CHAPITRE YIII

TRAITEMENT DES PRÉPARATIONS MICROSCOPIQUES PAR LES RÉACTIFS ET LES MILIEUX COLORANTS

L'emploi des réactifs que nous avons sig'nalés au chapitre ii facilite l'examen des pièces qui ont été durcies, mais non colorées; la glycérine pure ou diluée dans son Aolume d'eau convient particulièrement pour cela.

Parmi les méthodes de dissociation des coupes, mentionnons l'enlèvement de parcelles à l'aide du pinceau, ou au moyen de secousses ou de la digestion artificielle.

Les deux premières méthodes sont surtout employées pour examiner le stroma conjonctif des organes glandulaires, des tumeurs, et particulièrement du cancer, alors qu'on en a écarté les cellules.

1. Méthode du^nnrectu. — Voici comment on la pratique. La coupe étant étalée sur le porte-objet, on la fixe d'un côté avec l'aiguille et l'on passe sur elle un pinceau à différentes reprises, en allant de l'aiguille au côté opposé. On peut opérer tout aussi bien dans un récipient contenant de l'eau.

2. Méthode des secousses. — On met la coupe dans un tube à réactif, en partie rempli d'eau, et on l'agite jusqu'à ce que les cellules se soient détachées.

3. Digestion artificielle, — Elle n'est pas d'un usage fort répandu en histologie pathologique. On place les coupes ou les fragments pendant plusieurs jours à l'étuve dans une solution de trypsine, puis dans un tube à réactif, où on les agite avec de l'eau, et l'on examine dans la solution de sel marin.

Pour préparer la solution de trypsine, on soumet un pancréas de veau frais à l'action d'un mélange d'alcool et d'éther, dans un appareil extracteur, jusqu'à ce qu'on obtienne une masse blanche très friable. On porte cette masse dans cinq à dix parties d'une solution d'acide salicylique à 0,5 % , àla température de 40", pendant trois à quatre heures, et on filtre.

La trypsine détruit les cellules et la substance conjonctive, en conservant les parties fibrillaires.

I, Technique générale de coloration.

Traitement et conservation des coupes après coloration. — La technique moderne des colorations est basée sur ce fait que les tissus affectent des affinités différentes pour les colorants qui mettent en évidence certains d'entre eux, alors qu'ils peuvent rester sans action sur d'autres tissus voisins.

Cette affinité des tissus à l'égard de ces produits se manifeste souvent après une simple coloration qui met en relief certains éléments. Tantôt tous les tissus d'une coupe peuvent être affectés d'une façon uniforme, mais tantôt l'un d'entre eux seulement peut rester inattaqué par des procédés de décoloration qui réagissent d'une manière positive sur les autres.

Le fait suivant surtout est important : les parties constitutives de la cellule, le protoplasma et le noyau, ne se comportent pas Tune comme l'autre vis-à-vis des matières colorantes : ainsi, le premier reste incolore ou à peu près, alors que le noyau prend une teinte isolée ou prédominante. Ce sont là des colorants nudèaires; ils jouent le plus grand rôle en technique histologique. On peut obtenir une différenciation plus nette encore des tissus par lamétliode de la douhle [ov\.de la triple] coloration^ qui consiste à faire agir des produits différents consécutivement ou simultanément dans la nuMuo solution ; on met de la sorte en évidence certains tissus, ou, s'il s'agit de cellules, on dift'érencie le protoplasma du vioyau par des teintes dift'érentes.

Avant d'aller plus loin, il faut insister sur ce fait que, bien qu'il existe de très nombreux procédés de coloration des pièces d'anatomie pathologique, m\ petit nombre cïeiitre eux doit suffire à presque tous les cas. Exemples : la safranine, le picro-carmin lithiné de Orlh, l'iiématoxyline en solution glycérinée acétique, l'iiémalun.

Règles générales de coloration.

Voici les règles générales d'après lescpielles on emploie les matières colorantes.

1° Il faut toujours filtrer les solutions avant de s'en servir; aussi est-il prati(iue de tenir les flacons fermés à l'aide d'un petit entonnoir en verre dans lequel on a placé un filtre. Celui-ci peut, en général, servir pendant quatre à six semaines.

1" Il faut que les coupes soient toujours étalées avec soin dans les liquides colorants et qu'elles ne reposent pas directement l'une sur l'autre : sinon, il y aurait des points qui ne seraient pas suffisamment colorés, tandis que d'autres pourraient l'être trop. Aussi recommande-t-on de

déplacer les coupes de temps en temps et avec précaution, au moyen d'une aiguille ou par insufflation. Il est surtout important d'employer de grands récipients et de grandes quantités de solutions colorantes; celles-ci seront reversées dans le flacon après usage, et conservées (1).

3° Le temps nécessaire à une bonne coloration n'est pas invariable : il ne dépend pas seulement de l'ancienneté du liquide, car les solutions vieilles colorent avec plus d'intensité et plus rapidement que les autres; le mode de durcissement, de conservation, et l'âge de la préparation jouent également leur rôle. Les anciennes préparations se colorent souvent plus lentement et d'une façon moins intense que les fraîches. Enfin, les cellules des divers organes se comportent d'une façon différente.

Il y a des colorants qui ont une affinité spéciale pour les noyaux, et que l'on appelle colorants des noyaux. Les plus employés sont le carmin, Fliématoxyline et les couleurs d'aniline. Parfois même ce sont certaines parties du noyau, la chromatine, qui fixent la couleur. Il en est ainsi pour la safranine. Nous distinguons encore la coloration en coupe et \îi coloration en masse. Lapremière a sur la seconde les avantages suivants : elle agit rapidement; elle se prête mieux à la double coloration; son action peut être contrôlée à mesure sous le microscope, et elle permet en géne'ral l'utilisation de colorants beaucoup plus nombreux.

Le débutant peut commencer par se familiariser avec l'emploi du picro-carmin de Orlh, de l'bématoxyline de Bœhmer ou de Delafied, ou de Fhémalun.

On arrivera à colorer les objets résistants :

a) En les faisant séjourner même pendant vingt-quatre heures dans le bain colorant;

b) En employant une solution fortement concentrée ;

c) En chaufl'ant le bain colorant et surtout en le faisant séjourner à l'étuve.

Le lavage des coupes, surtout dans l'eau distillée, doit se faire avec soin et être continué jusqu'à ce que l'eau ne se colore plus. Après cela, il est souvent utile de laisser séjourner la coupe pendant plusieurs heures dans une grande quantité d'eau distillée.

Montage des coupes. — A part quelques exceptions, les coupes seront montées, examinées et conservées, soit dans la glycérine, soit dans le baume de Canada. On examine les coupes colorées dans les milieux très réfringents : glycérine, xylol, essence de girofle. Mais, si l'on veut conserver, on aura recours a des produits qui sont transparents et déterminent une altération minima des préparations et des couleurs. On s'adresse en général à certaines résines : leur indice de réfraction est considérable et

(l) Pour les coupes qui baignent dans les liquides colorants, il peut être utile de se servir du « chercheur de coupes d'Obersteiner », dans l'Intérieur duquel est placé un miroir ; il suffit de placer le verre de montre avec le bain sur la paroi supérieure de la boite.

TRAITEiMENT DES PRÉPARATIONS MICROSCOPIQUES

permet d'examiner distinctement les objets colorés. Le xylol ne convient pas parce qu'il s'évapore; de même l'essence de girofle, qui altère un assez grand nombre de colorants. La résine d'ammar ne convient pas non plus pour le montage, surtout pour celui des préparations à l'hématoxyline.

i . Montage dans la glycérine. — Les coupes peuvent être portées dans la glycérine immédiatement après avoir été sorties de l'eau distillée ; mais les coupes à l'hématoxyline seront déshydratées au préalable, de la façon suivante : on les enlève sur une spatule où l'excès d'eau est absorbé avec du papier à filtrer, ou bien on les porte sur la lamelle avec de l'eau, on enlève celle-ci au moyen de papier à filtrer, et l'on ajoute la glycérine dont on peut ainsi mesurer la quantité nécessaire d'une manière plus précise.

Comme les coupes portées directement dans la glyce'rine se ratatinent parfois, il peut être utile de les faire passer au préalable par la solution physiologique de sel marin, de déposer la glycérine sur le bord du couvre-objet et de mettre le tout à l'abri de la poussière pendant quelques jours ; f eau s'évapore et est remplacée par la glycérine. Pour les préparations délicates (échinocoques), on peut même se servir du mélange deMcr/cel (eau distillée, alcool rectifié et glycérine à parties égales) où on les porte directement; l'eau et l'alcool s'évaporent rapidement [iNeelsen(l)].

Lorsque l'on veut conserver les coupes incluses dans la glycérine, on commence par les soustraire à l'action de l'air de la façon suivante.

Bordage. — On entoure d'abord les bords du couvre-objet d'une mince bande de cire molle; — on peut se servir d'un bâton de cire qu'on vient d'éteindre et qu'on porte, en traînée légère, sur le bord de la lamelle; si la lamelle se déplaçait pendant ces manipulations, on la fixerait avec une goutte de cire fondue. Pour réussir, il est nécessaire qu'il n'y ait pas de liquide en excès sur les bords; s'il y en avait, on l'absorberait avec un morceau de toile trempé dans l'alcool absolu (2).

Dans le cas où l'on veut conserver indéfiniment les préparations, on recouvre la bande de cire de laque d'asphalte, de laque du commerce, de telle sorte que celle-ci empiète sur la surface du couvre-objet. Aussi la bande de cire doit-elle être mince. Pourtant, il n'est pas à conseiller d'appliquer la laque directement, car elle reste liquide pendant quelque temps et pénétrerait par capillarité sous le deckglas.

(1) F. Neelsex, Grundriss der pathologisch-anatomisch Technîk. Stuttgart, 1892, p. 55.

(2) On a construit des tables tournantes pour le bordage des lamelles rondes; on fait coïncider le centre de la lamelle avec l'axe de l'appareil et on l'y fixe. Puis on tourne, et ou dépose sur le bord du couvre-objet, avec un pinceau, de la gomme laque liquéfiée, du vernis à la laque Kaiser, par exemple.

Nombreuses sont les recettes de bordage ou lutage à la gomme laque [la laque Krœnig, obtenue par fusion de deux parties de cire dans huit de colophane, rend de signalés services] ; mais la méthode que nous venons d'indiquer suffit, d'autant plus qu'on emploie rarement l'inclusion glycérinée en anatomie pathologique.

Les préparations colorées par l'aniline ne peuvent être conservées dans la glycérine, qui dissout celle-ci à mesure. Seul le brun de Bismarck fait exception.

2. Acétate dépotasse. — L'inclusion 'dans l'acétate de potasse (solution saturée) se pratique d'après le même procédé. Cet agent est surtout recommandable pour les préparations colorées par l'aniline lorsque le baume de Canada, qui mérite en général la préférence, n'est pas indiqué. De même pour les préparations à l'acide osmique, qui brunissent la glycérine.

3. Baume de Canada. — En anatomie pathologique, c'est l'inclusion au baume de Canada, dissous dans le xylol, qui est la plus employée. Il faut déshydrater complètement les coupes qui, sans cela, se troubleraient.

Déshydratation des coupes. — On porte les coupes pendant trois à cinq minutes dans l'alcool du commerce à 96°, puis dans l'alcool absolu, pendant un temps variant avec leur nombre. Celles qui sortent de l'eau tendant à se recroqueviller dans l'alcool fort, on les portera d'un liquide dans l'autre, en plaçant au-dessus d'elles un morceau de papier à filtrer; il est plus simple encore de se servir d'une spatule qu'on ne retire de l'alcool que quand la coupe est durcie. En outre, cet inconvénient peut être évité par l'emploi, avant l'alcool absolu, de l'alcool à 96° dans lequel on étale la coupe avec une aiguille. Ce procédé est meilleur que celui qui consiste à se servir directement de l'alcool absolu qu'on renouvelle une fois.

Mais, l'alcool absolu ne se mélangeant pas complètement et immédiatement avec le baume de Canada au xylol, il est bon de porter la coupe pendant une à trois minutes dans un produit qui, d'une part, se combine à l'alcool et, d'autre part, a la propriété d'éclaircir et de rendre transparente la préparation.

Les produits de ce genre sont des huiles éthérées.

4. Huile de térébentihîse. — Elle n'est plus guère employée que pour les préparations injectées au bleu de Berlin, auxquelles elle donne une belle nuance.

5. Essence de girofle ou d'oeillet. — Si elle est souvent employée, c'est qu'elle n'est pas sensible à la faible quantité d'eau qui pourrait rester dans la coupe. Mais elle ne convient pas pour les préparations à la celloïdine, car elle dissout cet agent, ni pour celles où entre l'aniline, qu'elle dissout en donnant à l'ensemble un ton mat et sale.

G. L'iiuiLE DE BERGAMOTE éclaircit fort bien et est indiquée pour les préparations à la celloïdine, de même que I'iiuile d'origan, I'huile de cèdre et

l'uUILE de lavande.

Le xylol, additionné d'acide carbonique pur, est recommandable pour les préparations traitées par l'aniline et surtout pour les coupes de microbiologie. Elles s'y recroquevillent pourtant facilement.

En général, il suffît de laisser séjourner les coupes dans le milieu éclaircissant pendant deux à trois minutes. Celles qui sont épaisses peuvent y séjourner d'une demi-heure à une heure, et devenir transparentes au point d'être susceptibles d'un fort grossissement.

On peut étaler la coupe dans une goutte d'huile sur le porte-objet. Lorsqu'on a beaucoup de coupes, on les porte de l'alcool dans un récipient d'huile, puis, avec une spatule, de celui-ci sur le porte-objet; on enlève l'huile en excès au moyen du papier à liltrer, on recouvre la coupe avec une goutte de baume de Canada et on place le deckglas. Si le baume est épais, on l'étalera d'une façon régulière et rapide, en chauffant légèrement le porte-objet au-dessus de la flamme d'une lampe à l'alcool; s'il est liquide, on laissera la préparation pendant quelques jours à l'air libre, mais à l'aJu'i de la poussière.

Le baume de Canada du commerce est en général dissous dans l'essence de térébenthine; on fait évaporer celle-ci à G0°, puis on dissout dans le xylol. Le chloroforme est aussi un bon dissolvant, mais le xylol lui est préférable. On le conserve dans des flacons à bouchon en verre et portant une baguette de verre qui sert à verser le liquide par goutte.

Lorsque la coupe a été soumise à l'action du xylol, on la porte sur une lame de verre et on y dépose, après avoir enlevé l'excès du xylol, une goutte de baume et l'on met en place le couvre-objet, en évitant les grosses bulles d'air; les bulles de petites dimensions disparaissent dans la suite; on se gardera surtout de respirer sur la coupe, à cause du trouble que la vapeur de l'haleine déterminerait. On peut aussi chasser les bulles d'air en les remplaçant par du xylol, et déposer ensuite, sur le bord du couvre-objet, du baume de Canada qui sera aspiré par suite de l'évaporation même du xylol (Boehm et Oppel). De même, s'il se produisait au bout de quelque temps un vide dans la préparation, on déposerait une goutte de baume sur le bord de la lamelle et on chaufferait avec soin soit à l'étuve, soit au-dessus de la flamme d'une lampe à alcool.

Pour examiner à l'immersion homogène les préparations ainsi montées, il faut que le baume soit solidifié. On accélère ce temps des manipulations par un séjour à l'étuve à bO°.

Gomme l'indice de réfraction du baume est très élevé, on a essayé de le remplacer par la résine d'ammar — mélangée par parties égales à la benzine et à l'huile de térébenthine — dont le pouvoir éclaircissant est moins intense que celui du baume.

Résumé. — Voici dans quel ordre se suivent les manipulations des coupes colorées qu'on inclut dans le baume de Canada : 1° Colorer;

2** Laver, en général, dans l'eau distillée;

3*^ Porter sur spatule dans l'alcool à 96% trois à cinq minutes;

4° Porter sur spatule dans l'alcool absolu, trois à cinq minutes;

5"* Huile éthérée ;

G*" Étaler sur le porte-objet;

7° Enlever l'excès d'huile avec du papier-filtre ;

8° Baume de Canada, couvre-objet;

9° Chauffer le porte-objet à une température peu élevée, si c'est nécessaire. II. Coloration des noyaux.

Hématoxyline alunée DE BoEHMER. — Prè})aration . Les cristaux d'hématoxyline du commerce sont dissous en petite quantité dans l'alcool absolu, mais de telle sorte que la solution soit concentrée et qu'il y ait même des cristaux en excès. On ajoute au mélange une quantité suffisante de solution aqueuse alunée à 1 % , pour lui donner une nuance allant du bleu clair au violet pâle, puis on l'expose pendant quelques jours à la ière dans un flacon ouvert. Cette solution devient ainsi bleu foncé et est prête pour la coloration. On a calculé qu'il faut une quantité d'environ 1/2 à 3/4 % d'hématoxyline dissoute. Comme la solution a un pouvoir colorant d'autant plus intense qu'elle est plus ancienne, on la diluera au bout de quelques semaines avec l'eau d'alun.

Mode d'em]ploi.

1° Coloration pendant deux à trois minutes ;

Lavage dans une grande quantité d'eau distillée ;

3° Séjour dans l'eau distillée pendant douze à vingt-quatre heures [mais, dans beaucoup de cas, on se contente d'un lavage de quelques minutes] ;

4"* Alcool, huile, baume.

L'hématoxyline est un des colorants les plus sûrs et les meilleurs, et convient à la plupart des tissus. La coloration des coupes se maintient, sans s'altérer, pendant de nombreuses années. Les noyaux y deviennent bleu intense ou violets, et le protoplasma bleu paie [la substance fondamentale du cartilage hyalin est colorée d'une façon intense].

Les coupes se colorent lentement dans l'hématoxyline fraîche, mais — on ne perdra pas ce détail de vue — deviennent plus foncées dans l'eau.

Une ou même une demi-minute suffisent pour les solutions anciennes [beaucoup conseillent, avant de l'employer, d'allonger le liquide avec de

l'eau]. Aussi est-il bon de contrôler le degré de coloration en portant des coupes, àdes intervalles rapprochés, dansl'eau distillée [aYecl'hématoxyline mûre, elles ont une teinte bleu clair, sans tourner au sombre], et, pour plus de précision encore, de les examiner dans la glycérine après les avoir lavées, ou dans l'essence de girofle après leur déshydratation. Si on en a le temps, on fait séjourner les préparations pendant douze heures au moins dans l'eau, après les avoir lavées avec soin. Ainsi le colorant est fixé, et la coupe ne deviendra pas plus foncée lorsqu'elle sera incluse dans le baume de Canada.

Dans les cas où les coupes sont trop colorées, ce qui arrive dans les solutions fortes, on leur enlève une partie de leur coloration en les faisant séjourner pendant plusieurs heures dans une solution aqueuse d'alun à 1 % [ou composée d'une goutte d'acide chlorhydrique pour 30 cent. cub. d'eau, ou d'un autre acide, tel que l'acide sulfurique, ou même d'acide oxalique dilué dans l'eau distillée], et ensuite, ce qui est de toute nécessité, pendant douze heures au moins dans l'eau distillée (1).

On évitera avec soin de mettre les préparations à l'hématoxyline en contact avec les acides [à moins qu'elles ne présentent un excès de coloration].

La solution d'hématoxyline alunée est fort stable, elle se conserve pendant une demi-année. Quand elle passe au rouge, elle devient inutilisable.

Il faut éviter de porter directement les coupes de l'hématoxyline dans l'alcool, qui produirait des précipités. Si elles se plissent ou s'enroulent dans l'alcool absolu, il sera parfois utile de les porter à nouveau dans l'eau qui leur fera perdre leurs plis. Celles qui ont été collées avec de l'albumine — le collage à Valhumine gUjcérinée de Maijer mérite, en ;5'e'néral, la préférence — sont portées au préalable pendant cinq minutes dans le xylol, puis dans l'alcool absolu et dans l'eau. Le collage est surtout avantageux par ce fait qu'il permet de contrôler au microscope le degré de coloration des coupes ; si les noyaux sont suffisamment imprégnés, on plonge le porte-objet dans l'eau, dans l'alcool faible, puis, après l'avoir fait égoutter, dans l'alcool absolu et dans le baume.

Mais la glycérine est d'un emploi peu commode et peu sûr pour les préparations permanentes, à cause de la grande facilité avec laquelle elle attaque les luts, de sorte que les préparations faites à la glycérine pure seront toujours d'une permanence problématique. On pare à cet inconvénient en combinant la glycérine avec la gélatine , de manière à former un composé, [a glycérine gélatinée, qui a la consistance d'une gelée à la température normale. Pour s'en servir, on fait fondre une petite portion sur le porte-objet, à l'aide d'une lampe à alcool,

(1) Mais l'action de l'acide peut être trop intense et la préparation passer au rouge : il suffit, dans ce cas, de la plonger pendant quelque temps dans l'eau de fontaine ou, ce qui est plus rapide, dans l'eau ammoniacale (une goutte d'ammoniaque pour 100 cent, cubes) (Boehm et Oppel).

on y introduit l'objet préalablement imbibé d'eau ou de glycérine, on pose une lamelle et on laisse refroidir. Gela suffit à la conservation des pièces [Lee et Henneguy (1)].

HÉMATOXYLINE DE DeLAFIELD.

Pour obtenir 600 centimètres cubes de liquide, on dissout 4 grammes d'hématoxyline cristalli sable dans 25 centimètres cubes d'alcool absolu. On verse ce mélange dans une solution aqueuse concentrée d'alun ammoniacal. On expose le liquide à la lumière pendant trois à quatre jours, dans un flacon ouvert, puis on ajoute 100 centimètres cubes de glycérine et autant d'alcool méthylique. On filtre de nouveau deux jours après.

En général, on allonge ce liquide avec de l'eau, avant de l'employer, et Ton colore comme avec l'hématoxyline de Boehmer. On lave dans une grande quantité d'eau, même à l'eau de pompe qui est légèrement alcaline et rend la coloration plus nette. Alcool absolu, essence de bergamote (pour empêcher la dissolution de la celloïdine par l'essence de girofle).

Essence de girofle. Baume de Canada.

On peut aussi employer Vhématoxyline en solution glijccrinée acétique, qui est d'un usage journalier dans certains laboratoires. On trempe les coupes dans un bain abondant, on lave largement, à plusieurs reprises, dans l'eau distillée.

L'hématoxyline convient parfaitement aussi pour la coloration triple bactériologique des coupes.

Hémalun de Mayer.

On dissout à chaud 1 gramme d'hématéine dans 50 centimètres cubes d'alcool ; on verse ce mélange dans un litre d'eau alunée (oO grammes d'alun), additionné de thymol; on filtre après refroidissement. L'hématéine existe dans le commerce sous le nom d'hématéine cristallisée, ammoniacale; elle est obtenue par évaporation, à la température ordinaire et à l'abri des poussières, d'une solution aqueuse d'hématoxyline à 1/20, additionnée d'ammoniaque caustique.

Les avantages de ce liquide sont très grands : il peut être employé aussitôt après la préparation; il imprègne les tissus profondément et convient pour les colorations en masse. Son action est rapide. Dilué, il ne produit pas d'excès de coloration.

Cochenille alunée de czocor :

Cochenille pulvérisée 1 gr.

Alun pulvérisé 1 —

Eau 100 —

Faire bouillir en agitant et réduire à 50 grammes. Filtrer après refroidissement et ajouter quelques gouttes d'acide phénique.

La coloration est très rapide et sans excès. On aura soin de laver les coupes à Teau avant de les passer dans l'alcool, qui précipiterait l'alun.

HÉMATOXYLINE ACIDE D'EnRLICH.

(l)BoLLES Lee et F. Henneguy, Traité des méthodes techniques de Vanatomie microscopique. Paris, 1887, p. 185.

Préparation :

Ilématoxyline Alcool absolu

2 gravîmes.

Ajouter à la solution :

Glycérine

Ea^u distillée

Acide acétit(ue glacial

60 cent. c.