DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE PAR LA CULTURE

Dans la pratique courante du diagnostic clinique, on a bien rarement occasion de recourir à la culture du bacille tuberculeux et, si l'examen direct ne décèle pas le microbe, on doit recourir à l'inoculation du liquide ou du sédiment sous la peau du cobaye. Dans quelques cas cependant l'ensemencement du produit suspect sur pomme de terre glycérinée ou mieux sur sang gélosé permettra d'obtenir des cultures de bacilles tuberculeux. Dans deux cas de pleurésie franche, le liquide pleural ensemencé sur sang gélosé a donné des colonies tuberculeuses, alors que dans un de ces cas l'inoculation au cobaye était restée sans résultats; dans d'autres expériences par contre les ensemencements sont restés stériles. Le liquide citrin, recueilli par ponction lombaire, dans le cas de méningite tuberculeuse, a toujours donné des cultures positives sur le sang gélosé (Bezançon et Griffon) (3).

(*) Arloing, Leçons sur ht tuberculose.

(2) Couumo.nt et Denis. Tub. pulm. à bacilles atténués. Th. de Lyon, 1804. (5) Bezançox et Griffon, Soc. de Mol., 4 fév. et 24 juin 1899 ; Soc. méd. des Hôpitaux, 24 mars 1899.

[F. WIDAL et F BEZANÇON ]

SÉRODIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE

Les méthodes directes de recherche du bacille tuberculeux, telles que l'examen microscopique et l'inoculation aux animaux, ne sont le plus souvent d'aucun secours pour le diagnostic de la tuberculose viscérale au début, c'est-à-dire précisément à la période où la clinique est insuffisante par ses seules ressources à étayer un diagnostic précoce, si nécessaire cependant au point de vue thérapeutique. Après la découverte du sérodiagnostic de la fièvre typhoïde, il était donc logique d'appliquer la même méthode au diagnostic de la tuberculose et d'en tenter le sérodiagnostic (Arloing et P. Courmont).

Nécessité d'avoir des cultures homogènes. — Le bacille tuberculeux se présentant dans les cultures liquides ou solides sous forme de voile ou d'écaillés constituées par des bacilles solidement agglomérés, la technique usuelle du sérodiagnostic de la fièvre typhoïde n'est pas applicable au diagnostic de la tuberculose. La condition préalable est, comme l'a montré M. Arloing, d'obtenir des cultures liquides homogènes de bacilles tuberculeux.

Pour obtenir des cultures homogènes do bacille de Koch en milieu liquide, M. Arloing (2) est parti de cultures sur pomme de terre, dont les colonies, rapprochées, luxuriantes, ont un aspect gras et brillant.

M. Arloing repique ensuite les colonies qui se trouvent au fond du tube dans des ballons contenant du bouillon glycérine, mais au lieu d'apporter la semence à la surface en la laissant flotter, de façon à obtenir un voile, il l'immerge dans le liquide et a soin chaque jour d'agiter la culture pour combattre la tendance qu'a le bacille tuberculeux à végéter en grumeaux ; dans ces conditions, en effet, le bacille se développe comme le bacille d'Eberth ou le staphylocoque dans la masse liquide, qu'il trouble uniformément.

L'examen sans coloration d'une goutte de cette culture montre des bâtonnets isolés les uns des autres, ayant la forme du bacille tuberculeux et jouissant d'une certaine mobilité ; l'examen après coloration par la méthode de Ziehl décèle les réactions colorantes propres au bacille tuberculeux (5), l'inoculation aux animaux détermine enfin la production de

(1) Arloing et P. Courmont, Gaz. des hôp., 1901. Presse médicale, 1er sept. 1900.

(2) Congrès de Montpellier, 1898: Comptes rendus de l'Acad. des sciences, 13 mai et 19 sept. 1898.

(5) Le bacille peut d'ailleurs perdre la propriété de se colorer par la méthode de Ziehl, comme l'a observé Arloing, sur des cultures jeunes de dixième ou de vingtième génération provenant d'une culture sur pomme de terre, mais dont les générations successives ont été très rapprochées les unes des autres. C'est là un fait qu'avait déjà signalé Ferran (de Barcelone) et que M. Marmorek a observé sur des cultures tuberculeuses développées en voile à la surface du bouillon; si l'on examine en effet la mince pellicule qui se forme à la périphérie de l'écaillé qui a servi à l'ensemencement, on voit que les bacilles qui constituent la pellicule ne se colorent pas par la méthode de Ziehl, mais prennent les matières colorantes à la manière des autres bactéries.

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lésions tuberculeuses, comparables à celles que Ton obtient après inoculation de produits tuberculeux de virulence atténuée.

Pratiquement, comme l'ont montré MM. Àrloing et P. Courmont, si Ton veut avoir une culture homogène, on emploiera la technique suivante:

Le milieu le plus favorable est le bouillon de bœuf, peptoné à 1 pour 100 et glycériné à 6 pour 100; ce bouillon est introduit dans des ballons à fond plat et de forme cylindrique (préférables aux ballons sphéroïdaux usuels, parce que les parois abruptes apportent un certain obstacle à l'ascension des colonies et à la formation du voile).

Le bouillon est ensemencé avec une culture homogène âgée d'un mois environ, la quantité de semence apportée dans le bouillon doit être, dans chaque ensemencement, sensiblement égale. Le ballon est mis à l'étuve à 58°, 59°. La culture doit être agitée chaque jour. Les cultures âgées de <S à 10 jours conviennent de préférence pour la recherche de la réaction ; avec des cultures datant de plus de 1 5 joui s, l'adjonction de sérum agglutinant n'éclaircit qu'incomplètement la culture, à moins que le pouvoir agglutinatif ne soit très puissant. M. Courmont recommande de se servir de cultures d'une certaine viscosité, moussant bien par mélange avec l'air. Ces cultures doivent présenter un trouble tel que l'on voit difficilement par transparence un cercle tracé à l'encre sur le fond du flacon. On peut garder pendant une ou deux semaines une culture propice à l'étude du sérodiagnostic, en la retirant de l'étuve ou bien en la fixant par le formol.

Pour faire des recherches satisfaisantes sur l'agglutination des précédentes cultures par le sérum des tuberculeux, il est indispensable, d'après MM. Arloing et Courmont, d'observer rigoureusement un certain nombre de précautions, jugées inutiles pour le sérodiagnostic de la fièvre typhoïde. Comme pour le sérodiagnostic de la lièvre typhoïde, il faut prélever le liquide à la partie supérieure du ballon, attendu que le liquide du fond renferme presque toujours des amas spontanés ; il faut aussi vérifier que les bacilles qu'il renferme sont bien isolés et légèrement mobiles. L'agglutination doit être recherchée à l'œil nu et au microscope.

Agglutination à l'œil nu; c'est d'après MM. Arloing et Courmont le procédé de choix :

Pour éviter le gaspillage des cultures, on se sert non de tubes à essai mais de petits tubes stérilisés de 5 à 6 centimètres de longueur et d'un petit diamètre. Ces tubes sont introduits dans un petit porte-tube disposé de telle façon que les tubes soient inclinés à 45° et non verticalement ; on se sert en général de quatre tubes, pour la recherche du sérodiagnostic : dans le premier qui servira de témoin on mettra quelques gouttes de culture sans adjonction de sérum, dans les trois autres, un mélange de sérum et de culture homogène à des titres différents à 1/5, à 1/10, à l/c20, c'est-àdire une goutte de sérum pour 4, pour 9, pour 19 gouttes de culture.

L'agglutination ne se produit pas en général instantanément et n'apparaît qu'au bout d'un temps variable selon les sérums, au bout de 1 à 5 heures en général.

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DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES

Lorsque la réaction n'est encore qu'ébauchée, on voit la paroi inférieure du tube comme striée de petits grains, le liquide surnageant reste louche ; lorsque la réaction est complète, le liquide est clair, et l'on voit sur la paroi inférieure un dépôt constitué par des flocons peu adhérents ou par une couche lamelleuse.

Pour apprécier la clarification, il est bon de regarder les tubes à jour frisant sur un fond noir. La clarification et le dépôt ne doivent jamais se produire dans le tube témoin.

L'examen microscopique doit toujours contrôler les résultats donnés par l'examen macroscopique. On prélève, avec une pipette, une goutte du dépôt que Ton dispose entre lame et lamelle et que l'on examine à l'état frais, sans fixation ni coloration, avec l'objectif à sec et en diaphragmant. Les bacilles, au lieu d'être isolés et légèrement mobiles, comme dans le tube témoin, sont agglutinés.

MM. Arloing et Courmont insistent beaucoup sur la délicatesse de la technique, qui est beaucoup plus difficile à pratiquer que le "sérodiagnostic de la fièvre typhoïde.

Une culture trop jeune sera ou bien trop pauvre en bacilles, ou bien trop facilement agglutinable ; une culture trop âgée sera souvent trop « dure » et donnera à tort des résultats négatifs.

Pour remédier à cette difficulté, il faut, chaque fois que l'on essaie le pouvoir agglutinant d'un sérum, faire en même temps la réaction sur la même culture, avec un sérum étalon, c'est-à-dire avec un sérum fortement agglutinant dont le pouvoir est connu d'avance, sérum d'animal (chien) tubereulisé, sérosité de pleurésie ou de péritonite tuberculeuse.

Recherches expérimentales. — Le sérum sanguin du cobaye ne présente à l'état normal aucun pouvoir agglutinant; par contre, le sérum de bœuf agglutine au 1/5, et celui du chien dépasse habituellement 1/5 et peut même atteindre 1/10 et 1/20.

Après inoculation de tuberculose à ces divers animaux, le sérum acquiert la propriété agglutinante à des degrés divers, et semble-t-il en raison directe de la capacité agglutinante du sérum normal; c'est ainsi que le sérum de cobaye n'acquiert jamais qu'un faible pouvoir agglutinatif autour de 1/10 et dépassant très rarement 1/20, tandis que le sérum de chien peut s'élever à 1 pour 200 ou 1 pour 600.

Chez les divers animaux, le pouvoir agglutinant ne se développe dans le sérum que si l'on inocule un virus atténué ; ainsi le sérum de cobaye infecté par une matière tuberculeuse très virulente, crachats, produits tuberculeux, ne possède pas de pouvoir agglutinant, ou n'agglutine le bacille qu'au 1/5 ou au 1/10. Ce n'est que chez les cobayes présentant une tuberculose à marche chronique, que le pouvoir agglutinant se développe et encore faiblement.

Chez le lapin, dont le sérum à l'état normal agglutine souvent très légèrement le bacille de Koch, le pouvoir agglutinant apparaît après ino-

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culation de produits tuberculeux, mais, comme chez le cobaye, on n'observe d'agglutination forte, 1 pour 80, qu'après inoculation de tuberculose atténuée.

Chez le chien, l'inoculation intra-pleurale de tuberculose atténuée détermine d'une façon constante un pouvoir agglutinatif qui peut atteindre 1 pour 600; l'inoculation de tuberculose virulente n'augmente pas l'intensité du pouvoir agglutinatif normal.

Chez la chèvre et chez le bœuf, qui ne jouissent pas d'une grande réceptivité vis-à-vis du virus tuberculeux expérimental, l'inoculation de tuberculose, même virulente pour le lapin, peu virulente pour ces animaux, détermine cependant l'apparition d'un pouvoir agglutinant, qui dépasse rarement 1/50, 1/80 pour la chèvre, 1/20 pour le bœuf.

Recherches cliniques. — Chez l'homme sain, le sérum n'agglutine pas en général le bacille de la tuberculose; cependant, sur des sujets sains en apparence, MM. Arloing et P. Courmont ont obtenu 11 fois une réaction positive, et 45 fois sur 150 individus atteints de maladies autres que la tuberculose. La plupart de ces agglutinations positives ressortissent évidemment à des cas de tuberculose latente. MM. Arloing et Courmont disent cependant avoir observé une réaction positive chez deux individus, à l'autopsie desquels on n'a pas trouvé de lésion tuberculeuse.

Chez les tuberculeux pris au hasard, la réaction a été trouvée positive 168 fois sur 191 cas, négative dans 25 cas. Les cas h séroréaction négative appartiennent presque tous à des tuberculoses graves (phtisie galopante, cavitaire, etc.). Les tuberculoses discrètes et curables, pleurésies, lésions minimes des sommets, tuberculoses chirurgicales, donnent presque toujours un sérodiagnostic positif. Dans certains cas, on voit le pouvoir agglutinant s'atténuer progressivement à mesure que s'aggrave la maladie et même disparaître complètement. Ces faits sont à rapprocher de faits analogues observés a propos du diagnostic par la tuberculine, la réaction faisant défaut chez les phtisiques avancés. Chez l'homme tuberculeux, le pouvoir agglutinant s'élève rarement au-dessus de 1 pour 20, généralement il oscille autour de 1 pour 10.

M. Courmont a montré d'autre part que les sérosités pathologiques, telles que les épanchements de la plèvre ou du péritoine, présentaient un pouvoir agglutinatif de 1/10 à 1/20 lorsqu'ils étaient dus au développement des bacilles tuberculeux, tandis que les épanchements non tuberculeux ne possèdent aucun pouvoir agglutinant. MM. Widal et Ravaut (l) ont obtenu des résultats analogues ; ayant recherché la séroréaction dans 24 liquides pleuraux séro-fibrincux, ils ont trouvé la réaction négative dans 11 cas de pleurésie non tuberculeuse, et 9 fois positive sur 11 pleurésies tuberculeuses, 1 fois négative, 1 fois douteuse; la réaction enfin s'est montrée négative dans 2 cas de pleurésie de phtisiques. La sérosité pleurale, dans ces divers cas, possède un pouvoir agglutinatif plus marqué

(M Widal et Ravaut, Congrès de la tuberculose. Londres, août 1901.

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que le sérum du sang, contrairement à ce qui s'observe dans la lièvre typhoïde (Widal et Sicard), où le pouvoir agglutinatif le plus élevé s'observe toujours dans le sang. Il semble donc que dans la tuberculose des séreuses la substance agglutinante spécifique diffuse de la séreuse à la circulation générale.

Valeur diagnostique de la séroréaction. — Les faits avancés par MM. Arloing et Courmont ont été confirmés par les travaux de Mongour, Rothamel, Buard, Mosny en France, par ceux de Benedix à Berlin.

Tout récemment, Koch a proposé un nouveau procédé de sérodiagnostic en se servant soit de colonies tuberculeuses développées sous forme de voile à la surface du bouillon, soit de cultures desséchées; dans les deux cas, les cultures sont broyées et réduites en poussière et diluées dans une solution d'acide phonique à 5 pour 100 et de sel à 0,85 pour 100. Les difficultés inhérentes aux manipulations empêchent le procédé de Koch d'entrer dans la pratique et l'on ne peut mettre en parallèle les résultats d'ailleurs défavorables qu'il a obtenus avec ceux de MM. Arloing et Courmont.

Diagnostic de la tuberculose par la réaction de fixation. — Widal et L. Le Sourd (') ont essayé d'appliquer la réaction de fixation au diagnostic de la tuberculose ; ils se sont servis de bacilles d' Arloing et Courmont débarrassés soigneusement par centrifugation du bouillon glycérine dans lequel ils se sont développés, la glycérine jouissant de propriétés hémolysantes. La technique est la même que pour l'hémolysodiagnostic de la fièvre typhoïde, que nous avons décrit en détail au chapitre du diagnostic de la fièvre typhoïde.

Le sérum des tuberculeux présentait la réaction de fixation dans 17 cas sur 21 dans une première série; dans 16 cas sur 16 dans une seconde; dans 6 cas sur 7 dans une troisième ; le sérum de sujets ne présentant pas les signes extérieurs de la tuberculose n'a donné la réaction que 4 fois sur 21, o fois sur 16 dans la seconde, 2 fois sur 7.

La réaction peut s'observer quoique avec moins de netteté et moins de régularité avec les bacilles morts (Widal et Le Sourd) et aussi comme l'ont montré MM. Camus et Pagniez (2) avec la tuberculine : l'adjonction de celle-ci au sérum tuberculeux chauffé étant capable dans la suite de fixer l'alexine d'un sérum humain. La réaction n'est d'ailleurs pas constante et peut être observée chez des individus sains en apparence.

On ne saurait trop insister sur les difficultés qui entourent la recherche de la réaction de fixation chez les tuberculeux; la réaction est très complexe et exige pour se réaliser la mise en jeu d'éléments variables d'une expérience à l'autre ; elle exige la connivence d'éléments provenant de quatre êtres vivants : de celui qui fournit le sérum à éprouver, de l'animal qui fournit le sérum alexique, de celui qui fournit les globules rouges, de

(4) Widal et L. Le Sourd, Soc. méd. des hop., 5 juillet 190 1 - (-) Camus et Pagniez. Soc. de biol., 6 juillet 1901, p. 734.