NA TURE ET PROPRIÉTÉS DU POISON

La détermination de la nature du poison diphtérique a donné lieu à de nombreuses recherches ; Brieger et Frankel, Wasserman et Proskauer ont voulu en faire une toxalbumine, Gamaleia une nucléoalbumine ; mais ces auteurs ne sont arrivés qu'à obtenir des produits très impurs, relativement très peu toxiques.

Roux et Yersin ont démontré que le principe actif des cultures filtrées est une substance analogue aux diastases et en présentant les propriétés capitales.

Le poison diphtérique est tué à 100°; une exposition de douze heures à o8° affaiblit son activité au point qu'un centimètre cube de toxine ainsi chauffée ne tue plus le cobaye ; après chauffage à 70°, l'affaiblissement est encore plus marqué : l'inoculation de plusieurs centimètres cubes amène chez le cobaye une maladie chronique se terminant par la mort au bout de plusieurs semaines.

Comme les diastases, le poison diphtérique a la propriété d'être entraîné par les précipités que l'on produit dans les liquides où il est dissous (Réaction de Miahle).

En ajoutant goutte à goutte à de la toxine une solution de chlorure de calcium, il se produit, grâce aux phosphates contenus clans le liquide, un précipité de phosphate de chaux ; ce précipité, recueilli sur un filtre et lavé, est très toxique ; quand on en inocule un grain sous la peau d'un cobaye, l'animal succombe rapidement ; au point d'inoculation, il se produit de l'œdème et une petite fausse membrane grisâtre. Ce précipité est plus actif à l'état humide qu'à l'état sec; cependant il garde, après dessiccation, une grande partie de son activité et résiste alors beaucoup mieux à l'action de la chaleur: il peut être chauffé à 70°, sans que sa toxicité soit diminuée; un petit grain du précipité desséché, placé sous la peau, peut tuer successivement trois cobayes, lorsqu'on le reporte d'un animal sur un autre.

Après une première précipitation, le liquide clair garde encore une certaine toxicité, mais on peut le précipiter plusieurs fois de suite et chaque fois le précipité entraîne une nouvelle quantité, progressivement décroissante, de poison; enfin le liquide précipité plusieurs fois et devenu très peu actif peut encore donner au cobaye, à haute dose, une intoxication chronique.

Le poison diphtérique, soluble dans l'eau, est précipité par l'alcool, comme les diastases; mais ce traitement diminue son activité. Pour obtenir la précipitation, il est avantageux de concentrer d'abord le filtrat au dixième de son volume dans le vide à 25°; à l'extrait liquide obtenu, on ajoute quatre à cinq volumes d'alcool fort, le précipité produit contient le poison mélangé à. de nombreuses impuretés.

La loxine obtenue par lillration peut être desséchée dans le vide jusqu'à consistance d'extrait sec; cet extrait est soluble dans l'eau ; il renferme le poison mélangé à une énorme proportion d'impuretés; la solution aqueuse soumise à la dialyse abandonne rapidement les sels minéraux qu'elle contient, mais ne se dépouille que très difficilement de la toxine; ce procédé peut être employé pour purifier le poison diphtérique.

La puissance toxique du poison diphtérique est considérable.

Un centimètre cube de culture filtrée fournit un centigramme de résidu sec; or, 1/200° de centimètre cube de culture filtrée est suffisant pour luer un cobaye; la dose toxique de résidu sec est donc soit

Otf',00005; de ces 5 centièmes de milligramme, il faut défalquer la plus plus grande part, relevant des sels minéraux, peptone, etc.; on conçoit combien est infinitésimale la dose toxique.

Le poison diphtérique est sensible à l'action de certains agents chimiques. Les ferments pepsiques le détruisent ; l'alcool en atténue l'activité. Les agents oxydants se font remarquer par l'énergie avec laquelle ils le modifient : l'eau oxygénée, les hypochlorites alcalins, mais surtout le trichlorure d'iode et l'iode affaiblissent considérablement son activité ; l'action de ces corps a été utilisée pour atténuer la toxine destinée a servir aux immunisations.

1. — Chez les animaux de laboratoire, les injeclions espacées de doses très faibles de toxine arrivent difficilement à produire l'accoutumance ; il se produit une accumulation des doses, l'animal se cachectise et meurt.

a. G. Hoffmann a obtenu le premier l'immunisation des cobayi s les animaux inoculés avec des cultures atténuées parle vieillissement supportaient ensuite l'inoculation de cultures pleinement virulentes.

b. Frànkel parvint à immuniser des cobayes en leur injectant sous la peau des cultures diphtéritiques chauffées à 6o°-70° pendant une heure ; il injectait en plusieurs fois 10 à 20 centimètres cubes de ces cultures: l'immunité était acquise au bout de quatorze jours.

c. Behring arrive à immuniser des cobayes et des lapins en injectant de la sérosité pleurale provenant de cobayes ayant succombé à l'inoculation des cultures virulentes; l'immunisation est obtenue quatorze ou quinze jours après l'inoculation vaccinale. Ce procédé donne des résultats très inconstants.

PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES

ci. Behring immunise des cobayes et des moutons par l'inoculation de cultures âgées de trois semaines additionnées de 1 p. 500 de trichlorure d'iode; après une injection de quelques centimètres cubes du mélange, l'animal est laissé au repos pendant une dizaine de jours, puis reçoit une seconde injection de culture additionnée d'une quantité moins forte de trichlorure d'iode ; au bout d'une quinzaine de jours, l'immunité est acquise. Ce procédé échoue chez le lapin.

Dans certains cas, Behring a pu exercer une action thérapeutique en injectant du trichlorure d'iode quelques heures après avoir inoculé au cobaye une culture virulente du Bacille de Klebs-Lôffler.

Bien plus, des animaux qui avaient reçu quelques jours auparavant une injection sous-cutanée d'une solution au dixième d'eau oxygénée ont résisté à l'inoculation de la culture virulente.

e. Brieger, Wassermann et Kitasato ont conféré l'immunité au cobaye en lui injectant une culture en bouillon de thymus chauffée quinze minutes à 70°. — Nous reproduirons l'immunisation d'un cobaye d'après ces auteurs.

Le bouillon de thymus préparé selon le procédé incliqué page 33 est ensemencé avec un bacille très virulent (le bacille employé par les auteurs tuait en quarante-huit heures un cobaye à la dose de 0CC,05 de culture en bouillon). Quand la culture est complètement développée, on la chauffe pendant quinze minutes à 70°.

Un cobaye de 330 grammes a reçu le o octobre 2 cent. cub. de culture chauffée.

— — le 7 — 2 —

— — le 11 — 2 —

On lui inocule le 20, ainsi qu'à deux animaux de contrôle, un centimètre cube d'une culture en bouillon, tuant à 0CC,05.

Les deux cobayes témoins meurent en trente-six heures, le cobaye traité reste vivant. Il a présenté au point d'inoculation un œdème assez volumineux, puis il s'est formé une escarre nécrotique qui s'est éliminée par la suite : le Bacille diphtérique a cultivé sur place, mais l'organisme du cobaye était préservé contre le poison.

Les auteurs ont immunisé ainsi soixante-dix cobayes ; néanmoins Behring et Kitasato ont démontré par la suite que cette méthode était inférieure à l'emploi du trichlorure d'iode.

II. — Boux, Nocard et Martin sont parvenus à immuniser divers animaux (lapins, moulons, chèvres, vaches, chevaux) en leur inoculant d'abord de la toxine active mélangée à de la solution iodée de Gram, puis des doses progressives de toxine pure.

Un lapin, par exemple, reçoit d'abord sous la peau un demi-centimètre cube du mélange suivant, préparé au moment de l'emploi :

Toxine 2 volumes.

Solution iodée de Gram i volume.

Au bout de quelques jours ou renouvelle l'injection et on continue ainsi pendant quelques semaines; alors on diminue la proportion d'iode et on arrive progressivement à donner de la toxine pure. Il est nécessaire du peser fréquemment les animaux et d'interrompre les injections quand ils diminuent de poids, sans quoi on déterminerait la cachexie et la mort.

La chèvre et la vache s'immunisent de même, mais sont très sensibles au poison; il est nécessaire de donner des doses très faibles de toxine iodée au début et de ne passer à la toxine pure que lorsque le sang possède un certain degré de pouvoir antitoxique; il faut savoir qu'au moment de la mise-bas, la sensibilité au poison est augmentée.

Le cheval supporte bien la toxine ; c'est l'animal dont l'immunisation présente le plus d'intérêt, car on l'utilise comme producteur du sérum anti toxique.

Les chevaux choisis doivent être encore jeunes (six à neuf ans), hien se nourrir et ne présenter aucune lésion des organes internes. Après les avoir soumis à l'épreuve de la malléine pour s'assurer qu'ils ne sont pas morveux (Voy. Morve), on leur donne d'abord une petite quantité de toxine active additionnée ou non de liquide de Gram, puis les doses sont augmentées progressivement; dès la troisième injection, on donne de la toxine pure ; la susceptibilité des différents individus variant beaucoup, on doit toujours commencer par des doses sûrement inoffensives pour éviter de déterminer une réaction violente qui compromettrait la marche régulière de l'immunisation. Les injections de toxine se pratiquent sous la peau de l'encolure ou en arrière de l'épaule.

Nous reproduisons comme type l'immunisation d'un cheval par Roux et Nocard :

Cheval de sept ans, du poids de 400 kilogrammes environ. La toxine employée tue un cobaye de 500 grammes en quarante-huit heures, à la dose de 1 /10e de centimètre cube. Elle est injectée sous la peau de l'encolure ou en arrière de l'épaule.

ltr jour de l'expérience. Injection de 1/4 c. c. Toxine iodée à 1 p. 10. Pas de réaction n

locale ni générale.

2° — 1/2 c. c. Toxine iodée à 1 p. 10.

4e, 8°, 8e jour — — —

13c 1 c. c. — Pas de réaction.

170 — 1/4 c. c. Toxine pure. Léger œdème, sans fièvre.

43e 46" 48e, 50» jour — 30 c. c. Toxine pure, œdème assez prononce dissipé

en vingt-quatre heures.

53e jour. — . 60 c. c. — —

57°, 63», 05e, 67« jour — 60 c. c. — —

72e jour — 90 c. c. —

80* — 250 ce— —

SÉROTHÉRAPIE.

Ce cheval a reçu en deux mois et vingt jours 800 centimètres cubes de toxine sans présenter autre chose qu'un œdème local passager, de l'inappétence et une augmentation de température de 1° environ les soirs des jours où l'injection a été copieuse. Le quatre-vingt-septième jour, le cheval a été saigné, puis a reçu sans en être incommodé 200 centimètres cubes de toxine dans la jugulaire. Les chevaux vaccinés supportent également bien des doses massives (plusieurs centaines de centimètres cubes) de cultures vivantes.

Quelquefois les animaux manifestent une sensibilité plus grande au poison diphtérique; après l'injection, l'animal peut présenter un œdème dur, étendu, persistant plusieurs jours, et même des sueurs et une élévation notable de température.

Pour conduire rapidement l'immunisation, on peut commencer par des doses plus fortes que dans l'exemple que nous venons de citer : on injecte d'emblée un demi-centimètre cube de toxine pure ; presque tous les chevaux résistent à cette dose, mais il est prudent de ne pas la renouveler avant huit jours. Avec les toxines hyperactives que l'on emploie aujourd'hui, l'immunisation doit être menée très prudemment.

Pour entretenir l'état d'immunisation des chevaux, il est nécessaire de leur donner de temps en temps de la toxine. On peut, tous les vingt jours, après avoir fait la saignée, injecter dans la jugulaire une dose de 300 à 500 centimètres cubes de culture ; mais il semble plus efficace d'injecter fréquemment sous la peau des doses modérées de toxine : on en donnera, par exemple, tous les deux ou trois jours 10 à 50 centimètres cubes; la saignée doit être pratiquée seulement trois semaines après la dernière injection.

S 4. - SÉROTHÉRAPIE.

Behring et Kitasato, en 1890, ont mis en lumière les propriétés du sang des animaux immunisés contre la diphtérie.

Le sang de ces animaux est capable de détruire le poison diphtérique in vitro et dans l'organisme; cette propriété se retrouve intacte dans le sérum du sang débarrassé de tout élément cellulaire. Ce sérum se montre préventif et thérapeutique sur les lapins et les cobayes intoxiqués avec le poison diphtérique ou inoculés avec le microbe vivant. Ces faits établis, Behring, Ehrlich et leurs collaborateurs essayent d'appliquer les propriétés du sérum antidiphtérique au traitement de la diphtérie humaine (Behring, Ehrlich, Boer, Wassermann, Rossel).

Mais la sérothérapie de la diphtérie n'est entrée véritablement dans la pratique médicale qu'après la communication de Roux et Martin au Congrès d'hygiène de Buda-Pesth, dans laquelle ces auteurs résument les recherches qu'ils ont effectuées de 1891 à 1894.

Behring el Kitasalo utilisaient le mouton et la chèvre comme producteurs de sérum ; après eux, llardach et Aronson se sont adressés au chien. Depuis les recherches de Roux, Nocard et Martin, le cheval est seul employé ; nous exposerons la pratique suivie à I Institut Pasteur.

Préparation du sérum. — L'animal de choix est le cheval, d'abord parce que son sérum, même à doses considérables, est inoffensif pour l'homme et les animaux de laboratoire (Roux et Vaillard) ; puis, cet animal supporte beaucoup mieux que les autres espèces la toxine diphtérique; enfin il est capable de fournir de grandes quantités de sérum.

Le cheval destiné à produire le sérum doit être immunisé, avec les précautions que nous avons énoncées plus haut, par l'injection répétée de petites doses de toxines. Il faut environ ( rois mois pour que l'immunisation du cheval soit suffisante ; actuellement on injecte de la toxine progressivement jusqu'à ce que l'animal ait reçu un total d'un litre de toxine ; les dernières injections sont de 200 à 250 centimètres cubes ; on laisse reposer le sujet pendant trois semaines après la dernière injection avant de pratiquer la saignée. La saignée fournit environ 4 litres de sang ; elle peut être répétée tous les vingt ou trente jours.

L'immunisation du cheval producteur de sérum doit être entretenue par de nouvelles injections de toxine faites de temps en temps; nous avons dit qu'après la saignée, par la canule restant en place, on peut injecter en une fois dans la veine une dose de 300 à 500 centimètres cubes de toxine; on peut aussi avoir recours aux injections répétées de petites doses sous la peau (p. 393).

La saignée est pratiquée dans la jugulaire selon la technique exposée pages 48-51 (Procédé de Nocard et appareil de Lalapie). Les 4 litres de sang fournissent près de 3 litres de sérum.

Quand ou possède plusieurs animaux immunisés, il est très important de mélanger le sérum fourni par un certain nombre de chevaux : on obtienl ainsi un produit total, d'activité uniforme; déplus, le sérum mu-mal de certains chevaux a la propriété de provoquer des éruptions érythémateuses, de gravité minime, niais gênantes; le mélange des sérums obvie à cet inconvénient.

Pour la conservation, le sérum est réparti purement dans de petits flacons stérilisés, fermés avec un bouchon de caoutchouc stérile et gardés à l'abri de la lumière.

Quand on n'est pas absolument sûr de l'asepsie ou peut, avant le bouchage, projeter dans le flacon rempli de sérum un petit fragment de camphre saisi avec une pince flambée et passé dans la flamme du gaz. Behring pré-

SÉItOTJlÉHÀPlK.

pare son sérum sans s'attacher à obtenir une asepsie complète et assure sa conservation en lui ajoutant un peu d'acide phénique (0,5 p. 100).

Le sérum préparé purement peut être conservé, dans nos climats, plusieurs mois et même plusieurs années à l'état stérile, sans perdre de ses propriétés antitoxiques; il se produit quelquefois dans les flacons un trouble manifeste, mais ce trouble n'a aucune signification relativement à la pureté et à l'efficacité du sérum.

Sérum sec. — On peut obtenir un sérum sec en desséchant le sérum dans le vide; au moment des besoins, on redissout la substance sèche obtenue dans huit ou dix fois son poids d'eau stérile; cette solution donne fréquemment une petite tuméfaction locale passagère que ne produit pas le sérum naturel. Dans nos pays, le sérum liquide doit toujours être employé à l'exclusion du sérum sec; celui-ci pourra présenter des avantages dans les régions tropicales où le sérum liquide perd assez vite ses propriétés.

Lait antitoxique. — Le lait des femelles immunisées possède des propriétés antitoxiques (Ehrlich). Ce fait n'a guère qu'un intérêt théorique, la dilution extrême de l'antitoxine dans le lait rendant celui-ci incapable d'être utilisé dans la pratique médicale.

On peut néanmoins condenser sous un petit volume l'antitoxine que contient le lait et obtenir un produit utilisable pour les recherches de laboratoire. On s'adressera au lait de la vache ou de la chèvre; on ne peut guère obtenir qu'un lait actif au cinquantième (Voy. plus loin).

Wassermann traite ainsi le lait pour y condenser l'antitoxine : à un litre de lait recueilli aseptiquement (Voy. p. 34) on ajoute 20 centimètres cubes de solution normale de chlorure de sodium et de la présure en quantité suffisante pour obtenir une coagulation complète cl rapide; le liquide clair est décanté, puis agité avec du chloroforme pour le débarrasser des corps gras; le mélange est abandonné à lui-même, puis on décante le liquide aqueux. Ce liquide est précipité par le sulfate d'ammoniaque ; le précipité recueilli sur un filtre est desséché dans le vide et redissous dans unequantité d'eau dix fois moindre que la quantité du liquide où a eu lieu leprécipité.

Propriétés du sérum. — Le sérum des animaux immunises est antitoxique : son mélange, en quantité convenable, à la toxine rend celle-ci inoffensive.

Le sérum doit cette propriété à une substance spéciale, X antitoxine, dont la nature n'est pus mieux connue que celle de la toxine; comme cette dernière, elle est altérée par la chaleur, précipitée par l'alcool et entraînée par les précipités formés au sein des liquides qui la renferment en dissolution. Elle est sécrétée dans l'organisme sous l'influence de la toxine: « sous l'influence de la toxine certaines cellules de l'organisme ont acquis une propriété sécrétoire nouvelle et persistante » (Salomonsen et Maclsen).

L'antitoxine sature la toxine, in vitro et dans l'organisme ; elle jouit de propriétés préventives et thérapeutiques : un cobaye auquel on donne une dose suffisante de sérum supporte ensuite une quantité de toxine diphtérique sûrement mortelle pour des cobayes non préparés; de même, on peut injecter d'abord la toxine, et plusieurs

heures après, le sérum, l'animal ne périra pas. L'immunité se produit rapidement, mais ne dure pas; elle a complètement disparu au bout de quelques jours ou de quelques semaines.

La quantité île sérum nécessaire pour guérir un animal qui a reçu de la toxine varie avec divers facteurs qui sont : le poids de l'animal, la quantité et l'activité de la toxine employée, et enfin l'activité du sérum. Il est très important de connaître l'activité du sérum que l'on emploie et l'on a établi des règles pour juger de cette activité (Voy. plus loin).

Le sérum antitoxique n'est pas bactéricide; il possède, assez irrégulièrement, la propriété agglutinante. L'agglutination se produit dans les dilutions à 1 p. 10 et 1 p. 20, elle peut être visible à l'œil nu, des grumeaux se précipitant au fond du tube (Nicolas). Elle manque souvent. Le sérum des individus atteints de diphtérie a parfois aussi des propriétés agglutinantes (Bruno).

Le sérum se montre préventif et thérapeutique chez les animaux inoculés avec une culture vivante ; la propriété thérapeutique se manifeste encore quandle sérum est injecté douze et dix-huit heures après le virus.

Chez le cobaye, l'injection de sérum pratiquée avant l'inoculation vulvaire ou trachéale n'empêche pas le développement de la fausse membrane, mais préserve l'animal de toute intoxication, de toute maladie générale; dès le second jour, les fausses membranes se détachent et la réparation de la muqueuse commence. Pratiquée après production expérimentale des fausses membranes sur les muqueuses du cobaye, l'injection de sérum amène au bout de quelques heures la disparition de l'œdème et de la tuméfaction et, dès le deuxième jour, la chute de la fausse membrane.

Les fausses membranes produites clans la trachée du lapin par l'association du Streptocoque et du Bacille de Klebs-Lôffler résistent beaucoup plus à l'action du sérum ; une injection de 5 et même de 10 centimètres cubes de sérum ne suffit pas à sauver l'animal; cependant Roux et Martin sont arrivés plusieurs fois à guérir des lapins ainsi infectés en répétant à plusieurs reprises les injections de sérum.

Roux et Martin ont essayé dans ces cas le mélange des deux sérums antistreptococcique et antidiphtérique, niais les résultats sont médiocrement satisfaisants (Voy. Streptocoque)-

Essai du sérum. — 1° Behring estime l'activité d'un sérum d'après la quantité nécessaire pour immuniser un gramme d'animal contre un volume de toxine sûrement mortel injecté douze heures après le sérum ; il dit, par exemple, qu'un sérum est actif au millième quand un centimètre cube de ce sérum immunise un kilogramme de cobaye contre une dose de toxine capable de tuer dans un délai connu.

Ce mode d'appréciation n'est pas très rigoureux, mais il a l'avantage d'être commode.

2° Behring employa ensuite une autre unité de mesure : l'unité est constituée par la quantité de sérum nécessaire pour immuniser

SÉROTHÉRAPIE.

5 000 grammes de cobaye (soil dix cobayes de 500 grammes) contre une dose dix fois mortelle d'une culture diphtérique âgée de deux jours, le sérum étant injecté vingt-quatre heures avant la culture; on apprécie ainsi la propriété thérapeutique du sérum contre l'infection et non contre l'intoxication.

3° Behring et Ehrlich ont adopté une nouvelle unité de mesure : l'imité immunisante ou unité antitoxique est représentée par 0cc,t d'un sérum qui, mélangé à 0CC,9 de toxine normale (tuant sûrement le cobaye à la dose de0cc,l),la neutralise au point que le mélange introduit sous la peau ne produise aucun œdème. Un centimètre cube d'un tel sérum contient donc 10 unités antitoxiques; un sérum dont 0CC,01 neutralise 1 centimètre cube de toxine contient 100 unités antitoxiques au centimètre cube, etc.

4° Roux adopte comme notation le pouvoir préventif, rapport entre la quantité de sérum nécessaire pour préserver de la mort un cobaye qui reçoit douze heures après l'injection de sérum une injection de un demi-centimètre cube d'une culture fraîche et bien virulente, et le poids du cobaye. Un sérum qui à la dose de 0,1 préserve un cobaye de 500 grammes, est dit actif au 1/5 000e, etc.

Dans la pratique il est utile de contrôler l'une par l'autre les deux méthodes de Behring-Ehrlich et de Roux : on dit, par exemple, qu'un sérum possède 100 unités antitoxiques au centimètre cube, et qu'il est préventif au 1 /50 000e.

Un sérum actif à 1 /50000e suffit pour le traitement de la diphtérie humaine, maison obtient aisément du sérum actif au I /70 000e et au 1 /100000e. Le sérum préparé à l'Institut Pasteur avec les anciennes toxines possédait 100 unités antitoxiques par centimètre cube et était préventif au I /50 000c ; aujourd'hui le sérum préparé avec les toxines en bouillon de Martin, dix fois plus actives, possède 200 unités antitoxiques et est préventif au 1/100000°.

Applications thérapeutiques. L'application de la sérothérapie au traitement de la diphtérie humaine a donné les résultats que permettait de prévoir l'expérimentation sur les animaux; la sérothérapie de la diphtérie constitue aujourd'hui un des plus beaux chapitres de la thérapeutique.

Le sérum est injecté à des doses, de 10 à 20 centimètres cubes données une fois ou répétées suivant la gravité des cas ; ce n'est pas ici le lieu d'insister sur la pratique du traitement.

L'action préventive du sérum a été utilisée pendant des épidémies de diphtérie ; l'immunité ainsi conférée est peu durable (trois semaines à deux mois). La dose préventive est de 5 centimètres cubes de sérum (Roux).