Formule de Sonnenschein
ACéta lee SONIA EE re 0 20 ACIDE DOTE ET ee re some h g Hausse RE Eee coter ee 100 Cm?
ajouter une partie de complément à une partie de cette solution.
Le complément se trouve donc déjà dilué au 1/2. Mis à la glacière, il conserve ses propriétés durant 1 à 2 mois.
3. Les globules rouges de mouton sensibilisés par l’hémolysine antimouton. — Il est capital d'employer une dose d’'hémolysines convenable, Cette dose est déterminée par un titrage dont nous parlerons au chapitre suivant. Dans toutes les réactions, nous utilisons une suspension d’hématies de mouton sensibilisées préparée en mélangeant 10 minutes avant l'emploi LÉ
1 volume de suspension globulaire standardisée ;
x volume de sérum hémolytique anti-mouton dilué au titre voulu ;
1 volume d’une solution à 1 0/00 dans l’eau physiologique de SO,Meg, OH, (L'ion magnésium, en quantité convenable, favorise l’hémolyse comme nous le verrons par la suite ; 1 cm° de cette solution contient environ 100 y d'ions Mg).
c) Mode opératoire. — On dispose sur un portoir métallique une série de 11 tubes à hémolyse. Dans chacun de ces tubes, on ajoute dans l’ordre :
— le complément dilué au 1/100° (la dilution ne doit être faite que quelques instants avant la distribution) : 0,05 em° dans le premier tube, 0,10 em° dans le deuxième, etc... (le onzième tube ne reçoit pas de complément : c’est un tube témoin qui ne contiendra que des globules rouges sensibilisés ; il ne doit présenter aucune trace d’hémolyse si les hématies sont de bonne qualité) ;
— de l’eau physiologique afin de compléter le volume de chaque tube
à 5 CMS — 1,5 em* de la suspension de globules rouges de mouton sensibilisés
dont nous avons parlé.
Le détail de cette distribution est indiqué dans le tableau r.
Le portoir est alors placé dans le bain-marie à 37°. Il faut prendre la précaution d’agiter fréquemment les tubes pour éviter la sédimentation des globules, ce qui fausse les résultats du titrage en ne permettant pas une action régulière du complément.
Au bout de 45 minutes on retire les tubes du bain-marie. On constate que l’hémolyse est nulle ou partielle dans les premiers tubes, totale ou presque totale dans les derniers tubes.
Pour évaluer le pourcentage exact d’hémolyse dans chacun des tubes on opère de la façon suivante : les tubes sont centrifugés et on mesure la densité optique des solutions d’hémoglobine ainsi obtenues (Toujours en utilisant le photocolorimètre de Bonét-Maury, écran vert n° 3,=5.200- 5.700 À). CAT À
Le rapport entre la densité optique du liquide contenu dans un tube présentant une hémolyse partielle et celle du liquide contenu dans un tube où l’hémolyse est totale exprime le pourcentage d’hémolyse dans le tube où l'hémolyse est partielle (Remarque).
Dans le tableau 2 nous mentionnons les résultats obtenus en effectuant le titrage d’un complément d’après cette technique.
REMARQUE. — On peut se dispenser de faire ce calcul, le chiffre lu sur le micromètre projeté du photocolorimètre de Bonét-Maury représentant directement le pourcentage d’hémolyse. En effet, nous effectuons les mesures photométriques en utilisant la « méthode à charge constante » décrite par le constructeur de cet appareil (Établissements Jouan, Paris), mais en effectuant l’équilibrage de la cellule de compensation non pas en éliminant la cuve, mais en interposant sur le trajet du faisceau lumineux la cuve remplie d’eau distillée. De cette façon, le chiffre lu exprime directement la densité optique de la solution d'hémoglobine sans qu'il soit nécessaire de la corriger en y retranchant la densité optique de la cuve remplie d’eau distillée. D'autre part, la standardisation de la Suspesion globulaire est faite de telle manière que 0,50 em° de suspension globulaire Iysés totalement par 5,5 em* d'eau distillée (volume total de 6 em) fournissent une solution d’hémoglobine de densité oplique 50; chaque tube de la réaction contient un volume total de 3 cm3 dont 0,50 em® de suspension globulaire standardisée; dans ces conditions, on peut conclure qu'il y a 50 0/0 d’hémolyse dans le tube de la réaction contenant une solution d'hémoglobine de densité optique 50; le pholocolorimètre absolu de Bonét-Maury donnant une relation à peu près linéaire entre le titre des solutions d'hémoglobine et leur densité oplique, il en résulte que la densité optique lue dans les conditions que nous venons de décrire représente directement et avec une approximation suffisante le pourcentage d’hémolyse atteint dans le tube de la réaction.
Tirage du complément à 50 0/0 d’'hémolyse.
Numéro des tubes. en 2 à k 5 ( 7 8 9 | ro 11 Complément au 1/100 . .l0,05 ne 0,15|0.20/0,25|0,30|0,35|0,40/0,45|0,50| — Eau salée à 0,85 oJo. . .\1,45|1,4o|1,35/1,30/1,25|1,20|1,15|1,10|1,05|1 1,p0 G. R. sensibilisés (standar- # NT em dis Un ,, 1,50!1,50/1,001,501,h0/1,50lt,50|1,50/1,50|1,00| 1,50 45’ à 37°. Centrifugation. Lecture photométrique du pourcentage d’hémolyse.
Résultats d’un titrage de complément à 50 0/0 d’'hémolyse.
Numéro des tubes .| 1 2 3 k 5 6 7 8 9 10 |11
Complément au1/100 |0,65|0,10| 0,15| 0,20| 0,25| 0,30| 0,35] 0,40] 0,45] 0,50|—
o/o d'hémolyse . .lo 5 |1g |%o |6o [737 go 98 ioo |ico 0
d) Tracé de la courbe d'hémolyse el détermination graphique de l’unité 50 0/0. — Sur un papier millimétré nous traçons des axes de coordonnées et portons en abscisse les volumes de complément au 1/100° contenus dans chacun des 10 tubes du titrage et en ordonnée les pourcentages d’hémolyse correspondant. La valeur de l'unité 5o o/o est calculée par extrapolation graphique. On trace la courbe reliant ces points entre eux : cette courbe en forme de S (courbe de Gauss) est appelée courbe d’hémolyse (fig. 1 correspondant aux chiffres mentionnés dans le tableau 2). L’abscisse du point de cette courbe d’ordonnée 50 (point d’inflexion) représente le volume de complément au 1/100° capable d’hémolyser 50 o/o des globules rouges de mouton employés : c’est l’unilé 50 0/0 (de même, l'unité 100 0/0 est l’abscisse du point d’ordonnée 100. Dans l'exemple choisi : unité
5o 0/0—0,225 de complément au 1/100° et unité 100 0/0=0,425 de com-
plément au 1/100°), Par titre d’un complément on entend souvent le nombre d'unités 50 o/o contenu dans 1 cm° de sérum frais : ainsi le complément dont l'unité 5o o/0=0,225 cm° au 1/100° titre 445 unités au
centimètre cube.
pourcentage d'hemolyse
unité 50% __
cm; de complément au !/100€ LEE ES St 005 010 015 920 0,25 030 035 DUO 045 0,50
Fic. 1. — Courbe d'hémolyse permettant le calcul de l’unité 50 07/0 - (cf. Tableau 2).
