DISSÉMINA TION EN MILIEUX SOLIDES LIQUÉFIES

Soit à isoler les germes contenus dans une goutte d'eau. Nous portons cette goutte d'eau dans un tube de gélatine liquéfiée au

PROCÉDÉS MÉCANIQUES

bain-marie et nous mélangeons intimement. Les germes de la goutte d'eau se répartissent dans la gélatine; coulons maintenant ceUc gélatine en couche mince sur une plaque de verre et refroid i>sons-la rapidement : les microbes se trouvent disséminés et enrobés

Fig. 61. — Aspect de colonies microbiennes sur plaque de gélatine (grandeur naturelle).

dans la couche de gélatine comme les amandes dans la pâte d'un nougat; si nous exposons la plaque à une température favorable, chaque microbe germera isolément et donnera naissance à une colonie constituée par des individus provenant du germe unique initial, et par conséquent pure. 11 sera aisé dès lors de reprendre

84 ISOLEMENT DES GEHMES.

chacune de ces colonies et de les réensemencer sur des milieux neufs.

La mise en pratique de ce procédé peut être réalisée de différentes façons, mais elle est toujours subordonnée aux règles suivantes :

1° Axant d'ensemencer la gélatine liquéfiée, la laisser refroidir suffisamment (30° à 40°) pour que les germes ne soient pas détruits par la température du milieu;

2° Opérer à l'abri de toute contamination ; '

3° Placer les plaques à Vabri des poussières atmosphériques.

A. Hottes de Pétri. — Procédé recommandé. — Instrumentation. — Trois boites de Pétri (fig. 62) enveloppées de papier filtre et flam-

Fig. 62. — Boites de Pelri.

bées au four Pasteur (préparer d'avance une provision de ces boîtes) ; Trois pipettes de Pasteur ; Trois tubes de gélatine.

Opération. — 1° Liquéfier au bain-marie la gélatine des trois tubes.

Ne jamais exposer directement les tubes à la flamme pour liquéfier la gélatine ; il se produirait dans le milieu des bulles d'air qui gêneraient les observations ultérieures.

2° Prélever à l'aide d'une pipette Pasteur, en prenant les précautions d'usage, une goutte du liquide dont on veut isoler les germes.

Porter cette goutte dans un tube de gélatine (tube I) en observant les règles ordinaires; replacer le bouchon d'ouate du tube et assurer le mélange exact en roulant rapidement le tube entre les deux mains.

Ne jamais mélanger en agitant le tube de haut en bas comme on le fait en chimie, la gélatine produirait, ainsi une mousse fort gênante.

3° Avec une nouvelle pipette Pasteur, prélever trois gouttes dans le tube I et les reporter dans le second tube de gélatine liquéfiée (II) ; mélanger comme plus haut.

4° Prélever de même trois gouttes du tube 11 et les ensemencer dans le troisième tube de gélatine (III).

On obtient ainsi trois dilutions différentes de la semence; suivant que celle-ci contenait beaucoup ou peu de germes, la dilution III ou la dilu-

PROCÉDÉS MÉCANIQUES

tion I donneront les résultats les plus favorables. S'il y a beaucoup do. germes, par exemple, leur abondance rendra les colonies confluentes et généra l'isolement sur la plaque préparée avec la dilution I : on se reportera alors aux dilutions II et NI.

5° Débarrasser une boîte de Pétri de son enveloppe de papier.

Déboucher purement le tube I, en flamber l'orifice dans la flamme d'un bec de Bunsen. Soulever le couvercle de la boîte de Pétri, couler la gélatine dans la boîte, replacer rapidement le couvercle. Communiquer quelques oscillations à la boîte pour étaler la gélatine en couche uniforme, puis déposer la boîte sur une surface horizontale et froide et laisser la solidification se produire. Cela fait, étiqueter et placer à l'étuve à 20°.

6° Opérer de même pour les tubes II et Ul.

7° Examiner chaque jour les boites, noter le développement des colonies, leurs caractères (examen à l'œil nu et à la loupe à travers la paroi de verre de la boite) ; enfin prélever avec une ose un échantillon de chaque colonie pour les examens microscopiques et les réensemencements.

Remarque. — Cette méthode présente quelques inconvénients et ne peut être appliquée dans tous les cas :

a. Certains microbes liquéfient rapidement la gélatine, l'isolement se trouve ainsi compromis et interrompu.

b. Ce procédé ne convient qu'aux bactéries cultivant à des températures inférieures à + 20° ou 23°, la gélatine se liquéfiant à 25°.

Aussi a-t-on recours dans certains cas, et particulièrement dans la recherche des bactéries pathogènes, aux plaques préparées avec la gélose. On opère alors comme précédemment en tenant compte des observations suivantes :

1° La gélose solidifiée ne se liquéfie qu'entre 60° et 100°, mais elle reste alors liquide jusqu'à + 40°. Les tubes de gélose seront donc liquéfiés dans l'eau bouillante, puis on les laissera refroidir jusqu'à ce que leur température soit aisément supportée par la main.

2° Ensemencer alors les tubes comme il a été dit plus haut, mais opérer très rapidement la confection des boites, sans quoi la gélose se solidifierait et formerait des grumeaux dans les tubes.

Il est bon, pour éviter la production de grumeaux lors du refroidissement dans les boites, de placer celles-ci, avant que d'y verser la gélose, sur une platine contenant de l'eau à 40o-45o (Yoy. plus bas) et de ne les laisser refroidir que progressivement.

0 Placer les boîtes à l'étuve à 37° ; pour empêcher la dessiccation la gélose, disposer les boites dans une chambre humide consti-

ISOLEMENT DES GEHMES.

luéepar un cristallisoir à cloche dans le fond duquel on dispose une feuille de papier filtre imbibée d'eau.

On pourrait opérer de môme avec Vagar-gélatîne pour les cultures devant être maintenues entre 20° et 30°.

B. Plaques de Koeh. — Instrumentation. Troie Lames de verre mesurant environ 9culX*2CI", enveloppées séparément dans

du papier et stérilisées au four Pasteur (tenir préparée une provision de ces plaques).

Trois bancs en verre destinés à supporter les lames.

Un cristallisoir à cloche constitué par deux cristallisoirs d'environ 20 centimètres de diamètre, s'emboitant l'un dans l'autre.

Une table refroidissante constituée par une boite métallique plate dont la face supérieure est soigneusement dressée et recouverte par une cloche G (fig. 64); la boîte estsupportée par des vis calanles; par

Fig. 63.

Banc de verre pour culture sur plaques.

Fig. 64. — Platine refroidissante pour plaques de gélatine.

les deux ajutages A1 et A3 on peut y faire circuler un courant d'eau froide (ou chaude quand on opère avec la gélose) et une ouverture à vis B permet d'y introduire des morceaux de glace. Un niveau d'eau N sert à donner à l'appareil une position horizontale.

Trois tubes de gélatine liquéfiée au bain-marie el trois pipettes Pasteur.

Opération. — 1° Verser dans le cristallisoir à cloche une petite quantité de la solution de sublimé acide et en renversant el agitanl l'appareil assurer le contact du sublimé avec tous les points de ses parois intérieures.

Disposer dans le fond du cristallisoir une rondelle préparée avec deux ou trois doubles de papier filtre el imbibée de la solution de

PROCÉDÉS MÉCANIQUES

sublimé. (Cette disposition, dite chambre humide, a pour but d'empêcher la dessiccation des plaques de gélatine )

Laver également les bancs de verre avec le sublimé, placer un de ces bancs sur le fond du cristallisoir.

2° Disposer horizontalement sur la table (à la gauche de l'opérateur) la platine refroidissante pleine d'eau froide ou glacée. Le plateau supérieur de l'appareil est essuyé avec soin pour le débarrasser de toute poussière, l'intérieur de la cloche est lavé au sublimé.

3° Ensemencer les trois tubes de gélatine ï, II, III comme il a été dil pour le procédé précédent.

4° Prendre une des plaques de verre, déchirer le papier qui l'entoure suivant un de ses bords, saisir un coin de la plaque entre le pouce et l'index de la main droite, la dégager vivement du papier et la porter sur la platine refroidissante dont la cloche est légèrement

Fig. 6;>. — Disposition des plaques dans le cristallisoir.

soulevée par la main gauche de l'opérateur; laisser retomber la cloche au-dessus de la plaque.

5° Déboucher aseptiquement le tube III, passer dans la flamme sa partie supérieure sur une hauteur de 2 à 3 centimètres, l'engager sous la cloche de verre légèrement soulevée; verser la gélatine au centre de la plaque, l'y étendre largement à l'aide de la partie flambée du tube. Retirer le tube, reposer la cloche, attendre la solidification de la gélatine.

6° La solidification achevée, soulever de nouveau la cloche, saisir avec la main droite un des coins de la plaque, retirer celle-ci de dessous la cloche, la porter vivement dans la chambre humide (dont le couvercle est soulevé par la main gauche de l'opérateur qui vient d'abandonner la cloche de la platine) et la déposer sur le banc de verre.

Placer immédiatement le second banc de verre, en pont, au-dessus de la plaque, laisser retomber le couvercle de la chambre.

88 ISOLEMENT DES GERMES

La gélatine do la plaque n'a jamais aucun contact ni avec la paroi de la chambre humide ni avec les bancs de verre : c'est pourquoi le sublimé peut être employé pour la stérilisation de ces appareils.

7° Préparer de même une plaque avec le tube II, la placer dans la chambre humide, disposer au-dessus le troisième banc.

8° Terminer en préparant une plaque avec le tube I ; la placer sur le troisième banc.

9° La chambre humide est maintenue à + 20°. Les plaques ont été disposées dans cetle chambre de façon que la plaque la plus chargée en germes se trouve à la partie supérieure : c'est sur elle que les premières colonies apparaîtront; on pourra l'examiner et l'étudier sans toucher aux autres plaques que l'on ne découvrira qu'à mesure de leur développement.

Inconvénients. — 1° Ce procédé, assez élégant, a l'inconvénient d'exiger des manipulations compliquées, difficiles à exécuter rigoureusement.

2° Les plaques pendant les manipulations sont nécessairement exposées pendant quelques secondes à l'air et peuvent se contaminer; cette exposition a peu d'inconvénients si on opère très rapidement dans une atmosphère calme ne contenant pas de poussières en mouvement.

3° Pour examiner les plaques on est forcé de les découvrir et de les exposer à l'air, elles se contaminent rapidement et l'observation perd sa rigueur.

G. Tube d'Esmarch. — Instrumentation. — Trois pipettes Pasteur;

Trois tubes de gélatine ; ces tubes doivent être un peu plus longs et un peu plus larges que les tubes à culture ordinaires; chacun renferme 10 centimètres cubes de gélatine stérile;

Trois capuchons en caoutchouc stérilisés.

Opération. — 1° Ensemencer les trois tubes 1, II, III, comme il a été dit plus haut.

2° Couvrir l'orifice de chaque tube, au-dessus du bouchon d'ouate, avec un capuchon de caoutchouc.

3° Porter successivement chaque tube au-dessous d'un robinet d'eau froide, incliner le tube de telle sorte que la gélatine se répartisse sur toute sa longueur (sans atteindre le bouchon d'ouate) et lui imprimer un mouvement rapide de rotation en maintenant les deux extrémités entre le pouce et l'index de chaque rnain. La gélatine se solidifie en formant un revêtement régulier sur toute la surface interne du tube, on obtient une plaque enroulée en cylindre.

4° La solidification terminée, retirer le capuchon de caoutchouc et porter les tubes à l'étuve à 20°.

Ce procédé a le grand avantage de soustraire complètement les cultures

PROCÉDÉS MÉCANIQUES

à toute cause de pollution, mais l'étude des colonies est rendue peu aisée par la forme cylindrique de la plaque de gélatine.