TECHNIQUE MICROSCOPIQUE

Remarques sur quelques points de technique histoiogique et bactérioiogique. Arch. clin, de Bordeaux, avril 1893. Prager nied. Wochens., 14 juin 1803. Jtevue des sc. nat. de l’Ouest, t. III, 1893. (Avec B. de Nab.as.)

Méthodes de fixation, de coloration, d’inclusion, de collage sur lame ; choix du microtomo.

Les champignons faviques se colorent-ils par le procédé de Gram? Journ. des connaiss.

Méthode dé coloration des préparations de sang par l’éosine et par le mélange d’éosinebleu de méthylène-méthylal. Thionine et acide picrique. Gas. hebd. des Se. méd. de Bordeaux, 1900.

Thèse inspirée :

H. GosTtER-ljALASDE. Etude pratique des réactifs colorants employés en technique microscopique. Bordeaux, 1900.

Procédé de coloration du sang par l’éosine et par le mélange d’éosine-bleu de méthylèneméthylal. Gaz. hebd. des Sc. méd. de Bordeaux, octobre 1900.

Coloration extemporanée à l’état frais des amibes de la dysenterie. Gaz. hebd. des Se. méd. de Bordeaux, 2 février 1902, n" S, p. 57.

Délayer sur lame un peu de mucus de dysentérique dans une goutte de solution de rouge neutre h saturation dans l’eau salée physiologique. Recouvrir d’une lamelle sans écraser. L’endoplasme se colore avec ses diverses inclusions on

■lamaoroglossitei

Thionine et acide picrique. Gaz. hebd. des Sc. méd. de Bordeaux, octohre 1900.

Thionine picriquée après imprégnation argentique des spirochètes. Gaz. hebd. des Sc. méd. de Bordeaux, 2 mai 1909. Une note plus succincte sur ce sujet a été communiquée à la Société de biologie de Paris, 1" mai 1909. (Avec R. Dcpiaié.)

L’un de nous a, dès 1897, et à plusieurs reprises depuis lors, préconisé l’emploi dans la technique histologique de la thionine et de l’acide picrique en colorations successives, emploi qui a été, bien après lui, recommandé par maints histologistes, entre autres par Schmorl(1899). Voici comment Sabrazès recommande de procéder :

Sur les coupes collées à la gélatine formulée, déparatfinées, bien hydratées, on dépose une goutte de thionine phéniquée préparée d’après une formule classique,

par exemple la suivante :

Thionine. 0 gr. 70

Acide phénique cristallisé. 2 grammes

Alcool à 95». 10 cc.

Eau distillée. 100 cc.

La coloration se tait presque instantanément ; on lave la coupe à fond par l’alcool absolu, puis on la traite par le xylol ou par la benzine; on dépose, non loin de ses bords, deux petits cristaux d’acide picrique; on fait osciller la lame pour que la préparation soit lécbée un certain nombre de fois par ces liquides ; la coupe prend un ton vert pré; on élimine alors les cristaux d’acide picrique; on rince au xylol ou à la benzine et on monte dans le baume. Les diverses modalités du noyau, le cytoplasme et ses inclusions, les dégénérescences muqueuse, colloïde, amyloïde, les types cellulaires divers, plasmazellen, mastzellen, etc., sont parfaitement différenciés.

Nous avons eu l’idée d’appliquer notre procédé de coloration par la thionine picriquée aux préparations de pièces syphilitiques imprégnées à l’argent. Les résultats sont très favorables. Non seulement cette coloration exécutée comme ci-dessus, mais en faisant agir la thionine un peu plus longtemps (une ou deux minutes), conserve ses diverses affinités nucléaires et protoplasmiques, mais encore elle laisse intacts les spirochètes imprégnés en noir par l’argent : ils tranchent avec une extrême netteté sur le fond jaune verdâtre du tissu. L’étude des réactions anatomo-pathologiques des divers organes vis-à-vis des spirochètes est relativement simplifiée sur de semblables préparations. De plus, les rapports des parasites avec les cellules et les fibres sont d’une détermination facile.

L’imprégnation argentique d’un grand nombre d’organesd’hérédo-syphilitiques

sûreté de ce moi .utilisés jusqu'à présent.

ipériorité

les procédés

Procédé nouveau, simplifié, de mise en évidence, par coloration, du spirochète de la syphilis dans les frottis. Gaz. hebd. des Se. méd. de Bordeaux, 18 février 1912.

Chromophilie comparée des spirochètes. Gaz. hebd. des Se. méd. de Bordeaux, 25 lévrier 1912.

Sur frottis desséchés depuis quelques instants et vingt-quatre à trente heures tout au plus, le spirochète de la syphilis {Treponertia Schaudinn) prend le Ziehl idilué séance tenante au quart), entre lame et lamelle ; il devient rose et on le fait virer au rouge en répétant la coloration après une première dessiccation de la préparation colorée et en la réchauffant très légèrement par le rayonnement d’un objet métallique chaud. Le bleu de méthylène à 1/800, dans les mêmes conditions, ne le révèle pas.

Le spirochète des poules (Spirochœta gallinarum), dans le sang de cet animal ou dans celui du callat inoculé, se comporte comme celui de la syphilis au contact du Ziehl, mais prend faiblement le bleu.

Ainsi, l’agent de la syphilis est chromophobe en présence du bleu et moyennement chromophile pour le Ziehl; celui de la spirochétose des poules faiblement chromophile pour le bleu et un peu plus colorable par le rouge.

Examinons de même le parasite de la fièvre récurrente d’Afrique (Spirochœta Dutloni) sur des frottis très récents de sang de souris inoculée : bleu de méthylène et Ziehl colorent ces spirochètes vivement et presque instantanément ; ils sont très chromophiles, tout autant sinon plus que les divers spirochètes, d’ailleurs plus gros et plus facilement reconnaissables, de la bouche, des organes génitaux, etc. Les spirochètes buccaux prennent si avidement et si nettement le rouge et le bleu qu’on ne saurait, contrairement à ce qu’on a prétendu, les confondre, en raison de leur colorabilité et de leurs dimensions nettement supérieures, avec le tréponème de la syphilis.

Au moment où on renverse sur la lame chargée la lamelle avec sa gouttelette colorante en son milieu, le point de contact de la gouttelette et du frottis peut provoquer une formation locale de voiles et de précipités granuleux: mais

le en évidence des

polaires du

sèches non fixées. Application à la bacille diphtérique. Ibid., 9 mai 1909.

Mode d’emploi et nouvelles applications de la coloration des frottis par le bleu de méthylène en solution aqueuse à 1/500, entre lame et lamelle. Ibid., 12 décembre

leurs nucléoles, leucoblastes, myélocytes et neutrophiles h granulations plus foncées que celles des polynucléés de mémo type à fines granulations à peine bleutées, éosinophiles à gros grains verdâtres, mastzellen métachromatiques, etc., etc., ainsi que les divers hématozoaires endo- ou extra-globulaires.

Veut-on d’ailleurs obtenir des préparations polychromes, on met sur la lamelle couvre-objet une trace d’une solution alcoolique d’éosine dite française (‘) et, par-dessus cette fine gouttelette, une goutte de la solution de bleu de méthylène à

et un bon éclairage artificiel favorisent l’observation. On distingue facilement ainsi et on dénombre les divers types d’hématies ordinaires, granuleuses, à ponctuations basophiles, nucléées, à restes nucléaires, comme on peut s’en assurer sur cet objet d’études proposé par nous en 1900 et universellement adopté à cet effet, le sang du cobaye intoxiqué par le plomb. Globulins, hémoconies, espèces leucocytaires, nucléoles, mitoses dos leucoblastes. myélocytes des leucemies tranchent ainsi remarquablement.

Cette méthode au bleu dilué, régléejpar nous dans une série de notes, commode, sûre en cytologie (dépôts d’urine, de liquide céphalo-rachidien, d’épancheinents des séreuses, de kystes, etc.) n’est pas moins précieuse en parasitologie et bactériologie.

Grâce à elle, nous découvrîmes sans difficulté le trypanosome de la torpille, décrit avec L. Muratet. Son utilité, dans la recherche des hématozoaires de la malaria (karyosome violet, cytoplasme bleu) ressort clairement de notre note à la Gazette du 2 janvier 1910 et d’un travail avec figures dans les Archives des maladies du cœur et du jonÿ; cette technique nous a permis de noter, dans certains cas, la quasi immunité vis-à-vis des plasmodies des hématies dites granuleuses.

des tubes aseptiques et sans corps étrangers, en verre neutre, de 1 millimètre de diamètre intérieur, maintenus à IS^S, dans lesquels on a aspiré par capillarité, et sur une hauteur de colonne de 1 centimètre environ, du sang de l’oreille ou du doigt provenant de piqûres (la seconde goutte pour chaque tube ; les tubes contenant les gouttes suivantes servant de témoins); l’apparition, entre les tranches de section du cylindre hématique, d'un tin filament do fibrine, rappelant un fil de macaroni, représente, en pratique, le début de la coagulation du sang.

Depuis 1899, nous ne cessons de perfectionner ce procédé. Nous ne nous

vérifiera égaiement. Il en est de fait ainsi quand le taux des globules blancs atteint et dépasse 100.000 par millimètre cube. On conçoit aussi a priori que dans les leucocytoses d’un très haut degré même constatation puisse à la rigueur être faite. Je dois dire cependant que malgré de très nombreux examens nous n’avons observé ce phénomène que dans la leucémie et dans une hyperleucocytose de néoplasique dépassant 100.000. C’est donc là un procédé de diagnostic utilisable en pratique.

Nous avons homogénisé par agitation des crachats muco-puruients, nummulaires, de tuberculeux à la période cavitaire. Ces crachats, de réaction alcaline, ayant un point de congélation de — 0,S0, contenaient plus de 20 bacilles de Koch par champ de vision et d’assez nombreux microbes d’association, principalement des streptocoques. On en mélangeait 1/4 de centimètre cube à S centimètres cubes des liquides-réactifs. Au bout de quarante-huit heures on traitait des particules du mélange par le procédé de coloration de Ziehl-Neelsen.

"Voici, sous forme de conclusion, les résultats de ces recherches :

L’action de l’eau distillée, de l’eau bouillante, de l’eau d’aniline, de l’eau oxygénée à 12 vol., de la solution iodo-iodurée de Lugol, de la glycérine, de l’alcool, de l’éther, du chloroforme, du xylol, de la benzine, des acides acétique, borique et picrique (à saturation dans l’eau), phénique et salicylique’ (à saturation dans l’alcool), de l’ammoniaque, de la lessive de soude, du carbonate, du sulfite de soude, de l’iodure de potassium, des sulfates d’alumine et de cuivre, du chlorure de baryum (à saturation dans l’eau), du bichlorure et du cyanure de mercure (à 1/100 et à 1/1000), des métanges de créoline et de liqueur de Van Swieten, des réactifs d’Esbach et de Flemming, ne nuit nullement à la coloration des bacilles de Koch par le procédé de Ziehl-Neelsen.

Parmi ces substances, il en est qui sont employées journellement par les malades pour désinfecter les expectorations dans les crachoirs — tels l’acide acétique, l’eau d’aniliue, l’alcool, les sels de mercure et de cuivre. Il n’est pas indifférent de savoir qu’elles ne gênent en rien pour la recherche des bacilles de Koch qui y baignent.

Beaucoup sont d’un usage journalier dans les laboratoires pour la fixation, la déshydratation, l’éclaircissement des frottis et des coupes : tels l’alcool, l’éther, le

acUoB s’exerçant pendant àenx jours), l’acétate de plomb (à saturation dans l’eau), les azotates d’argent et de baryum'(1/100), l’alcool chlorhydrique (2/100), le chromato (4 p'. 100) et le bichromate do potasse (à saturation dans l’eau), la créôline, l’essence de térébenthine ; le nitro-prussiate de soude et le - lerricyauure de potassium’ (à saturation dans l’eau), la solution alcoolique de phtaiéine du phénol, les réactifs .acéto-picriquc, de Fehling, de Kleinenberg, de ïanret, d'Uttelmann, la teinture d'iode. Ainsi l’acide chromique, les chromâtes et les bichromates, le formol, l’acide formique, l'aleool chlorhydrique, le réactif de Kleinenberg, les fixateurs à teneur

La créôline, le lysol, si communément employés, pour désinfecter les crachats, nuisent aussi à cette recherche.

Ajoutons en terminant que dans ce troisième groupe de substances gênantes,

et le nitroprussiato de soude, au contact desquels les crachats traités par le procédé do Zieht-Seelsen laissent précipiter des cristaux en bâtonnets tins, colorés en rouge, qui simulent-des bacilles de Koch. La suite de ces recherches figure dans lotra-

réparliUon dans un plasma rolalivement abondant do globules inégaux, diminués de nombre, avec présence de formes géantes d’hématies.

Nous précisons les précautions il prendre pour éviter les pseudo-lisérés et nous différencions le halo régulier des taches do sang de l’anémie pernicieuse dos petits lisérés incomplets des autres anémies graves.