Préparations sur lamelles
Il est nécessaire, pour colorer les préparations sur lamelles, d'extraire l'hémoglobine au moyen d'une solution aqueuse.
(1) On peut soumettre le sang à l'action des vajieurs osmiques: on peut aussi le mélaner directement au fixateur dans un verre de montre.
EXAMEN DES TISSUS ET DES ORGAiSES 131:
Hayem indique la solulion colorante d'ioclure de potassium iodée qui ne dissout pas l'hémoglobine. En imprégnant une préparation sèche de sang avec une solution de ce genre ayant une coloration d'un brun intense, toutes les parties renfermant de l'hémoglobine deviennent aussitôt brunes et même violettes.
Mais Ehrlich a montré que l'hémoglobine perd sa solubilité en chauffant de 120° à 150°, après l'avoir séchée à l'air, la préparation sur lamelles, pendant une ou plusieurs heures dans une capsule de cuivre. NikiforofT arrive plus facilement aux mêmes résultats en portant pendant deux heures les préparations sur lamelles, après les avoir séchées à l'air, dans un mélange d'alcool et d'éther à parties égales; on sèche ensuite et on colore.
Hayem recommande, dans le même but, l'action des vapeurs osmiques sur les préparations sèches. On dépose sur le couvre-objet une goutte de sang aussi petite que possible, on le recouvre d'un second qui sert à étaler la goutte, et qu'on retire ensuite avec précaution. Il faut avoir soin de toucher les verres avec des pinces et non avec les doigts qui, au point d'application, déterminent un cercle de vapeurs et altèrent ainsi notablement, d'après Ehrlich, les globules du sang.
La méthode de fixation de Nikiforoff (alcool absolu et éther aa 1/2 h.) fournit •le bons résultats. Cependant, on ne se contentera pas d'un seul mode de tixation. Après fixation par l'alcool-éther, baigner directement, ou après lavage à l'eau dans la matière colorante; après fixation à Hg Cl-, passer de "» minutes à i/2 heure dans l'alcool iodé, et 2 à 3 heures dans l'alcool absolu; après l'action de Tacide picrique, du Flemming, de l'Hermann, laver à l'eau courante pendant 12 à 24 heures. La fixation par la chaleur peut pre'céder l'action de ces liquides qui agissent alors comme mordants. En résumé, chaque procède' rend des services quand il est bien employé (De Buck).
Les variétés de cellules blanches du sang sont importantes à connaître pour l'examen de ce liquide. On en compte généralement cinq (1).
Petits hjmpltocytes . — Plus petits que les globules rouges, ils ont un noyau volumineux, nettement colorable, constituant la partie principale de la cellule dont le protoplasmaest limité à une zone péri-nucléaire très mince.
b). Grands lymphocytes. — Ils représentent un degré de développement ])lus avancé et sont 2 à 3 fois plus volumineux que les globules rouges; ils ont aussi un gros noyau; mais, contrairement à la première variété, ce noyau est entouré d'une zone protoplasmique plus large et est moins colorable que celui des petits lymphocytes. Ces deux variétés constituent 25 0/0 des globules blancs du sang normal.
(1) Voir classilicadons de Sliénoii et de Vander.slricht.
i32 EXAMEN DES TISSUS ET DES ORGANES
t). Éléments moiionucUés. — Ce sont des formes de transition qui se distinguent des grands lymphocytes par ce fait que leur noyau n'est pas régulièrement arrondi, mais présente un commencement de division Biédiane.
d) . Lewmnjtes jwlijnucléès. — Plus petits que les formes mononucléées de li'ansition, mais plus volumineux que les globules rouges. Ils ont un noyau multilobé ou plusieurs noyaux fortement chromatiques. Ils représentent environ 70 0/0 des cellules blanches du sang et possèdent la propriété d'émigrer.
e) . Cellules èosinopliiles. — Le noyau est moins opaque que celui des leucocytes polynucléés. Les granulations renfermées dans le protoplasma se colorent en rouge vif par l'éosine.
Ehrlich a aussi démontré que le protoplasma des globules blancs renferme, outre le noyau, des granulations qui se comportent d'une façon différente à l'égard des groupes d'aniline; aussi les divise-t-il en granulations a, P, Y, 0, £. Il s'agit là de différences chimiques bien réelles, ainsi que le démontrent les réactions diverses :
a). Milieux dissolvants : l'eau, les acides, l'alcool, la glycérine;
Ij), Volume, forme et réfringence;
c) . Résistance diverse aux températures élevées;
d) . Répartition de ces granulations dans le corps de la cellule.
A. Cellules èosinophiles. — Ce sont les plus importantes. Elles prennent une coloration intense, caractéristique, par les couleurs acides d'aniline, surtout par l'éosine.
Procédé de coloration :
1° On chauffe la préparation sur lamelle pendant plusieurs heures à V±0\
9.° On colore pendant plusieurs heures dans la solution acide d'hémaiôxyline-éosine d'Ehrlich (chap. viii).
3° On lave à l'eau et l'on sèche. Baume de Canada.
Les noyaux des globules blancs, aussi bien ceux des lymphocytes que des polynucléés, sont opaques, les noyaux des mononucléés gris brunâtre; les globules rouges deviennent rouge cuivre, et les granulations èosinophiles rouges.
S On peul aussi, la lamîUe étant traitée d'après C3lte méthode, faire la coloration dans un mélange de :
Aurantia ) ^
Induline • aa 2 grammes.
Eosine '
Glycérine 30 »
On lave à l'eau et l'on sèche. Baume de Canada.
Les noyaux sont colorés en bleu, les cellules éosinopliiles en rouge ou rouge noirâtre, et les globules rouges en rouge cuivre.
Si l'on veut colorer les cellules éosinophiles sans les noyaux, on se sert de la solution simple d'éosine. C'est la solution rouge, concentrée dans la glycérine, que l'on emploie de préférence, puis on lave à l'eau.
Pour un simple examen, on recommande de faire passer la lamelle trois fois à la flamme et de colorer dans la solution aqueuse alcoolique d'éosine, et ensuite dans le bleu de méthyle.
L'étude de ces cellules est très importante, car, ainsi que l'a montré Ehrlich, elles n'augmentent pas en nombre dans laleucocytose aiguë ordinaire, mais très notablement au contraire dans la leucémie. Elles sont rares dans le sang normal. Ehrlich base le diagnostic certain des cellules éosinophiles, non pas sur la coloration des noyaux dans une substance colorante acide, mais sur la présence de la chromophile qui ressort avec toutes les couleurs acides. Voici les solutions qui servent à assurer le diagnostic :
1° Solution concentrée (rouge) d'éosine dans la glycérine ; 2° Solution saturée d'induline dans la glycérine ; 3° Solution saturée aqueuse d'orange ; •4" Eosine-induline glycérinée.
La numération des cellules éosinophiles renfermées dans le sang peut se faire d'après le procédé de Zappert, cité par Legrain. Il se sert pour cela d'un compte-globules ordinaire. Le liquide de dilution est une solution d'acide osmique à i 0/0. Après avoir recueilli le sang dans la longue portion du mélan^^eur, il aspire du liquide de dilution jusqu'à moitié du renflement de l'appareil ; puis il le remplit avec la solution de :
Eau distillée F)5 parties.
Glycérine neutre 45 »>
Solut. aq. d'éosine 1 0/U 17 »
Il est nécessaire de brasser le mélange pendant 1 à 2 minutes pour fixer l'acide. On compte dans la chambre humide. Les cellules éosinophiles légèrement granulées sont rouge sombre.
B. Granulations hasophiles. — Elles se colorent avec les solutions basiques ordinaires d'aniline, c'est-à-dire avec les colorants des microbes : bleu de méthyle, violet de gentiane, fuchsine, brun de Bismarck, etc. Ace groupe appartiennent les granulations y et Les granulations y (MastzeUen) n'existent pas à l'état normal dans le sang de l'homme, mais sont très nombreuses dans le cas de leucémie. Les granulations o, qui prennent aussi les couleurs basiques d'aniline, se rencontrent dans les formes de transition mononucléées du sang humain.
i3i KXAMEX DES TISSUS ET DES ORGANES
Les granulations l)asopliiles 7 sont voUimineuses, les granulations c plus fines.
MÉTHODE d'eiirlicu pour les granulations. 1° Colorer pendant plusieurs heures clans :
Alcool absolu 50 grammes.
Eau 100 ' »
Acide acéti({ue glacial 12 gr. 5.
Dahlia, jusqu'à saturation presque complète.
Laver à Teau et enlever l'excès de colorant dans l'alcool.
Quant aux organes, il est nécessaire de les durcir dans ralcool; on colore pendant douze heures et on décolore par l'alcool.
MÉTHODE DE Westphal. — Lcs uoyaux sont colorés en même temps. Solution employée :
Carmin de Grenadier (carmin pur 2 gr., eau distillée 200 cent, cubes, alun o gr., faire bouillir, filtrer et
ajouter acide pliénique l cent, culie).
Acide phénique 100 centimètres cubes.
Glycérine 100 » »
Solution concentrée de dahlia dans l'alcool absolu. 100 n »
Acide acétique glacial 20 » »
Laver la lamelle colorée, sécher à l'air, inclure dans le baume de Canada.
Les cellules « Mastzellen » montrent des amas de granulations rouge violet ayant chacune une trace de noyau. Les autres structures nucléaires sont violettes ou bleues.
D'après le même auteur, le vert de méthyle impur colore très distinctement les granulations y en bleu violet et les noyaux en vert.
Coloration des gramdatlons o : séjour de dix minutes dans la solution fioncentrée aqueuse de bleu de méthyle, lavage à l'eau. Baume de Canada.
C. Granulations neutrophiles^ granulations e. — On les colore avec les solutions neutres d'aniline, composées d'un mélange de couleurs d'aniline acides et basiques. Elles sont très serrées dans les leucocytes polynu- €Îéés. On les rencontre aussi dans tous les leucocytes mononucléés du sang myélinique. Remarquons que certains auteurs prétendent que la réaciion, dite neutrophile, est plutôt éosinophile, oxyphile, les couleurs dites ueutres étant acides.
PrèjKiration :
1° On prépare les lamelles d'après la méthode d'Ehrlich :
2° On colore pendant plusieurs minutes dans un mélange de :
Solution aqueuse saturée d'orange 125 grammes.
Solution aqueuse concentrée de fuchsine acide avec
20 0/0 d'alcool 125
Ajouter :
Alcool absolu 75 irrammes.
Solution aqueuse saturée de vert de métliyle 12;j »
Après un repos suffisanl, la solution peut être employée. Mais, comme la fîltration la modifie, et qu'il se forme un précipité, on en prélève, dans la partie claire, une certaine quantité avec une pipette, et on la porte sur le couvre -objet.
3° On lave à l'eau. Baume de Canada.
L'hémoglobine prend une teinte jaune orange, les noyaux deviennent verdàtres, les granulations éosinopliiles gris sombre et les granulations neutrophiles violet intense.
Autres méthodes également très bonnes :
1" On colore pendant 5 minutes dans une
Rolution aqueuse concentr/'e de fuchsine acide 5 volumes.
On ajoule lentement en agilaiU :
Solution aqueuse concentrée de l)leu de niétlivle... 1 volume. Eau distillée 5 f.n-ammes.
2° Laver à l'eau, absorl)er l'excès avec le pa[)ier à filtrer; sécher à l'air. Baume.
liCs érythrocytes devienn(Mit rouges et les granulations e violettes. Liorini: i>'Ai{(»xso.\-Pitilipi» :
Orange G.. 1 solutions aqueuses
Rub.ne acide extra. ... saturées.
Vert de niethyle cristallise )
La solution s'éclaircit par sédimentation et on y ajoute :
Orange G o.") centimètres cubes.
Hubine acide ;>0 » »
l'^au distillée 100 » »
Alcool uO » »
Vert de méthvle 65 » »
Eau distillée.' 50 » »
Alcool 12 » »
Cette solution reste au repos quelques semaines. On colore pendant plusieurs heures. Laver dans l'eau, sécher à l'air, baume de Canada. Les noyaux deviennent verts, l'hémoglobine orange, les granulations £ rouge violet, les granulations a rouge jaune.
Il est très important de savoir que les granulations neutrophiles, granulations £, appartiennent aux leucocytes dits polynucléés, c'est-à-dire aux formes qui sont en diapédèse dans l'inflammation. Elles constituent la plus grande partie des globules blancs du sang normal. Le pus est surtout constitué par ces leucocytes à granulations neutrophiles.
