D.— LA QUESTION DES IONS H

Les liquides biologiques présentent chacun une réaction particulière liée à l'équilibre existant au sein de ces liquides entre les bases, Les acides et leurs sels.

Pour déterminer cette réaction, les chimistes n’ont connu pendant longtemps que la méthode zitrimétrique basée sur l'emploi de solutions titrées acides ou alcalines.

Mais les albuminoïdes contenus dans les liquides biologiques ont la propriété de fixer une certaine quantité d'acide ou d’alcal, et l'élément ainsi fixé ne joue plus aucun rôle dans les réactions de ces liquides. Seule, l'addition d’un acide (dans le cas d’un milieu alcalin), où d’une base (dans le cas d'un milieu acide), peut libérer ces éléments de la matière protéique qui les immobilise. C’est ce qui se produit quand on mesure la réaction des milieux albuminoïdes au moyen desolutions titrées.

Chaque albumimoïde ayant un pouvoir de fixation différent, la méthode titrimétrique mdique pour une même quantité d’élément libre actif des valeurs différentes d’acidité ou d’alcalinité, Suivant la composition du milieu, et les résultats ne sont pas comparables. :

Nous disposons de deux méthodes qui décèlent dans un

Dee

liquide les éléments acides ou alcalins libres et par conséquent actifs, à l’exclusion des éléments fixés par le milieu. L'une d'elles, la méthode é/ectrométrique, détermine la différence de potentiel entre deux électrodes plongeant dans le liquide examiné. Mais cette méthode est longue et complexe, et a l’inconvénient de nécessiter un appareillage électrique spécial.

Bien plus commode, est une seconde méthode, dûe à SoœŒREN- SEN, pour mesurer la réaction des milieux sans tomber dans l'erreur du procédé titrimétrique. C'est la méthode co/orimétrique ainsi nommée parce qu'elle utilise des séries de liquides appelés endicateurs qui changent de couleur pour un titre déterminé d’acidité ou d’alcalinité libre.

Cette dernière méthode est d’une technique rapide et commode. Nous allons en quelques lignes en décrire le principe et là technique.

1. LA CONCENTRATION EN 10NS 4. — La méthode colorimétrique permet de mesurer la concentration en ions hydrogène. Que signifie ce terme ?

Rappelons-nous d'abord, la tendance actuelle de réserver aux ions (atomes chargés d'électricité) le rôle essentiel dans les réactions biologiques. Les propriétés si caractéristiques de l’état colloïdal, état sous lequel se trouvent les liquides biologiques, paraissent liées à l'existence d'ions dans la micelle colloïdale. Or, la réaction des liquides dépend uniquement de la quantité d'ions libres. On devine tout l'intérêt d’une méthode qui substitue à l’ancienne notation moléculaire d’acide ou d’alcah la donnée plus exacte d'ion libre et actif.

Les acides et les bases n’agissentque par leurs ions libres. Ce fait est connu depuis les travaux d’Arrnévius (1887) sur la dissociation. Un acide est constitué schématiquement par un 1on métalloide (caractéristique de l'acide), et par un ou plusieurs ions H, ion commun à tous les acides. |

Pour chaque base, il existe, de la même façon, un ion métal spécifique, etun ou plusieurs ions OH communs à toutes

les bases.

L'élément spécifique, métalloïde ou métal, n'intervient pas dans le caractère acide ou alcalin. Les éléments H et OH, au contraire, par leur présence en plus ou moins grande quantité, déterminent la réaction plus ou moins acide, plus ou moins alcaline du liquide qui les renferme. En mesurant la quantité d'ions H ou OH libres dans une solution, on peut, par conséquent, mesurer exactement son titre acide ou alcalin. Nous voyons ainsi apparaitre le terme de concentration en ions (H ou OH).

Ces deux catégories d'ions H et OH existent toujours dans les liquides biologiques, parce que ces liquides sont des milieux aqueux, et que la dissociation de l’eau pure H°0 donne elle-même naissance aux deux catégories d'ions acide H, ee

bin OH + = H°20 == H + OH

S'iln’y a pas de substance étrangère dissoute dans cette eau pure, les ions H et OH se neutralisent exactement. Toute substance acide ou alcaline dissoute dans l’eau apportera au contraire des ions H ou OH en supplément et changera l'équilibre primitif.

Mais, pour toute solution aqueuse, il existe une relation fixe entre les quantités d'ions H ou OH à l’état libre dans le liquide. En effet, le produit des concentrations respectives de ces deux ions est une valeur constante :

concentr. H >< concentr. OH — K

Cette valeur fixe K est appelée constante de dissociation. L'équation ci-dessus, qui est en réalité un peu plus complexe, à été établie pour l'eau pure. Quand on dissout une substance acide ou alcaline dans cette eau et que l'équilibre des ions est modifié, cette équation demeure encore exacte, et le produit H >< OH est encore constant et égal à K. ;

Si l’on connait la valeur de K, et la concentration en ions H d’une solution, on peut done facilement calculer la concentration en ions OH, et réciproquement.

Or, on détermine la concentration en ions H avec plus d’exactitude et de commodité que la concentration en ions OH. Aussi, en pratique, définit-on la réaction d’un liquide par sa concen- - tration en ions H, même lorsqu'il s’agit d’une solution alcaline pour laquelle les ions OH sont prépondérantset semblent seuls intéressants. Il est toujours facile, en effet, de déduire cette dernière concentration lorsqu'on connaît la constante K et la concentration en ions H.

On a choisi comme unité de concentration en ions H la solution normale en 2on hydrogène, contenant un gramme d’hydrogène par litre (solution aqueuse).

Si nous avons une solution contenant par exemple : 0 gr. 001 d'hydrogène par litre, sa concentration mille fois plus petite que la concentration normale N, s’écrira 0,001. On désigne les concentrations en ions H par la lettre H :

On emploie souvent pour représenter la concentration en ions H un autre symbole dérivé du premier H, c’est /e symbole

pH (SœŒrENsEN, 1909).

Le symbôle H indique, comme nous l’avons vu, la concentra-

tion en ions H d'une solution quelconque par rapport à la solution normale N :

N = j9= et, comme N est égal à 1 :

Voici maintenant les raisons pour lesquelles on a dû changer cette notation. Supposons deux solutions de concentration 10-T et 10-%. La première est 10 fois plus concentrée que la deuxième. Essayons de choisir deux autres solutions quelconques de façon que la première soit encore 10 fois plus concentrée que la deuxième; par exemple des solutions de concentration 10-*, et 10-*. Ces deux groupes de solutions présentent

RAT ue

donc les mêmes différences de valeurs. Or, si nous voulons représenter ces quatre différentes concentrations sur un même graphique, nous nous heurtons à de grandes difficultés du fait que les deux premièressont mille fois plus petites que les deux dernières, et n'occuperont sur le graphique que des intervalles infimes si l'on ne veut pas donner aux deux dernières des valeurs représentatives démesurées. Rien ne pourra nous indiquer enfin que leurs différences de valeurs prises deux à deux sont équivalentes.

Le graphique représentant ces concentrationssera au contraire d'exécution facile et d'interprétation correcte si l'on remplace les valeurs absolues des concentrations par leur exposant 7 et 8, et 4 et 5. Cet exposant indique pratiquement le logarithme de l'inverse de la concentration en ions H.On le désigne par le symbole pH :

pH = 10e :

Cette notation a donc été établie simplement pour la commodité du calcul, etnon pas pour représenter une loi logarithmique. Ajoutons cependant, que par la méthode électrométrique, on

obtient directement cette valeur log de 6

IT. La méraope cocorimérrique. — Le principe de cette méthode est de colorer la solution à examiner au moyen de liquides spéciaux appelés indicateurs. En même temps, on colore de la même manière des liquides de comparaison dont la concentration est connue et se rapproche de la concentration supposée de la solution à titrer. En comparant les teintes, il est facile de trouver le liquide de comparaison ayant la même couleur c'est-à-dire la même concentration en ions H que la solution examinée.

Le matériel d'expérience se compose :

À. d’une série d'indicateurs,

B. d'une série de liquides étalons.

À. Les indicateurs. — Les indicateurs sont des bases ou des

acides polyatomiques dont la dissociation met en évidence des ions colorés. Ils présentent ainsi des colorations différentes suivant la concentration en ions H des milieux auxquels ils sont ajoutés. Par exemple, la solution de rouge de crésol, jaune pour les concentrations inférieures à pH — 7,2, est rouge vif pour les concentrations supérieures à pH == 8,8. Dans l'intervalle, la solution présente des colorations intermédiaires entre le Jaune et le rouge vif. D’où une gamme de teintes s'échelonnant pour les valeurs de pH comprises entre 7,2et8,8. Au moven de cette gamme de couleurs, il est facile de déterminer la concentration en ions H d’une solution dont la concentration exprimée en pH est comprise entre 7,2 et 8,8. Avec d'autres indicateurs dont les points de virage seront différents, nous pourrons déterminer les solutions dont la concentration est inférieure ou supérieure à ces valeurs.

Pour justifier le principe de la méthode colorimétrique, les indicateurs ne doivent être modifiés que par les ions libres. Les matières protéiques et les sels neutres des milieux ne doivent exercer aucune influence néfaste sur leur virage. IL est assez difficile de trouver des indicateurs réalisant absolument cette condition. Après de longuesexpériences, SoERENSEN (1908-1909), puis Crank et Luss (1917) ont décrit des séries d'indicateurs dont les points de virage s’échelonnent entre pH = 1,0 etpH = 10,0, seules valeurs que l’on utilise en pratique.

B. Les solutions étalons. — Les liquides de comparaison doivent être choisis avec un soin particulier pour que leur concentration en ions H demeure invariable. On a constaté depuis longtemps que les mélanges de sels acides avec des sels neutres (phosphates, carbonates) de même que les mélanges des protéines avec leurs produits de décomposition, faisaient l'office de régulateurs en s'opposant aux variations de la concentration en ions H. Ce sont là les substances /ampons. Ces mélanges de concentration très fixe sont propres à servir de solutions étalons.

TECHNIQUE DE LA MÉTBOLE. — Possédant les indicateurs et une série de liquides étalons, il est très facile de déterminer la concentration en

ions H d’un liquide. Un essai préalable du liquide à examiner montre grossièrement l’ordre de grandeur de la concentration en ions. On prend les séries de tubes étalons qui encadrent cette valeur supposée. On utilise bien entendu des tubes de verre clair absolument comparables de forme et de dimensions, remplis avec la même quantité de liquide (solution inconnue ou liquide étalon). On ajoute à tous les tubes V à X gouttes de l'indicateur convenable. On n'a plus qu'à comparer Îles teintes et à noter la concentration du tube étalon dont la teinte est la même que celle du liquide examiné On peut se procurer les liquides de comparaison déjà colorés (etcorrespondant à un indicateur déterminé). On peut encore colorer les mélanges de phosphates, servant d’étalons, en même temps que le liquide àtitrer.

Si l'on titre un liquide légèrement coloré, la superposition des couleurs dans le liquide à titrer rend toute comparaison impossible avec les liquides étalons. On remédie à cet inconvénient en plaçant au-devant du liquide étalon un tube contenañt du liquide à titrer non additionné d'indicateur, tandis qu'on place derrière le liquide à titrer additionné d’indicateur un tube contenant de l’eau pure. Ainsi, le faisceau lumineux fait dans les deux cas le même trajet.

Les solutions troubles ou très colorées, ne sauraient être dosées directement. On a remarqué heureusement, que les dilutions des liquides biologiques changeaient peu leur concentration en ions H, parce qu'ils renferment tous des quantités notables de substances tampons qui s'opposent aux variations de cette concentration. Pratiquement, la dilution du liquide à titrer dans cinq fois son volume d’eau pure ne change guère la valeur de son indice pH. Par ce moyen, on arrive en général à pouvoir titrer les liquides troubles ou très colorés.

Nous allons appliquer cette méthode à la recherche des

limites et de l'optimum de croissance des deux microbes qui nous intéressent.

CONCENTRATION OPTIMUM EN IONS H DES MILIEUX DE CULTURE POUR LE SPOROGÈNE ET L'HISTOLYTIQUE.

Expérience. — Nous avons d’abord préparé des milieux de culture de concentration variable en ions H. Le bouillon de viande putréfiée que nous avons ulilisé titrait pH — 5,0. À 10 cc. de ce bouillon nous avons ajouté 0 ce. 5 de sel marin à 1/10, des quantités variables d'acide chlorhydrique normal ou de soude normale, et enfin de l’eau physiologique, de façon à réaliser un volume’ constant de 12 ce. 5,

+ 20 — Par la méthode colorimétrique, nous avons calculé ensuite la concen-

tration en ions H de ces tubes et nous avons réalisé une série dont l’indice pH variait entre 3,0 et 9,0.

Préparation de milieux de concentration variable en ions H.

Nos )H des tubes H?0 nt l > 0,2 3,0 2 #2 10 4,0 E 33 2"0 50 4 0,3 41,7 6,0 5 06 1/4 65 6 10 10 7.0 Fr 112 08 75 8 14 06 8/0 9 127 0.3 90

Pour l’ensemencement, nous avons stérilisé ces tubes à 110 degrés, puis nous les avons additionnés d’une pincée de sulfure de calcium pour réaliser une atmosphère privée d'oxygène. Sur une série de tubes témoins, nous avons vérifié que ni la stérilisation, ni l'addition de sulfure ne modifiaient d’une façon sensible la concentration en ions H. Nous avons ensemencé à 40 degrés ies tubes de bouillon avec trois gouttes de culture de 24 heures de Sporogène ou d'Histolytique. Après

Développement des deux microbes en fonction de pH.

Sporogène O Histolytique

pH RER

Degré de croissance

initial pH final pH final

3 0 30 1 3,9 1 4 0 4,0 fl 4,0 il S0 5,5 2 buis) I 6/0. 6,0 3 6,0 2 6.3 6,5 4 6,5 ù) 7 0 7,0 4 7,0 4 75 Tes 4 7,5 4 8 0 8,0 3 8,0 3 9 0 9,0 0 EAU 0

ed ie

94 heures, nous avons déterminé approximalivement le degré de croissance (opacité de la culture comparée à des tubes étalons) et mesuré l'indice pH final par la méthode colorimétrique. Les résultats sont donnés dans les tableaux ci-dessuus. Les degrés de croissance 122513. correspondent grossièrement à 100.000, 200.000, 300.000... bactéries au centimètre cube.