lo à 20 0/0 de sucre en moins que par les liqueurs titrées.

Seegen, dans ses nombreuses recherches, s'est servi du procédé imaginé par Schmidt-Mùhlheim et Hofmeister: le sang, renfermé dans une capsule de porcelaine, est additionné de 8 à 10 vol. d'eau ; quand la température commence à s'élever, on ajoute d'abord une solution de perchlorure de fer, puis de l'acétate de soude, de façon à obtenir un coagulum dense et un liquide limpide comme de l'eau.

Après expression à la presse, le résidu est épuisé par l'eau ; les liquides sont ensuite mélangés et évaporés au bain-marie à un volume déterminé, après quoi, on filtre et on dose le sucre par la liqueur cupropotassique.

Par cette dernière méthode, Seegen, a trouvé généralement un peu plus de sucre que Cl. Bernard ; cela provient, comme nous le verrons plus tard, de ce que \q. ferment glycolytique contenu dans le sang, est dilué avant la chauffe, et, par suite, comme son

action est beaucoup diminuée, la perte de sucre qui se produit quand on élève la température est presque nulle. Malheureusement les opérations sont longues, et rendent ce procé^ peu pratique.

Cl. Bernard, en i855, a eu le grand mérite de donner un procédé commode et rapide pour le dosage du sucre du sang; c'est cette méthode que nous avons suivie, après lui avoir fait subir un perfectionnement dont on comprendra l'importance.

Voici le manuel opératoire tel qu'il est décrit par Cl. Bernard :

(( Pour doser le sucre dans le sang, nous recevons 2d gr. de sang dans une capsule tarée; on ajoute 25 gr. de sulfate de soude en petits cristaux (i), ce qui fait en tout 5o gr. ; on mélange et Ton place le tout sur la flamme du gaz ou de la lampe à alcool. Par la cuisson, il se produit un coagiiliim d'abord rutilant, puis noir spongieux mêlé à un liquide plus ou moins abondant. Il faut alors, comme Tévaporation a fait perdre pendant la cuisson une certaine quantité de liquide, rétablir le poids primitif en ajoutant une quantité suffisante d'eau distillée. On peut alors filtrer ou exprimer, et c'est dans le liquide ainsi obtenu que Ton dose le sucre. »

Cl. Bernard s'est assuré que les urates, qui réduisent la liqueur cupro -potassique, sont retenus dans le caillot sanguin. Le chloroforme, qui peut se

''i) Et quatre à cinq gouttes d"acide ace'tique, dit-il plus loin.

trouver dans le sang des animaux anesthésiés, est complètement volatilisé, et ne donne pas de réduction de la liqueur de Fehling.

L'emploi du sulfate de soude est nécessaire et suffisant pour obtenir un liquide où les réactions ainsi que le dosage du sucre se font avec une grande facilité; on peut même le faire fermenter, parce que le sulfate de soude n'empêche pas la levure de bière d'agir. En outre, si Ton veut obtenir le sucre du sang en nature on pourra précipiter les eaux-mères après cristallisation du sulfate de soude par l'alcool, en ayant soin de refroidir le mélange ; le sulfate de soude sera précipité, et le sucre restera dans le liquide que Ton séparera par filtration.

Pour doser le sucre dans le liquide clair ainsi obtenu, on verse celui-ci dans une pipette de Mohr légèrement chauffée, surtout en hiver, pour éviter la cristallisation du sulfate de soude. Cette pipette est terminée à la partie inférieure par un tube de caoutchouc sur lequel est appliquée une pince à pression continue, de préférence une pince à vis, ce qui permet un écoulement plus régulier; le liquide auquel la pince laisse passage s'écoule par un tube de verre effilé.

Dans un ballon de verre, on verse i ce. de liqueur cupro-potassique titrée; on y ajoute i5 à 20 ce. d'une solution concentrée et récente de soude ou de potasse (i),ou bien, comme cela a été indiqué plus tard.

(i) Cl. Bernard indique de se servir de la lessive des savonniers.

12 a i5 pastilles de potasse avec 20 ce d'eau, pour empêcher la précipitation de Toxydule qui se dissout dans la soude ou la potasse. On feritfe le ballon avec un bouchon à deux trous; dans l'un de ceux-ci entre à frottement le tube d'écoulement de la pipette; dans l'autre est placé un tube de verre recourbé, destiné à donner issue à la vapeur d'eau qui se dégagera pendant l'ébullition, et muni à son extrémité d'un tube de caoutchouc sur lequel on applique une pince à pression après avoir cessé de chauflFer, afin de pouvoir fermer ce tube et maintenir le ballon vide d'air, quand on aura chassé celui-ci par l'ébullition.

Le liquide étant introduit dans la pipette, on note la division de la pipette où s'arrête le niveau supérieur du liquide, on chaulîe à l'ébullition la liqueur de Fehlinor et la soude contenues dans le ballon. Quand l'ébullition se produit, on laisse couler le liquide sucré d'abord en un petit filets puis goutte à goutte à mesure que l'on approche de la fin de la réaction.

Voici ce qui se produit : le sucre contenu dans le liquide de la pipette réduit et décolore la liqueur de Fehling; grâce à la soude ou la potasse, l'oxydule de cuivre reste en dissolution, et la coloration se fait sans précipitation. Cet oxydule étant très oxydable, on est obligé d'opérer absolument à l'abri de l'air.

Par conséquent, on doit s'arrêter de verser la solution sucrée dès que la décoloration est complète, et ne pas dépasser ce point, ce dont on serait averti par une coloration jaune. Mais, pratiquement, les liqueurs étant très étendues, il faut une certaine habi-

— 3-2 — tadc Dour iu..cr du moment où la décoloration est Ift: irr eela, 1. est bon de p.aeer e autre côté du ballon une feuille de pap.er blanc ^ertcao de sorte qu il est plus facile de juger du moment précis où les dernières traces de bleu ont d.sparu.

Comme on a employé > ce. de liqueur debehUng titrée à o,oo5, on en conclut que les „ cent.m. cubes contiennent 5 miUigr. de glucose; d faut donc deduire à combien de grammes correspondent ces « ce de liquide. Or, Cl. Bernard a fa.t voir par de nombreuses e.xpériences, vérifiées plus tard pa M.Dastre,que 25 gr. de sang et ^5 gr- de sulfate de soude, traités de cette façon,donnent38cc^dehqu,d clair, et que par suite . ce. représente la 38epart,e du sang contenu dans 35 gr. de sang.

Si n ce. contiennent o,oo5 de sucre, . ce. en con-

o,oo5 , tient -^ ; donc .

o,oo5 ^ .,. OvLiKl

Mais, 38 ce. représentent 25 gr. de sang ; par suite la quantité contenue dans un kilogr. de sang (soit 40 fois plus) sera représentée par :

0,190 ^,^Zi^

IToù la teneur pour 1000 du sang en sucre :

— oo —

Telle est la formule générale qui nous permettra d'évaluer la quantité absolue de sucre contenu dans i,ooo gr. de sang. ''

Bien que pour le dosage du sucre la liqueur de Fehling soit incomparablement plus sensible que le polarimètre ou la fermentation, on peut désirer d'augmenter encore sa sensibilité. En faisant des essais dans cet ordre d'idées, nous nous sommes aperçu d'abord que la liqueur des savonniers, dont se servait Cl. Bernard, laisse déposer quelquefois par une ébullition prolongée, un peu de peroxyde de fer ; quand on emploie une solution de soude ou de potasse trop concentrée, la liqueur se colore en vert, puis en jaune ce qui rend la coloration très incertaine, le liquide passantdu bleu au vert, puis au jaune sans transition marquée. Ces difficultés d'analyse se présentent, comme nous l'avons remarqué, lorsque nous avons eu à doser le sucre dans des sangs très pauvres, ou bien dans des expériences d'asphyxie, ou encore quand on agitait le sang avec de l'acide carbonique, et surtout lorsque le sang avait été mélangé d'eau pendant quelque temps.

A la suite d'un grand nombre d'essais divers, nous avons vu qu'il'est préférable d'ajouter à la liqueur de Fehling, au lieu d'une solution concentrée de soude ou de potasse, seulement 5 à 6 ce. dune solution récente et claire de soude caustique à lo p. loo, puis 40 à 5o ce. d'eau distillée; cette concentration est suffisante : l'oxydule reste en solution grâce à la soude caustique ainsi qu'au sulfate de soude; on peut aussi remplacer la solution de soude caustique par

4 ou 5 pastilles de potasse. Cependant, avec quelques sangs diabétiques, très riches en sucre, nous avons dû ajouter quelquefois, pour éviter une très faible précipitation qui se produit à la fin du dosage, 7 à 8 ce. de solution de soude à 10 p. 100, ou 7 à 8 pastilles de potasse. C'est en opérant de cette façon que Ton aura le maximun de sensibilité.

Cl. Bernard employait pour la liqueur cupro-potassique dont il se servait, la formule donnée par Fehling; nous lui préférons celle de Pasteur, qui se conserve plus longtemps, sans donner de précipité d'oxydule.

On peut remplacer la liqueur de Fehling par la solution de Knapp. Celle-ci s'obtient en dissolvant 10 gr. de cyanure de mercure et 100 gr. de lessive de soude de densité 1,14 et étendant au litre, 40 ce. sont réduits par o gr. 5 de glucose. On procède comme avec la liqueur cupro-potassique.

La méthode de Cl. Bernard a un avantage, qui n'a peut-être pas été assez apprécié, c'est que pour connaître la teneur du sang en sucre on n'a pas besoin de pratiquer l'opération longue et fastidieuse, qui consiste à épuiser le coagulum.

Il est regrettable que l'avantage de n'être pas dans l'obligation d'épuiser le coagulum soit quelquefois compensé par un inconvénient assez sérieux qui enlève à la méthode un peu de son exactitude. Il résulte, en effet, des recherches de plusieurs de nos prédécesseurs (voir l'historique), et de nos propres recherches, que dans le cas où le coagulum est très condensé^ cest-à-dire où la partie fixe du sang est

plus considérable qu"à l'état normal, le liquide est relativement trop chargé de sucre. On a ainsi une erreur en plus, en j'aleur absolue, qui, dans certains cas est, assez notable.

D'autre part, avec la méthode Cl. Bernard, on a toujours une erreur en moins, qui, d'après nos expériences, déjà fort nombreuses, peut, avec certains sangs, s'élever à i/io au moins. Heureusement, cette erreur que ni Cl. Bernard, ni aucun des auteurs qui depuis se sont occupés de la question, n'avaient soupçonnée, peut être parfaitement évitée à laide d'un perfectionnement très simple.

Quelle est la cause de cette erreur? Elle tient à ce que Xeferment glycoly tique du sang, détruit, jP(?;/c/c7/7/ la chauffe, une certaine quantité de sucre.

C'est ce que l'expérience prouve. Dans deux capsules, on met 40 gr. de sulfate de soude, et l'on verse 40 gr. de sang, puis 20 gouttes d'acide acétique (i;; l'une de ces capsules étant chauffée sur un très fort bec Bunsen, l'opération est terminée en 3 minutes; l'autre capsule est chauffée , en même temps, sur une flamme de bec Bunsen équivalente à une forte lampe à alcool; il faut environ 9 minutes pour la terminer. Or, en faisant le dosage du sucre, nous avons obtenu, pour les quantités du glucose les résultats suivants : ,

Sacre o/"° Sucre "/. Perte •"/,

Sang chauffé rapidement 0,86 100 »

Sang chauffé lentement 0,78 90,6 9,4

(i) Nous avons reconnu que la quantité indiquée par Cl. Bernard n'est pas suffisante.

Ainsi, un chauffage lent détruit 9, 4 de sucre en plus, qu'un chauffage relativement rapide; mais, il ne faut pas croire que même avec un bec de Bunsen très fort, la perte soitinsignifiante. Sion compare, en effet, le chiffre du sucre obtenu par un chauffage rapide à celui que Ton trouve en faisant tomber le sang dans du sulfate de soude préalablement chauffé au-dessus de 800, la température à laquelle le ferment est détruit étant 53-340, comme nous le verrons plus tard, on trouve encore un déficit de quelques centièmes par la première méthode; il faut donc une chauffe en quelque sorte instantanée^ qui détruise le ferment avant qu'il ait eu le temps d'agir. Aussi avons-nous recommandé, M. le professeur Lépine et nous (i), de faire tomber le sang goutte à goutte dans le sulfate de soude à 80^ au moins^ et préalablement acidifié.

Si le sang est dé fibrine ^\q procédé est très simple : on chauffe dans une capsule tarée, un poids déterminé de sulfate de soude, par exemple 40 grammes, avec I gr. d'acide acétique; quand le sulfate de soude, fondu dans son eau de cristallisation, commence à bouillir, on verse très lentement 40 gr, de sang, pesés au préalable dans un ballon ; quand tout le sang a été versé, on lave le ballon avec un peu d'eau distillée que Ton ajoute dans la capsule; on porte sur Ja balance et l'on met de Tcau pour faire équilibre à la tare de la capsule augmentée du double du poids du sang, puis on filtre et on dose avec la liqueur de Fehlino-.

(1) Comptes-rendus du 23 juin 1890.

Ce procédé ne peut pas être employé pour doser le sucre du sang- au sortir d'un vaisseau, car, dans ce cas, on ne pourrait connaître exactement le poids du sang à cause de Tévaporation. Nous avons imaginé une disposition qui permet d'éviter cette dernière : dans un l'ase de Bohêjue conique, de iSo à loo ce., en verre mince, nous mettons 2 5 q-\\ de sulfate de soude et i gr. dacide acétique ; le récipient est fermé au moyen d'un bouchon de caoutchouc à deux trous, dans lun desquels passe un simple tube droit auquel on adaptera le tube de caoutchouc qui servira aie relier à la canule introduite dans le vaisseau; dans l'autre on a mis un tube recourbé deux fois et à plusieurs boules pour retenir la vapeur d'eau.

L'appareil est ensuite taré, puis plongé dans un bain-marie bouillant placé sur une table à côté de Tanimal; au bout de dix minutes, la canule est mise dans le vaisseau, on laisse perdre un peu de sang, et il suffit d'adapter le tube de caoutchouc au tube droit ; on laisse couler le sang lentement, pendant que l'on agite le vase de Bohème ; quand on juge qu'il y a environ 35 à 40 grammes de sang, on pince fortement le caoutchouc et on l'enlève ; le récipient est est laissé encore 5 à 6 minutes dans le bain-marie; on le laisse refroidir, on enlève le tube droit pour le laver, afin d'enlever le^ang qui est resté sur ses parois; on le sèche et on le met en place avant de porter l'appareil sur la balance; le poids qu'il faut ajouter pour rétablir l'équilibre donne celui du sang.

Il suffit ensuite de vider, dans une capsule, le contenu du vase de Bohème, de bien le laver avec de

Tcau en se servant d'un agitateur ; on ajoute ensuite dans la capsule un poids de sulfate de soude tel qu'avec les 25 grammes ajoutés avant, il y en ait autant que de sang ; on évapore Teau de lavage mise en excès jusqu'à ce qu'il y ait équilibre à la tare de la capsule augmentée du double du poids du sang.

Si nous avons choisi comme récipient un pase de Bohème conique en verre mince^ c'est que la forme est très-commode, d'abord pour mélanger le sang avec le sulfate de soude acidulé, par simple agitation; puis pour enlever, au moyen d'une baguette de verre, toutes les parcelles de caillot qui seraient restées adhérentes à la face interne de la paroi ; c'est ainsi que nous avons dû rejeter l'emploi de gros tubes en verre mince, dans lesquels le sang ne se mélangeait pas au sulfate de soude; les ballons ont le défaut de ne pouvoir être assez bien lavés. Le vase doit être en verre mince pour ne pas casser en le plongeant dans l'eau bouillante; aussi, ne doit-on pas se servir de poudriers.

On peut nous objecter qu'il doit se perdre de l'eau par évaporation, par dilatation et par expulsion de l'air au moment oii l'on introduit le sang.

L'appareil étant fermé par un bouchon muni de deux tubes de verres de diamètre assez petit, il ne peut pas y avoir évaporation. Calculons quel est le poids maximum de la vapeur d'eau entraînée par la dilatation ou par déplacement: à ioo° la dilatation est d'environ i/3, soit, au maximum, 3d ce. pour le volume de loo ce; en introduisant 40 ce. de sang, on déplace 40 ce. d'air, soit un total de yS ce.

Ces o' 073 d'air saturés d'eau à looo contiennent, og. o58 de vapeur d'eau, d'après la formule :