CHAPITRE II

Microdosage du Cholesterol sanguin

Généralités sur la Cholestérolémie.

Les cholestérines sont aussi répandues que les corps gras et les lécithines dans l’économie animale. A l’exception des tissus osseux et dentaires, la cholestérine entre dans la composition de tous les organes, bien que l’on ne connaisse pas exactement son rôle. Comme elle fait partie de l’enveloppe des hématies on peut supposer, entre autres, que la cholestérine est une substance qui protège les corpuscules du sang contre l’hémolyse. La présence de la cholestérine dans le sang paraît communiquer au sérum des vertus antihémolvtiques, antitoxiques et bactéricides.

On sait depuis longtemps que le cholestérol est un agent antihémolytique très puissant s’opposant à l’action hémolysante de nombreux composés: saponines, savons, digitonine, hémolvysines de parasites etc. — Dans la plupart des cas, l’action antihémolytique s'explique par la combinaison du cholestérol avec l’agent hémolytique: tel est le cas, par exemple, avec la digitonine, et cette réaction a servi de point de départ à un procédé de dosage très précieux du cholestéroi. Il s'ensuit donc que si le cholestérol est estérifié par un acide gras, il ne peut plus se combiner à l’agent hémolytique et n’a plus aucune action protectrice, c’est ce que certains travaux ont vérifié. — La propriété antihémolytique du cholestérol a été mise à profit au point de vue thérapeutique

dans certaines anémies; son action est surtout marquée dans les anémies pernicieuses de la grossesse (J. CoLL de CARRERA).

Cholestérol et équilibre hydrique: La présence de cholestérol dans les divers organes et humeurs de l'organisme permet à ceux-ci, quoique souvent très riches en lipides non miscibles à l'eau de se laisser imbiber par elle et souvent d'en absorber une quantité considérable, Normalement le plasma ou le sérum sanguin contiennent un taux de cholestérol voisin de 1,70 gr. %e.

Uniformément réparti entre les globules et le plasma à l'état normal, ce composé s'accroît presque uniquement dans le plasma à l'état pathologique; c'est dire que seules les variations de la cholestérolémie plasmatique sont intéressantes.

Variations physiologiques: Les premières sont sous la dépendance du régime alimentaire. Le taux de la cholestérolémie est d'autant plus accusé chez une espèce anormale que son régime alimentaire moyen comporte une plus grande quantité de cholestérol ou de graisse (A. GRIGAUT). On sait que c’est le régime carné qui est le plus riche en ces composés, il n'est done pas étonnant de noter que la cholestérolémie soit plus élevée chez les carnivores que chez les herbivores, Chez l'homme, la cholestérolémie est aussi sous l'influence du régime, mais il faut admettre pourtant l’existence des facteurs individuels troublant cette règle. — L'état eravidique et puérpéral est aussi une cause de variations de la cholestérolémie. Le taux de celle-ci croît en général dans les trois premiers mois, puis subit une baisse appréciable pouvant aller jusqu'à des taux nettement inférieurs à la normale et enfin du sixième mois jusqu'au terme, ne cesse de croitre pour atteindre souvent des taux de quatre grammes par litre. Dés l'accouchement lhypercholestérolémie cesse et le retour à la normale se fait plus ou moins vite selon les cas.

Variations pathologiques — Infection: Dans l'infection légère le taux de la cholestérolémie est peu ou pas modifié. Dans linfection movenne: hypocholestérolémie existe à la

période d’état, hypercholestérolémie est de règle à la convaléscence. Dans l'infection très grave ou prolongée, la cholestérolémie s’abaisse considérablement (tuberculose par ex.), pour revenir ensuite à la normale, mais sans présenter son ascension secondaire (A. GRIGAUT).

Néphrites urémigènes: Inexistante dans les néphrites aigués, l’hypercholestérolémie est la règle dans les néphrites chroniques et son taux peut atteindre 15 gr. #%. Au fur et à mesure que la maladie évolue et donc que l’urée du sang augmente, la cholestérolémie diminue, d’où valeur pronostique assez fâcheuse de l’absence d’hypercholestérolémie chez les azotémiques.

Lésions hépatiques: L’élévation du cholestérol sanguin est de régle dans les états qui s’accompagnent de troubles de la sécrétion biliaire, ictère catarrhal, ictère par rétention, dans tous les cas de lithiase biliaire en général; le diabète et la goutte sont aussi des maladies s’accompagnant d’hypercholestérolémie.

Nous donnons ci-dessous un résumé des différentes techniques utilisées dans les laboratoires pour doser le cholestérol. Nous avons puisé ces matières dans lPexcellent travail de P. PESQUIER (64).

Les diverses méthodes de dosage du cholestérol.

Deux méthodes principales existent, dont sont dérivées beaucoup d’autres: 1° les méthodes basées sur la colorimétrie et principalement sur la réaction verte de LiEBERMANN; 20 les méthodes basées sur la pesée d’un précipité, complexe insoluble digitonine-cholestérol, encore assez mal défini. Notre étude critique se portera sur la précision des méthodes et sur les quantités de sang qu’elles nécessitent.

Dosage du cholestérol total. — Les méthodes les plus courantes utilisent la réaction de LIEBERMANN; la plus connue est celle indiquée par GRIGAUT en 1913 (65). 3Loor, en 1916 (66) publie une méthode, qui modifie celle de GriGauT au point de vue extraction en la

rendant meilleure; cette méthode est, de toutes, celle qui donne les chiffres les plus élevés de cholestérol sanguin. LAURENT-GÉRARD, en 1928 (67) améliore le rendement de la méthode de GRIGAUT, en opérant au colorimètre et en utilisant un écran rouge N°70. GRUSZEWSKA et ROUSSEL(68) modifient la méthode de GRIGAUT, le temps de contact entre l'alcool sodé et le sang est prolongé; ils utilisent des tubes identiques en verre blanc, qu’ils laissent trente minutes à l'obscurité pour obtenir des teintes comparables; ils opèrent un double dosage, l’un approximatif, l’autre plus précis servant de contrôle; la comparaison des tubes colorés est faite avec une boîte à deux fentes, genre kaléidoscope. MACHEBŒUF et SANDOR, en 1933 (69), montrent que la méthode de GRIGAUT comporte des causes d’erreur; le temps de contact est important, et la concentration optima en alcool de 60°. GRIGAUT, en 1935 (70), relève cette critique et montre que sa méthode atteint bien le degré d’alcool voulu.

D’autres méthodes de coloration ont été utilisées. COQUE- LET et Bi“wWoop, en 1927 (71), utilisent la réaction furfurol sulfurique, très sensible, qui leur donne les mêmes chiffres que la réaction de LIEBERMANN et la méthode de BLooR; de plus, ce dosage utilise de faibles quantités de sérum. NIKOLAÏEFF et KRASTELEWSKY proposent, en 1929, d'utiliser la réaction de SALKOWSKY, dans laquelle se forme un éther sulfurique du cholestérol, isolé par eux (72). Doris ABRAMSOHN (73) met au point ce procédé et obtient une phase colorée stable de 20 à 40 minutes.

La méthode par pesée, à la digitonine, semblerait préférable aux méthodes colorimétriques. Cependant il faut noter que cette méthode réclame, pour avoir de bons résultats un minimum de 10 centimètres cubes de sérum par dosage. Winpaus, en 1910, donne la première méthode rigoureuse de dosage par la digitonine (74). Celle-ci subit par la suite des modifications nombreuses. En 1920, FEx (75) introduit une amélioration qui permet d’extraire tout le cholestérol sous forme d’ester oléique; ceci lui facilite le dosage du cholestérol libre et des esters. LEMELAND, en 1921 et 1923 (76), apporte à son tour quelques modifications à la méthode de WiNDAUS, surtout au point de vue des extractions.

CAMINADE (77), en 1922, rend la méthode de WINDAUS vraiment quantitative en se plaçant dans un milieu où le précipité de cholestérol-digitonine est rigoureusement insoluble: c'est le mélange eau-alcool-acétone. Toutes les méthodes ci-dessus utilisent 20 à 30 centimètres cubes de sérum; elles sont donc peu pratiques pour des dosages comparatifs. SZENT-GEORGYI, en 1923 (78 et 79), donne une micro-méthode, permettant d'opérer sur de petites quantités de sang, et utilisant, soit une microbalance, soit l’oxydation par un mélange chromosulfurique; il opère sur 1 centimètre cube de sang. Dam, en 1929 (80), conseille de laver le précipité avec une solution saturée de complexe digitonine-cholestérol; il est préférable, en outre, d'établir les résultats d’après une courbe étalon dressée à l’avance, au lieu d'utiliser le coefficient fixé à 0,2431; de plus, la saponification rendrait le cholestérol en partie non précipitable par la digitonine. RUTH OKEY, en 1931 (81), donne une autre méthode, basée sur l’oxydation du complexe digitonine-cholestérol par le bichromate de potasse dans un milieu spécial; elle fait remarquer aussi que la saponification rend le cholestérol inapte à se combiner à la digitonine. Yasup4, en 1932 (82) transforme la méthode d’OKEy en micro-dosage; il saponifie, comme FEX, les esters avec l’éthylate de sodium; sa méthode donne cependant des chiffres inférieurs de 15% à celle de GRIGAUT; TURNER, en 1932 (83), simplifie la méthode de précipitation, en remplaçant les filtrations par des centrifugations, et en reprenant ensuite par la méthode d’OKey. GoFFINET el REDING, en 1935 (84) dosent le cholestérol libre par la digitonine, d’après CAMINADE, après extraction à l’acétone; comparant les diverses méthodes de SZENT- GEorGvyi, OKEY et YASUDA, ils en concluent que celles-ci sont hasardeuses et donnent des résultats incertains; 20 centimètres cubes de sérum sont nécessaires, pour éviter les pertes par solubilité et apporter une précision suffisante. L’appliquant au cholestérol total (85), les mêmes auteurs extraient à l’acétone et rejettent les purifications de KumaAGawa et de LEMELAND, comme inutiles; 10 centimèt:

cubes de sérum sont nécessaires d’après eux pour obtenir un

bon résultat.

D’autres méthodes ont été encore préconisées. SURAYII en 1927 (86), titre le cholestérol par floculation à l’eau distillée, après extraction dans l’éther de pétrole, puis dans le xylol; la méthode semble peu précise. Plus récemment, CHARONNAT, en 1935 et 1936 (87), est frappé par le fait que la soude extrait tout le cholestérol du sang; il recherche les coefficients d’extractibilité de celui-ci, et en arrive, en étudiant les solvants, à conclure que seul le méthylal extrait 100% du cholestérol; l’oléate de soude permet également une extraction complète.

Séparation du cholestérol libre et estérifié. — Les premières méthodes utilisées sont celles de Winpaus (74) et de CAMINADE (77) à la digitonine, par pesée. KumMAGAwaA (88), en 1908, utilise déjà la digitonine. LAUDAT et GRIMBERT (89) précipitent le cholestérol par la méthode de Winpaus. Ces méthodes sont longues et nécessitent de fortes quantités de sérum (20 cm°). GRiGAUT, en 1933 (90) dose le cholestérol total et estérifié par colorimétrie, sur 2 centimètres cubes de sérum, en se débarrassant par précipitation du cholestérol libre avec la digitonine, dans le solvant A.E.A. de CAMINADE. VELLUZ (91), en 1933, dose également le cholestérol total et le cholestérol estérifié, par la méthode de BLoor, modifiée par lui, en précipitant le cholestérol libre par la digitonine.

KANNER avait proposé, en 1931 et 1933(92, 93), de doser le cholestérol libre par simple extraction à froid par l’éther de pétrole, sans précipitation; le cholestérol libre serait seul et totalement dissous; GRIGAUT(94) a montré que cette méthode n’avait rien d’absolu et qu’il y avait aussi dissolution d’une petite quantité de cholestérol estérifié.

Nous tenons à rapporter ici un tableau de BürGER (95) exprimant d’une façon très instructive la valeur des différentes méthodes actuellement employées pour doser la cholestérolémie. On voit donc combien les résultats obtenus au moyen des différentes techniques sont variables et combien la comparaison du taux de cholestérol sanguin est difficile chez un homme, dont les analyses sont effectuées dans deux laboratoires différents.

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Comme nous l’avons mentionné, le sang contient à la fois de la cholestérine libre et des esters du cholestérol. En général le rapport entre le cholestérol libre et le cholestérol total est de 1 sur 2 Pour calculer le cholestérol libéré des esters cholestériniques, il faudrait employer les indices suivants:

Ester palmitique du cholestérol: Indice: 1,617. Ester stéarique du cholestérol: > 1,689.

Ester oléique du cholestérol: » 1,684.

On ne connaît cependant pas dans la plupart des cas le radical acide des esters présents, il faut donc utiliser, pour calculer le cholestérol libéré des esters, un indice moyen: 1.663.

Les méthodes, les plus souvent employées en France sont celles de GRIGAUT, de BLOOR ou dé BLooR-VELLUZ et celles de Winpaus où de WINDAUS-CAMINADE. En Allemagne on utilise beaucoup actuellement la méthode de MüHLBOCK et KAUFMANN (96).

Nous donnons maintenant la description de la technique que nous avons employée et qui nous a donné des résultats constants et très satisfaisants. Comme nous allons voir cette méthode permet une extraction plus rationnelle de la totalité du cholestérol que la technique de GRIGAUT et les résultats se rapprochent le plus de ceux dus aux méthodes gravimétriques de WaiNpaus et de CAMINADE, sans toutefois atteindre les concentrations fortes supérieures.

Nous n'avons pas eu recours à l'emploi de la digitonine, comme la plupart des méthodes le font actuellement. Les raisons qui nous ont guidé pour cette décision sont de nature multiple. Pour les dosages cliniques la méthode de WiNpAUS et ses modifications demandent un temps d’exécution trop long. On sait que la précipitation quantitative du complexe «digitonine-cholestérols ne s'effectue pas instantanément, il faut laisser reposer le précipité et le solvant environ 2{ heures.

Le précipité final doit être séché, le temps de 10 à 15 minutes à la température de 100 à 110° indiqué dans la technique initiale, n’est pas suffisant. Il faut souvent une à deux heures de séjour à la température indiquée pour obtenir aux pesées répétées des résultats constants.

Nous voyons donc que le temps nécessaire pour fournir à la clinique le résultat de la cholestérolémie est trop long; en plus les manipulations sont très délicates et demandent trop de soins et de temps pour le laboratoire spécialisé en analyses médicales.

D'autre part, on peut objecter à la méthode de WinpaAus plusieurs inconvénients au point de vue chimique. CAMINADE a constaté que le complexe «digitonine-cholestérol» n’était pas absolument insoluble dans l'alcool ‘à 90° comme WINDAUS l’admettait, (Cet inconvénient occasionne des erreurs allant jusqu’à 30%. Pour cette raison, CAMINADE a abandonné l'alcool employé comme solvant de l’insaponifiable total et de la digitonine et il l’a remplacé par un mélange «acétone-eau-alcoo!l absolu».

Cependant comme CUEnI (97) l’a montré et comme nous avons pu le vérifier, on n’arrive pas par ce changement de solvant à améliorer la technique. Au contraire si l’on risque par la méthode initiale de Winpaus de perdre des corps dosables et d'obtenir ainsi des résultats pondéraux trop faibles, on tombe par la technique modifiée de CAMINADE dans l’opposé du problème et les résultats pèchent par l’excès. Le solvant de CAMINADE précipite non seulement le complexe «digitonine-cholestérol», mais très souvent un excès de digitonine seule précipite en même temps et de cette facon le poids finalement déterminé est trop

élevé.

Pour toutes ces raisons nous n’avons pas employé la méthode de Winbaus. Nous avons déja antérieurement exposé les objections que l’on fait à la méthode de GRIGAUT et c’est pour ces raisons que nous n'avons pas appliqué cette technique pour nos recherches,

Nous avons donc employé une méthode élaborée par J. MEYER, qui nous a donné au cours de nos essais préliminaires des résultats très satisfaisants et qui a l’avantage de permettre l'emploi de petites doses de sérum ou de plasma; le mode opératoire et les manipulations sont peu compliqués, ne demandent pas une surveillance trop rigoureuse et fournissent les résultats dans un temps relativement court. Le dosage colorimétrique est effectué au moyen de la méthode de LIEBERMANN.

Le. # % TR OTRN ET) \

Méthode de dosage du Cholestérol total.

Nous utilisons pratiquement 2 cc. de sérum ou mieux de plasma, mais on peut aussi travailler à l’aide de 0,2 cc. de plasma tout en obtenant des résultats corrects. Dans ce cas il faut tenir compte de la dilution au moment où on effectue la réaction de LIEBERMANN.

Le sérum ou plasma est introduit dans un grand tube de centrifugation (30 cc.). On y ajoute lentement 3 cc. d’alcool à 95° et 1 cc. d’éther sulfurique. On agite bien et on complète avec 0,5 cc. de Soude N.

On adapte le tube de centrifugation à un réfrigérant de LieBiG fixé verticalement, de sorte que l’on obtient un appareil de distillation à reflux. On place ce dispositif dans un Bain-Marie ou sur un bain de sable électrique et on chauffe pendant 30 minutes.

On réalise ainsi une saponification et une extraction complète du cholestérol, qui passe dans le mélange éthéroalcoolique. On laisse refroidir, puis on centrifuge fortement.

On décante le liquide éthéro-alcoolique dans un autre tube de centrifugation.

On lave le dépôt resté dans le premier tube de centrifugation à deux reprises avec chaque fois 4 ce. d’alcool. On centrifuge chaque fois et on réunit les liquides de lavage

au liquide éthéro-alcoolique conservé dans le second tube de centrifugation.

Acidifier ensuite le liquide éthéro-alcoolique au moyen de l’acide phosphorique 3 N, d'habitude nous employons 0,5 cc. d'H3POA, 3 N. (Vérifier au tournesol que le milieu est devenu acide.). Il se forme un nouveau précipité de l’insaponifiable X.

On centrifuge et on décante le liquide acide dans une capsule d'évaporation en verre Pyrex. On lave le dépôt resté dans le second tube de centrifugation avec 2 fois 2 cc. d’éther de pétrole sec. On centrifuge et on réunit l’éther de pétrole au liquide acide dans la capsule d’évaporation.

On évapore ensuite les solvants éthéro-alcooliques au vide (ou au B.-M. électrique). On reprend le résidu dans 8 cc. d’éther de pétrole anhydre, que l’on ajoute à deux reprises de chaque fois 4 cc. en transvasant et en réunissant l’éther de pétrole dans une seconde capsule d’évaporation. Finalement on place celle-ci au vide pour opérer l’évaporation.

Puis on pratique la réaction de LIEBERMANN sur le résidu sec constitué par le cholestérol total de 2 ce. de plasma ou de sérum.

On reprend le résidu au moyen de 5 cc. de chloroforme, que l’on introduit en deux fractions et en agitant bien pour solubiliser la totalité du cholestérol. On introduit les solutions chloroformiques dans une éprouvette. On y ajoute 2 cc. exactement mesurés d’anhydride acétique pur et, ensuite cinq gouttes d'acide sulfurique pur concentré (D — 1,84). Ces gouttes sont mesurées toujours avec le même compte-goutte. On mélange le tout et on place aussitôt en

chambre noire pendant 30 minutes. Au bout de ce temps on la cellule photoëélec-

effectue la mesure colorimétrique à

trique.

Préparation de la solution témoin et établissement de la courbe d’étalonnage.

Nous avons préparé une solution chloroformique contenant exactement 10 pour 1000 de cholestérol. Le produit employé nous a été fourni par la Maison MERCK, comme cholestérol de jaunes d'œuf; nous l’avons préalablement purifié par des épuisements à l’eau distillée fortement alcalinisée par de l’ammoniaque, puis par des cristallisations répétées dans l'alcool bouillant.

A partir de la solution chloroformique de 10 pour 1000, nous avons ensuite préparé une gamme de solutions progressivement plus diluées, allant jusqu’à 0,75 gr. % de cholestérine. Puis nous avons employé de chaque solution 2 cc., que nous avons introduits dans un grand tube de centrifugation (30 cc), nous avons procédé à l’évaporation du chloroforme. Le résidu est ensuite repris par:

Alcool à 95° RICE.

Ether sulfurique: 1 cc.

NaOH, N US CC:

On passe à la saponification à l’appareil de distillation à reflux, comme nous l’avons précédemment exposé. Toutes ces solutions cholestéroliques sont donc soumises au même traitement que le plasma sanguin. Finalement on évapore l’éther de pétrole et on reprend le résidu cholestérolique par le chloroforme pour effectuer la réaction de LIEBERMANN, selon le procédé déjà indiqué.

Ces solutions colorées témoins sont examinées après 30 minutes de séjour à l'obscurité au moyen de la Cellule photoélectrique étalonnée au préalable à 100 M. V. pour l’eau distillée. Nous avons ainsi établi le graphique N° 6, que nous donnons ci-contre et qui correspond aux valeurs portées dans le tableau suivant:

rRGLES « 8'0 nm EG = “ »S'+

AOC SR UC 0: 09 % 9 N° 1031531049 :

Graphique N° 6.

Tableau N° VIII.

Degrés opacimétriques pour le dosage du cholestérol.

Cholestérol Degré Opacimétrique

gr. pour 1000 Mav:

La courbe ainsi obtenue indique donc directement la quantité de cholestérol contenue dans 1000 ec. de liquide en fonction de la densité optique, si l’on met 2 cc. de liquide cholestérolifère à l’épreuve.

Nous y avons mesuré et indiqué le taux de 1,54 gr. pour 1000 de cholestérol, parce que cette valeur correspond au degré opacimétrique de 53 M. V. égale à celle de notre écran vert standard.

On peut naturellement pour contrôler plus tard la courbe par rapport à la puissance de la cellule photoélectrique et pour éviter l'emploi d’une liqueur titrée de cholestérol aussi déterminer des points de repaire à l’aide de solutions titrées colorées stables et étalonnées, telles que les

solutions de «vert de naphtol B» à 0,005 pour 100 (Myers et WARDELL) ou de «chlorure de nickel» à 25 pour 100 (CANALS et CHABANNES) (98).

KHALYL recommande la solution suivante dont la teinte correspond mieux à celle donnée par la réaction de LIEBERMANN:

Solution saturée de Nitrate de nickel ONCE

Chlorure ferrique officinal Lrnec.

(solution 30%, D — 1,26)

Solution de bleu de méthylène à 1% 2,5 cc.

Eau distillée 28,0 cc.

Ce mélange peut être conservé assez longtemps sans altération.

Nous voyons que cette courbe donne des résultats suffisamment exacts et précis dans les limites de 1,50 à 3,5 pour 1000 de cholestérol. Si on travaille avec du plasma ou un autre liquide plus concentré, il faut par exemple partir avec 1 cc. de prélèvement et multiplier finalement le résultat lu sur le graphique, par deux. Inversement si l’on a affaire à une hypocholestérolémie ou une solution très diluée de cholestérol, il faut proportionnellement augmenter la quantité de liquide de départ et diviser ensuite la valeur indiquée sur la courbe par le quotient correspondant.

Méthode de dosage du Cholestérol libre:

Nous exposons ci-dessous une méthode de dosage du cholestérol libre, que nous avons élaborée avec J. MEyER. Nous donnons cependant cette technique, en attendant, sous toute réserve, car les expériences, pour expliquer définitivement les réactions, permettant seules d’affirmer avec certitude que nous y dosons la fraction de cholestérol libre correspondant à celle déterminable par la méthode de WinpaUs (précipitation du complexe <«digitonine-cholestérol») ne sont pas encore closes. Nous procédons donc de la façon suivante:

On introduit 2 cc. de plasma ou de sérum dans un grand tube de centrifugation (30 cc.), puis on y ajoute lentement 4 ec. d'alcool à 95°, on mélange bien et on y introduit immédiatement 0,5 cc. d'acide phosphorique en solution moléculaire (3/1 normale).

On relie le tube de centrifugation au réfrigérant de LiEBIG monté en appareil de distillation à reflux. On chauffe au Bain-Marie ou au Bain de sable électrique pendant 30 minutes. Puis on centrifuge le tube après l’avoir laissé se refroidir. On décante le liquide alcoolique dans une capsule d’évaporation en verre PYREx.

On lave le résidu resté dans le tube à centrifugation avec 4 cc. d’alcool à 95°. On centrifuge et on réunit finalement les deux liquides alcooliques dans la capsule d’évaporation et on évapore au vide.

Sur le résidu on pratique la réaction de LIEBERMANN en le dissolvant tout d’abord dans 5 cc. de chloroforme ajouté par fractions. On réunit les solutions chloroformiques dans une éprouvette, et on y ajoute, comme antérieurement, 2 cc. d'anhydrique acétique et 5 gouttes d’acide sulfurique concentré. On porte à l'obscurité pendant 30 minutes et on mesure l’opacité de la solution à la cellule photo-électrique; le nombre de degrés opacimétriques en M. V. indique sur la courbe précédente directement la quantité de cholestérol libre contenue dans 1000 cc. de plasma.

Il peut arriver que la solution verte obtenue par la réaction de LIEBERMANX est légèrement troublée. Il faut alors filtrer sur un filtre sec, pour obtenir un liquide absolument limpide. Cette manipulation ne présente aucun inconvénient, car le colorant vert n’est pas adsorbé par le papier filtre. Il faut absolument travailler à l’aide de solution ne présentant aucun louche, pour éviter des erreurs dues à la mesure néphélométrique.

Nous avons contrôlé les résultats obtenus à l’aide de cette technique avec ceux de la méthode de WiNpAUSs et nous avons pu constater une concordance assez parfaite, si l’on a affaire

à des cholestérolémies normales, c’est-à-dire dans tous les cas où le cholestérol total du plasma se cite à des taux entre 1,50 et 1,85 gr. pour 1000 et à des taux de cholestérol libre correspondant sensiblement à 50% du cholestérol total. D’autre part nous avons encore obtenu des résultats sensiblement analogues avec les deux méthodes pour des hypercholestérolémies dosant jusqu’à 2,30 gr. pour 1000 de cholestérol total et présentant un déséquilibre du rapport

cholestérol libre / cholestérol total="1/1:65.

Au delà de ces limites nous ne pouvons pas confirmer une concordance suffissante entre les valeurs des deux méthodes.

Nous avons d’autre part essayé de contrôler l’exactitude de notre méthode de dosage du cholestérol libre en procédant de la façon suivante: on précipite la solution alcoolique obtenue par l’extraction du plasma à l’aide d’une solution alcoolique de digitonine à 0,5%. Celle-ci forme avec le cholestérol libre la combinaison équimoléculaire insoluble dans une solution hydro-alcoolique. On filtre et on obtient dans le filtrat le cholestérol estérifié. On évapore le filtrat dans un grand tube de centrifugation. Le résidu est ensuite traité au moyen de 4 cc. d'alcool à 95° additionnés de 0,5 cc. d'acide phosphorique N3, pendant 30 minutes au réfrigérant à reflux. On continue ensuite la manipulation comme nous l’avons antérieurement exposée.

Les solutions acides alcooliques traitées une seconde fois par la digitonine ne donnent aucun précipité, ce qui prouve l’absence de cholestérol libre.

Si on pratique par contre sur les résidus du filtrat acide alcoolique une saponification par addition de:

3 ce. d'alcool à 95°,

1 cc. d’éther sulfurique,

2 cc. de soude normale, et on transvase dans une ampoule à dé ‘antation; on épuise par de l’éther de pétrole. On évapore l’éther de pétrole, on

reprend le résidu par la solution de CAMINADE (Acétone- Alcool-Eau) et on y ajoute 5 ce. de solution de digitonine à

0,5%, une nouvelle précipitation du complexe «digitoninecholestérol» s'effectue immédiatement. Ceci prouve que le filtrat acide alcoolique contenait encore du cholestérol estérifié, qui n’a pas été modifié par l’action de l’acide phosphorique à chaud.

Il paraît donc qu'aucune réaction de saponification ne se produit au cours de notre technique. Pour être affirmatif, il faudrait cependant pratiquer des recherches à l’aide de cholestérol synthétiquement estérifié et connaissant alors le poids exact de la substance pure mise en œuvre, on pourra contrôler l’exactitude et les limites expérimentales de notre mode opératoire. Ces recherches dépassaient le cadre de notre travail, mais nous tenons à signaler le fait constaté par nous et nous espérons que des travaux futurs permettront d’éclaircir ce problème.

Nous croyons cependant pouvoir affirmer que pour l'analyse clinique notre technique de dosage du cholestérol libre donnera des résultats suffisamment exacts et répondra par sa simplicité et par ses avantages économiques à un besoin déjà longtemps exprimé par les biologistes pratiquants.

Nous donnons ci-dessous un tableau synoptique de nos deux méthodes, permettant de suivre plus facilement la marche et les différentes phases de nos manipulations:

Tableau N° IX.

Résumé des techniques de dosage du:

Cholestérol total | Cholestérol libre

Plasma ou Sérum .. 2 cc. Plasma ou Sérum .. 2 ce. Alcool :à,95°.:%.:...: 3. CC. AlCQOlT Aa gen, 4 cc. Ether sulfurique 1ACC: HÉDOLNS/1e ee 0 Sc NAOEESNT 2. ee, 0,5 cc.

Porter dans un grand tube de centrifugation (30 cc.).

Chauffer à l’appareil de distillation à reflux pendant 30 minutes.

Décanter le liquide alcoolique et laver le dépôt avec 4 cc. d’alcool!l à 95°,

Réunir les liquides alcooliques.

Ajouter au liquide alcoo- Evaporer au vide les lilique contenu dans un quides alcooliques contube centrifugeur: tenus dans une capsule HAPOPANrS dE eUDTCC: d’évaporation.

Centrifuger et décanter le liquide acide. Laver le dépôt avec 2X2 cc.

d’éther de pétrole sec.

Réunir les liquides d’extraction.

Evaporer les solvani(s éthéro-alcooliques.

Reprendre le résidu avec 2X4 cc. d’éther de pétrole anhydre, que l’on réunit dans une capsule d’évaporation.

Pratiquer sur le résidu la réaction de LIEBER- MANN.

Dissoudre le résidu dans 5 ce. de chloroforme, ajoutés en deux fractions.

Ajoutez-y: Anhydride acétique pur: 2 cc.

Acide sulfurique conc.: 5 gouttes.

Placer à l’obscurité pendant 30 minutes.

Examiner à la cellule photo-électrique.

Les degrés opacimétriques déterminés, indiqués en ordonnée sur le graphique, donnent directement la quantité de cholestérol en grammes pour mille, indiqués en abscisse, en partant de 2 cc. de liquide cholestérolique.

Nous croyons avoir ainsi fourni une méthode de dosage des Cholestérolémies suffisamment exacte pour la clinique et en pratique facilement réalisable. Nous espérons que des essais ultérieurs confirmeront l'exactitude de notre technique nouvelle pour le dosage du cholestérol libre.